La PCR (reacción en cadena de la polimerasa) es una técnica que permite amplificar una secuencia de ADN de manera específica y exponencial. Requiere ADN molde, cebadores, dNTPs, ADN polimerasa y un termociclador. La PCR se utiliza en aplicaciones como diagnóstico médico, estudios de evolución y filiación, investigación forense e identificación de genes. Ofrece alta sensibilidad y especificidad, y permite obtener resultados rápidamente a partir de una amplia variedad de muestras bioló

1. GENÉTICA MOLECULAR
Mgtr. Bettina L. Brusés
AÑO 2012

2. ¿QUE ES LA PCR?

3. COMPONENTES DE LA PCR

4. REQUERIMIENTOS DE LA PCR

5. ADN, Templado, Molde o Target
 Cantidad y calidad de la muestra de ADN no necesita
ser alta.
 Una sola célula o un lisado celular con una longitud
promedio de unos pocos cientos de pares de bases son
adecuados para una amplificación exitosa.
 Criterio La muestra contenga al menos una cadena
de ADN intacta que abarque la región que
se va a amplificar.
Las impurezas estén lo suficientemente
diluidas como para no inhibir la reacción

6. Componentes de la PCR
Fresca
Tipo de Muestra Archivo
Antigua

7. Primers, Cebadores o Iniciadores
§ Fragmentos complementarios que se van a unir a una de las dos
cadenas separadas del templado de ADN.
Tamaño: 20- 25 nucleótidos de longitud. Generalmente es entre 18-
30 nt.
Temperatura de Fusión: 50- 65º C.
Contenido GC: 40- 60%.
Debe ser evitada para minimizar la
Auto- complementariedad formación de estructuras secundarias
y los dímeros de primers
Similaridad: Debe tener el 100% de apareamiento con el molde

8. DNA Polimerasa
 1983: Se usó ADN polimerasa de la bacteria E. coli.
Se desactiva a elevadas temperaturas necesarias
para desnaturalizar la doble cadena de ADN.
 1988: Reemplazo por ADN polimerasa de bacteria “termófila”
Thermus aquaticus (Taq). Actúa entre 75- 80º C.
 Concentración Recomendada: entre 1 y 2.5 unidades por 100 ul
de reacción.
 Si la concentración de la enzima es muy alta, se acumulan
productos no específicos, y si es muy baja se formará una
cantidad insuficiente del producto deseado

10. Concentración de Magnesio
Alineamiento de los primers
Temperatura de disociación de las cadenas de ADN
Afecta Especificidad del producto
Formación de dímeros de primers
Actividad y fidelidad de la enzima

11. Desoxinucleótidos trifosfatos, dNTP´s
 dATP, dCTP, dGTP, dTTP.
 Deben ser usados en concentraciones
equivalentes para minimizar errores de
incorporación de bases.

12. Buffers y Sales (KCl)
 Buffer recomendado para PCR: Tris- HCl (pH 8.3-
8.8).
 KCl: arriba de 50 mM inhibe la actividad de la
enzima Taq polimerasa.

14. TERMOCICLADOR DE ADN

16. AMPLIFICACIÓN EXPONENCIAL
DE LA PCR

17. Aplicaciones de la PCR
Estudios de Evolución
Estudios de Identidad Investigación
y Filiación Forense
PCR
Aislamiento de
Diagnóstico de Genes
Enfermedades
Hereditarias y Cáncer
Diagnóstico de
Infecciones

18. Ventajas de la PCR
 Alta especificidad
 Alta sensibilidad
 Rapidez en la obtención de los resultados
 Amplio rango de muestras biológicas
 Se puede estimar la carga parasitaria (cuantitativo)
 La caracterización molecular del amplicón permite
generar información genotípica útil: - Estudios Clínicos
(respuesta a tratamientos, resistencia a drogas).
- Epidemiología
molecular

19. Limitaciones de la PCR
Contaminación por arrastre de
amplicón – falsos positivos.
Inhibidores de la muestra- falsos
negativos.

20. Controles de PCR
Control Positivo de Extracción
Muestra que contiene el ADN blanco preparado con los mismos
reactivos de extracción y amplificación que muestras problema
Control Negativo de Extracción
Muestra negativa preparada con los mismos reactivos de
extracción y amplificación que muestras problema
Control Positivo de PCR
Cocktail de reactivos con dilución de ADN en el límite de corte
y/o límite de detección del método ( control fuerte y control
débil )
Control Negativo de PCR
Cocktail de reactivos sin DNA.

21. SIEMBRA Y CORRIDA ELECTROFORÉTICA
EN CUBA HORIZONTAL

22. VISUALIZACIÓN DEL PRODUCTO DE PCR
Electroforesis en geles de agarosa
Siembra del gel Bromuro de Etidio

23. VARIANTES DE LA PCR

24. LOW STRINGENCY SINGLE
SPECIFIC PRIMER PCR (LSSP-
PCR)
 Se somete el ADN purificado a la amplificación por PCR de la
manera anteriormente descripta en presencia del par de primers
dirigidos contra el kinetoplasto.
 Con los productos de amplificación de la primer PCR, se realiza
una segunda reacción de PCR en condiciones de baja astringencia:
elevadas concentraciones de enzima (Taq ADN polimerasa), baja
temperatura de annealing, y solamente un único primer.

25. LOW STRINGENCY SINGLE
SPECIFIC PRIMER PCR
Bajo estas condiciones, el oligonucleótido se hibridiza con
elevada especificidad a su extremo complementario y con baja
especificidad a múltiples sitios dentro del fragmento generando
un patrón electroforético altamente específico para cada clon del
parásito (Andrade et al., 1999).
 Se hace una corrida electroforética en gel de poliacrilamida al
6% en buffer TBE utilizando la cuba vertical, y posteriormente
se tiñe el mismo con NO3Ag.

26. MPM C+ C-
elevada cc de taq, 1 solo
300bp primer y baja Tº de
200bp
100bp
annealing
LSSP - PCR
MPM C+ C-

27. LSSP-PCR
11 12 13 14 Mn IG C- 14 MPM

28. RT- PCR
RNA Una sola hebra Sensible al calor
Transcripción Reversa antes de la PCR
a partir de una copia de la hebra de RNA
cDNA (DNA complementario) estable al
calor
resistir
PCR

29. PASOS DE LA RT- PCR
1) Unión del primer a la secuencia de ARN
objetivo.
2) La polimerasa cataliza la extensión del primer
mediante la incorporación de nucleótidos
complementarios.
3) Fin de la transcripción reversa, se obtiene la
hebra de cADN complementario al ARN.
4) PCR

30. RT- PCR

31. NESTED PCR
 Dos procesos de amplificación sucesivos.
 En la segunda PCR se utilizan unos primers contenidos en la
secuencia amplificada en la primera reacción.
 El producto de amplificación de la primera PCR es el molde
de la segunda.
 Se aplica cuando se quiere mejorar la sensibilidad y
especificidad de la técnica, especialmente en el caso de muestras
de baja calidad o con un pequeño número de copias de la
secuencia a amplificar.

32. Nested pcr
 A veces 1 ronda de PCR no da un producto único a partir
de un templado complejo, apareciendo un barrido.
Se puede resolver utilizando un segundo par de primers
que hibriden un poco más internamente que los primeros.
Se obtiene un producto único porque solo el fragmento
correcto de ADN posee los sitios correctos de hibridización
para el segundo par de primers.

33. Nested pcr
Ventaja
 Brindar alta sensibilidad y especificidad.
La especificidad aumenta porque como es amplificación
de un amplicón obtenido previamente, los cebadores sólo
van a hibridar en un sitio dentro de la molécula y el
resultado será una única banda.
 Se evitan posibles hibridaciones inespecíficas de los
cebadores.
Desventaja
 No permite cuantificar la muestra.

34. NESTED PCR

35. NESTED PCR

36. PCR MULTIPLEX
 Es una PCR en la cual hay múltiples pares de primers (hasta
8) lo que da una serie de productos. Se amplifica
simultáneamente más de una secuencia.
 Se combinan dos o más pares de primers en un mismo tubo,
junto con el resto de los reactivos, para amplificar
simultáneamente varios segmentos de ADN.
 Éstos pueden verse como múltiples bandas en un gel de
agarosa.
 Se usa frecuentemente en diagnóstico médico.
 Ahorra templado, reactivos, tiempo y gastos.
 Requiere una cuidadosa optimización

37. PCR MULTIPLEX

38. PCR TIEMPO REAL
 La PCR en tiempo real da resultados cuantitativos.
 Una ventaja adicional de la PCR en tiempo real es la relativa
facilidad y conveniencia de su uso comparadas a algunos métodos
más viejos.
 Los productos de amplificación se observan a medida que
transcurren los ciclos de la PCR.

39. PCR TIEMPO REAL
Está basado en:
• La detección y cuantificación de un reportero fluorescente,
cuya señal aumenta en proporción directa a la cantidad de
producto de PCR en la reacción.
• El empleo de un termociclador que tiene acoplado un
sistema de detección que es capaz de adquirir y cuantificar la
señal emitida por el reportero al final de cada ciclo para cada
muestra.

40.  Técnicas basadas en fluorocromos: el ADN, que ve
multiplicada su cantidad con cada ciclo, se une al
fluorocromo (generalmente SYBER Green) produciendo
fluorescencia que es medida por el termociclador apto para
PCR en tiempo real. Permite cuantificar sólo una secuencia
por reacción. Es mucho más económica que la que usa sondas
específicas.

41. APLICACIONES DE LA PCR EN
TIEMPO REAL
 Monitoreo post transplante.
 Genotopificación:
- Trisomías
- Microdeleciones
- Haplotipos
- Análisis cuantitativo de micosatélite
- Diagnóstico prenatal de células fetales en sangre materna

42. VENTAJAS DE LA Real-time PCR
* No está influenciada por amplificaciones no específicas
* La amplificación es monitoreada en tiempo real
* No se realiza ningún proceso post PCR de los productos ( disminuye los
riesgos de contaminación)
* Rápida (30 minutos a 2 hours)
* requirement of 1000-fold less RNA than conventional assays
(3 picogram = one genome equivalent)
* detection is capable down to a 2-fold change
* confirmation of specific amplification by melting point analysis
* Más específica, sensible y reproducible
* No es mucho más costosa que la PCR convencional
(excepto por los costos del equipamiento)

43. REAL TIME PCR

45. Nigel Walker, NIEHS (www)

46. (www)

47. BioRad iCycler
(www)

48. Corbett Research Rotor-Gene 3000
(www)

49. MUCHAS GRACIAS!!