En esta presentación podrás observar la medición de efectos a nivel de transcripción

1. “Estudio Argumentativo de la Medición de Efectos a Nivel de Transcripción Genética
y Biotransformación Xenobiótica - Principios y métodos
Escrito Por El Autor François Gagné”
ALUMNOS:
Edilberto, Gastolomendo Malimba
Willy Overly, Barboza Estela
Wilson Omar Cotrina Cabada
Docente: FERNANDO CAMILO JOAQUIN RODRIGUEZ
Bioquímica y Toxicología

2. INTRODUCCIÓN
• Las células bacterianas son organismos procariotas que prosperan
en el medio ambiente. En donde la nutrición está ligado al medio en
el que vive, el cual sufre cambios enormes y rápidos, dando como
consecuencia al desarrollo de una fuerte adaptabilidad a los
frecuentes cambios en el medio que viven.

3. Objetivos
1. General.
 Estudio Argumentativo de la Medición de Efectos a Nivel de Transcripción Genética y
Biotransformación Xenobiótica.
1. Específicos.
 Presentar un protocolo para analizar la expresión genética relativa de las transcripciones
implicadas en el estrés tóxico en los hepatocitos de la trucha arco iris utilizando la química del
colorante SYBR Green I.
 Analizar técnicas bioquímicas genéricas y técnicas de alto rendimiento muy específicas, como la
reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa y los inmunoensayos ligados a enzimas.
 Dar a conocer técnicas que son accesibles para todos los tamaños y presupuestos de laboratorio.
Así iniciar rápidamente ensayos bioquímicos en un laboratorio de ecotoxicología.
 Proporcionar pautas en la aplicación de marcadores bioquímicos en estudios de investigación y
monitoreo que brindarán información sobre los aspectos de control y garantía de calidad de los
estudios que utilizan biomarcadores.

4. Justificación.
• En general, se reconoce que las interacciones fundamentales ocurren a nivel
bioquímico en las células, siempre que esta interacción sea la base para iniciar
eventos tóxicos en los organismos.
• El análisis de la expresión y regulación génica también puede ser útil para
seleccionar compuestos para la identificación de peligros, rastrear las respuestas
celulares a diferentes dosis y predecir la variabilidad individual y la sensibilidad a
los tóxicos.

5. CAPÌTULO 4

6. Medición de efectos a nivel de transcripción
genética.
• La metodología de reacción en cadena de la polimerasa PCR es una de
las técnicas más poderosas y ampliamente aplicadas en biología
molecular. En teoría, la PCR amplifica el ADN objetivo
exponencialmente, duplicando el número de ADN objetivo con cada
ciclo.
Desnaturalización Recocido Extensión

7. Materiales.
• Reactivos.
• Oligonucleótidos
• Kit de extracción de ARN comercial
• Agua libre de nucleasas
• Enzima Hot Start, MgCl2, y SYBR Green I
• Síntesis de ADNc
• Etanol grado biología molecular (70 y 95%).

8. Equipo
• Software y herramientas de diseño de imprimaciones
• Software de análisis especializado
• Sistema automatizado basado en microfluidos
• Espectrofotómetro

9. PROCEDIMIENTO
Elección de la química de detección
• Hay varias químicas de detección fluorescente para elegir para
monitorear la amplificación en qPCR.
Diseño de imprimación
Los ensayos de qPCR para varios objetivos se pueden tomar de
la literatura o en bases de datos, dependiendo de la especie.
Selección de la secuencia de nucleótidos objetivo
Los datos de RT-qPCR se normalizan más comúnmente
utilizando genes de referencia. Puede ocurrir
polimorfismo, mutación o error que resulte en la
publicación de diferentes secuencias.

10. Preparación de la plantilla de ácido nucleico
Las ARNasas pueden degradar fácilmente el ARN durante
la recolección de muestras, la extracción, la purificación y
el almacenamiento de ARN.
Extracción de ARN de células cultivadas
Después del período de exposición, aspire
completamente el medio de cultivo / exposición celular y
rompa los hepatocitos agregando 350 µL de tampón de
lisis directamente a los pocillos.
Evaluación de la calidad del ARN
El NanoDrop es en realidad el método más utilizado, ya
que nos permite evaluar rápidamente la concentración y
pureza del ARN en una muestra muy pequeña midiendo
la relación A260 nm / 280 nm .

11. Análisis de integridad del ARN
La integridad del ARN es un elemento crítico en un análisis de expresión génica. Los sistemas
automatizados basados en microfluidos como la estación de electroforesis automatizada Experion
y el bioanalizador Agilent se han convertido en el método de elección para la evaluación de la
integridad del ARN, lo que permite una determinación rápida de la calidad del ARN y la estimación
de la cantidad utilizando un volumen muy pequeño de muestra en un chip.

12. Cebadores RT Características
Cebadores aleatorios
Permite RT de toda la población de ARN (ARNm, ARNr, ARNt, etc.)
Se puede utilizar cuando la plantilla tiene una estructura secundaria extensa:
Produce el mayor rendimiento (pero favorece el ARNr)
Los mensajes de baja abundancia pueden estar infrarrepresentados
Conduce a ADNc cortos de longitud parcial
El ADNc producido se puede utilizar para muchos objetivos diferentes.
Cebadores oligo-dT
Transcribe de forma inversa selectivamente los ARNm a partir de la cola poli-A.
Limita la cantidad de ARNr (p. Ej., No transcribirá de forma inversa ARNr 18S)
50 el extremo del ARNm puede estar subrepresentado.
Puede que no se transcriba de manera eficiente el ARN parcialmente
degradado (si se pierde cola poli-A intacta)
El ADNc producido se puede utilizar para muchos objetivos diferentes.
Cebadores específicos
de genes
Los cebadores permiten RT de un objetivo específico.
El ADNc producido no se puede utilizar para analizar otros genes.
Tabla 1. Tipos de
cebadores RT para síntesis
de ADNc

13. Optimización del ensayo
Validación del cebador.
Para cada par de cebadores, pruebe la amplificación específica de la plantilla
utilizando una concentración de cebador única (por ejemplo, 300 nM), 5-10 ng de
ADNc y las mismas condiciones de ciclo.

14. Tabla 2 Ejemplo de
mezcla maestra de
reacción de qPCR
Componente Volumen por reacción
de 25 μL
Concentración
final
2x SYBR Mastermix verde
10 μM de Cebador directo
10 μM de Cebador inverso
Agua libre de ARNasa
TOTAL
12.5
0.75
0.75
6
20 μL
1 x
300 nM
300 nM
La mayoría de las qPCR se realizan en volúmenes de reacción
de 10 - 25 μl. Mantenga constantes los volúmenes de reacción
en todas las muestras que deben compararse
Determinación de transcripciones genéticas por qPCR
Si para un objetivo determinado no se pueden analizar todas las muestras experimentales en la misma
placa, se puede utilizar un control positivo de ADNc como calibrador interplaca

15. CUANTIFICACIÓN RELATIVA AL ANÁLISIS DE DATOS
CON NORMALIZACIÓN DEL GEN DE REFERENCIA.
La cuantificación relativa es el método más común de análisis de expresión
génica y se expresa como el cambio de veces en la expresión génica en
relación con un control no tratado normalizado con uno o varios genes de
referencia.

16. Tabla 3. Guía de resolución de problemas para la realización
de experimentos de qPCR para la expresión génica.
Problemas Causa posible Comentarios y sugerencias
Bajo rendimiento de ARN
 Demasiado material de partida
 Disrupción y homogeneización insuficientes
 Eliminación incompleta del medio de cultivo celular
 Reducir la cantidad de material de partida.
 Aumente el volumen del tampón de lisis, reduzca la cantidad de material de
partida y aumente el tiempo de homogeneización.
 Asegúrese de eliminar completamente el medio de cultivo.
Relación baja A260 / A280
 El pH de la solución es ácido La absorbancia está
fuera
 el rango lineal
 Disuelva la muestra en TE en lugar de agua. Diluir la muestra para llevar la
absorbancia a lineal.
 distancia.
ARN degradado
 manejo inapropiado de material de partida.
 Contaminación por ARNasa.
 Asegúrese de que las muestras estén debidamente estabilizadas
 y almacenado. Congele rápidamente en nitrógeno líquido o estabilícelo en ARN
inmediatamente después de la cosecha. Almacenar a 280 C. Para muestras de
cultivo celular, minimice los pasos de lavado. Realice el procedimiento de
extracción rápidamente.
 Utilice consumibles y reactivos sin ARNasa. Tenga cuidado de no introducir
RNasas provenientes de la superficie de la piel o del equipo de laboratorio, p.
Ej. Cámbiese los guantes con frecuencia (cada vez que toque una superficie
potencialmente contaminada), mantenga los tubos cerrados siempre que sea
posible.
Sin amplificación (o Cq muy alto)
 Error de pipeteo / falta de reactivo durante la
configuración de qPCR
 Paso de detección incorrecto
 Enzima no activada
 Temperatura de recocido inadecuada
 Tiempos de recocido / extensión insuficientes.
 La concentración de MgCl2 no es óptima
 La plantilla contiene inhibidores
 Diseño de imprimación deficiente.
 Compruebe la concentración y las condiciones de almacenamiento de los
reactivos y repita el experimento.
 Asegúrese de que la detección de fluorescencia esté activada y tenga lugar en
el paso de extensión.
 Asegúrese de que se realizó la activación inicial adecuada a 95 ° C.
 Tenga la temperatura de recocido óptima (realice un gradiente de temperatura
de recocido (incremento de 2° C).
 Verifique la longitud del amplicón en gel de agarosa. Aumente el tiempo de
extensión si es necesario (hasta 30 segundos).
 Aumente (hasta 6 mM) la concentración de MgCl2 en incrementos de 0,5 mM
para encontrar la concentración óptima.
 Diluir la plantilla (1:10 1: 100) y repetir el ensayo.
 Prueba con otro par de cebadores.

17. Tabla 4. Guía de resolución de problemas para la realización
de experimentos de qPCR para expresión génica— (cont.)
Problemas Causa posible Comentarios y sugerencias
Amplificación en NTC  Contaminación de reactivos
 Contaminación durante la instalación de la
placa.
 Examine la curva de fusión para confirmar la presencia de
dímeros del cebador. Si se confirman los dímeros del
cebador, aumente la temperatura de hibridación, disminuya
la concentración del cebador y rediseñe el ensayo con un
nuevo par de cebadores.
 Deseche los componentes de la reacción y repita con nuevos
reactivos (o nuevas alícuotas).
 Repita usando precauciones adicionales. Utilice puntas de
barrera de filtro y cambie las puntas entre todas las muestras
y reactivos.
Amplificación en control sin RT  Contaminación de gDNA  Agregue un tratamiento con DNasa I a la muestra de ARN.
Diseñar cebadores para abarcar los límites del exón.
Mala linealidad de la serie de
diluciones de ADNc en la curva
estándar (R2<0,98)
 Cantidad de plantilla demasiado alta /
demasiado baja
 Los componentes de la reacción no se mezclan
correctamente
 Quite los puntos en el extremo de la curva, disminuya /
aumente la cantidad inicial y repita la serie de diluciones.
 Repita la dilución en serie y asegúrese de que todos los
componentes de la reacción se mezclen correctamente y que
las diluciones en serie se agiten (15 s).
Múltiples picos en la curva de
fusión
 Dímeros de cebadores y amplificación
inespecífica
 Subdominio rico en AT
 Aumente la temperatura de hibridación, disminuya la
concentración de MgCl2 y rediseñe el ensayo con un nuevo
par de cebadores.
 El hombro en la curva de fusión puede indicar un
subdominio rico en AT en lugar de una amplificación
inespecífica. Ejecute el amplicón en gel de agarosa para
verificar la especificidad.
Alta variabilidad entre réplicas  Pipeteo de suelo Evaporación

18. CONCLUSIONES

19. GRACIAS POR SU
ATENCIÓN