La qPCR es una técnica que permite detectar y cuantificar ADN de forma cuantitativa y en tiempo real mediante el uso de reporteros fluorescentes. Se utiliza para detectar granulovirus en diferentes muestras como larvas, suelo y bioplaguicidas con el objetivo de desarrollar bioplaguicidas para el control biológico de plagas agrícolas. La metodología consiste en diseñar cebadores específicos para el gen de la granulina altamente conservado en granulovirus y utilizar una sonda Taqman para la

1. PCR EN TIEMPO REAL
(qPCR)
Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional De Ciencias Biológicas
Licenciatura En Biología
UDA Métodos Moleculares
5OV1
ERIKA MAQUEDA DÍAZ
GRACIELA LORELEY IRAIS LEÓN MUÑOZ

2. ¿QUÉ ES LA qPCR?
• Es una técnica de amplificación de ADN
• PCR cuantitativa / PCR en tiempo real
– Es cuantitativa porque permite cuantificar la cantidad de ADN en la
muestra
– El término en tiempo real se refiere a la detección de los productos
en cada ciclo de la reacción
• Su objetivo es detectar y cuantificar las secuencias
específicas de ácidos nucleicos mediante el uso de
reporteros fluorescentes en la reacción
• Higuchi y colaboradores (1992)

3. FUNDAMENTO DE LA TÉCNICA
• Se basa en la PCR punto final, pero cambia el modo de detectar y
analizar los productos de la amplificación. El marcaje con
compuestos fluorescentes permite la recopilación de datos a
medida que la PCR avanza.
ADN
Primers/Cebadores
Master mix
• dNTP‘s
• Taq Polimerasa
• Sistema reportero de fluorescencia
• Mg+
• Buffer
Agua

4. 3) EXTENSIÓN
Síntesis de cadenas gracias a la
polimerasa Temperatura: 72°
2) HIBRIDACIÓN
Unión de cebadores a cadenas
complementarias
Temperatura: 50-60°
1) DESNATURALIZACIÓN
Separación de las cadenas de ADN Temperatura: 95°C

5. Sistemas de monitoreo de reporteros
fluorescentes
No específicos
Moléculas afines a ADN
de doble cadena
Específicos
Transferencia de energía
de resonancia
fluorescente

6. Métodos No Específicos
•Se usan moléculas con afinidad por el ADN de doble cadena,
que al oxidarse generan fluorescencia
• Etapa de extensión
• SBYR Green
• Fluorescencia 
numero de copias de
ADN de doble cadena
• Unión al surco menor
de ADN

7. Métodos específicos
• Siguen el principio conocido como «transferencia de
energía de resonancia fluorescente» (FRET, por sus siglas
en inglés) para generar la señal; este método consiste en
transferir energía desde un donador o reportero
fluorescente a un aceptor.

8. Métodos específicos
Sondas fluorescentes
de oligonucleótidos
etiquetados con un
reportero fluorescente
y un «quencher»
Hibridación  cambios conformacionales  actividad exonucleasa 5’-3’ de la
Taq polimerasa  ruptura de la unión Liberación de fluorescencia

9. Sondas Molecular Beacon
Secuencias repetidas invertidas Estructura en forma de horquilla 
Complementariedad con blanco  Separación de reportero y quecher 
Fluorescencia

10. •
TECNOLOGÍA INCLUIDA
EN TERMOCICLADORES
PERMITE:
Excitar al reportero
Lamparas de luz, LED,
Laser
Captura de la señal de
fluorescencia
Fotodetector
Análisis cuantitativo de
la reacción
Software
Análisis

11. AnálisisEste software genera una serie de gráficas en donde se
muestran todos los datos necesarios para conocer si la
reacción fue exitosa

12. AnálisisEste software genera una serie de gráficas en donde se
muestran todos los datos necesarios para conocer si la
reacción fue exitosa

13. Tipos de cuantificación
Absoluta
Número exacto de copias de
amplificadas
Relativa
Cambios en expresión de
genes

14. PCR Tiempo Real qPCR PCR Punto Final
Producto de amplificación es monitoreado
conforme transcurre la reacción
NO es posible detectar en tiempo real ni
cuantificar la secuencia blanco
Sin manipulación de un gel con agarosa Con manipulación con gel de agarosa
Nomenclatura: utilizamos ADN genómico
entonces hablamos de una qPCR
(quantitative PCR)
ADNc y luego hacemos la PCR, nos
referimos a una RT-qPCR
Mas Sensible para detectar y cuantificar los
ácidos nucleicos
Sensible
Aplicaciones usadas es para cuantifi car
cambios muy pequeños en la expresión
génica mediante la detección de los niveles
del ARNm procedente de células o tejidos.
La cantidad de ARNm que puede detectar la
reacción puede ser a partir de
concentraciones bajas
Mayor concentración
Ingredientes químicos son los mismo =

15. Aplicaciones
• Diagnostico = Enfermedades:
• Usos microbiológicos=
• Fitopatogenos: Producción de
propágalos vegetales libres de
patógenos=
1) Infecciosas
2) cáncer
3) Anormalias
genética
1) Seguridad y deterioro
de alimentos
2) calidad de agua
Agricultura

16. PCR en tiempo real: una
metodología útil para la detección
y cuantificación de granulovirus

17. Introducción
Virus entomopatógenos, uno de
los grupos más estudiados es la
familia Baculoviridae, la cual se
encuentra dividida en 4 géneros.
Alphabaculovirus donde se clasifican Nucleopoliedrovirus (NPV)
Betabaculovirus donde se clasifican Granulovirus (GV)
Ambos patógenos de insectos del orden :
Lepidoptera,Gammabaculovirus y Deltabac
ulovirus que agrupan GV y NPV patógenos
de insectos del orden:
Hymenoptera y Diptera
Baculovirus han sido aislados de : lepidópteros y pocos de dípteros e
himenópteros ,existen 7,600 especies de hospederos descritas para
estos virus

18. Dentro de la estructura de los GVs
Se encuentran los cuerpos de
inclusión (Obs )
La granulina es la proteína
mayoritaria en estos
gránulos y posee un rango
de tamaño entre 26.000 y
28.000 daltons.
Dentro de una matriz de proteína
Contienen los viriones (partículas
infecciosas per os)
Con forma de gránulo
Los protege de factores
medioambientales deletéreos
Codificada por el gen gran (747 pb),
altamente conservado en los genomas de los
GVs, utilizado en estudios filogenéticos

19. Efectividad y el alto
potencial de los GVs
Virus a base de GVs poseen un
estrecho rango de hospederos, es una
estrategia segura para la protección de
otros insectos no blanco y organismos
benéficos
Corporación Colombiana de
Investigación Agropecuaria-
CORPOICA
Desarrolló :
Bioplaguicida a base de un
granulovirus de Tecia
solanivora, formulado como
un concentrado emulsionable
(CE) para el control de la
polilla guatemalteca de la
papa (Tecia
solanivora, Povolny, 1973) en
campo
Este bioplaguicida demostró su potencial
reduciendo la población de larvas en un
96% en experimentos bajo condiciones
controladas en casa malla y 83% en campo

20. Microscopia óptica de
campo oscuro
Pruebas de
reproducción de
síntomas virales
Electroforesis en geles de
poliacrilamida
Espectrometría
Determinación y
cuantificación
de granulovirus
se utilizan varias
metodologías:

21. Objetivo
Diseñar una metodología basada en q-PCR para la
búsqueda de cepas, seguimiento del virus en suelo y
manufactura de un bioplaguicida. Para demostrar
tres ejemplos de posibles aplicaciones de la técnica,
se realizaron tres ensayos de detección, en larvas de
la cría T. solanivora, en el bioplaguicida formulado a
base de este virus y en muestras de suelo con
aplicación del bioplaguicida.

22. Metodología

23. Resultados
Los cebadores=amplificarón un fragmento del gen
de granulina de 137 pb = Obteniendo amplicones
utilizando ADN genómico de granulovirus provenientes de
5 especies diferentes de insectos:
NO se observaron fragmentos de amplificación en
muestras de NPVs de S. ornithogalli, D. sacharallis o S.
frugiperda.
T. Solanivora
P. operculella
E. ello,
T. absoluta
2=S. frugiperda

24. • Todos los aislamientos pertenecientes al género Betabaculovirus se
caracterizan por presentar la proteína mayoritaria granulina en sus cuerpos de
inclusión.
• El gen que codifica esta proteína presenta muy poca variabilidad entre los
granulovirus (Garavaglia et al., 2012), por lo cual la metodología fue capaz de
amplificar muestras de diferentes especies dentro del género.

25. La especificidad de la sonda Taqman se observó en la amplificación por PCR en tiempo real,
donde se utilizaron ADNs de los 9 aislamientos de GVs empleados en la PCR convencional
 Señal de fluorescencia para los aislamientos de GVs
 Señal fue nula para los aislamientos de NPVs.

26.  La desviación estándar (σ) intra e inter-ensayos (para cada ADN patrón)
fue baja y nunca mayor de 1
 Técnica fue reproducible
 La variabilidad entre las repeticiones de una muestra en el sistema
Taqman es muy baja y generalmente se aumenta cuando se trabaja con
concentraciones muy bajas o con amplicones de gran tamaño (superiores
a 150 pb)
 Realizando 3 ensayos de amplificación en diferentes tiempos
 3 réplicas de cada ADN patrón en cada prueba.

27. Cuantificación absoluta del gen gran por PCR en tiempo real
utilizaron diluciones seriadas del ADN plasmídico con un
inserto del gen completo, con las cuales se graficó una
recta estándar o patrón
La recta se
determinó la mínima
dilución en la cual se
observó
amplificación, la cual
correspondió a 1,25
x 105 copias del gen
correspondientes a
0,00064 ng de ADN.

28. Conclusión
El gen de granulina detecta betabaculovirus aislados de diferentes especies de
insectos debido a la alta conservación de este gen dentro del género viral.
Detección y cuantificación de granulovirus en diferentes tipos de muestras,
incluyendo tejido larval, suelo y bioplaguicidas a base de este virus.
Se puede incluir en diferentes etapas del desarrollo de un bioplaguicida a
base de granulovirus
Aislamientos con potencialidad para el control biológico Control de
Calidad del proceso de manufactura del bioplaguicida.

29. • https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotec
nologia/article/view/61514/html
• trivias@donde-ir.com