El documento describe varios métodos para la extracción y detección de ADN, incluyendo la extracción de ADN de tejido, detección mediante sondas de hibridación, técnicas de amplificación como PCR y RT-PCR, y métodos automatizados para la extracción y detección de ADN.

1. Fundamentos de Biología molecular Fco Javier Casas Ciria. UGC Análisis Clinicos. Hospital de La Linea. S.A.S. 22 de febrero 2010

2. Estructura DNA

5. Extracción DNA 10-25 mg tejido en 180 ul de Tampón ATL

6. Añadir 20 ml de proteinasa K y mezclar con vortex. Incubar a 55 ºC. Mezclar con vortex ocasionalmente durante la incubación para mezclar. Incubación 1-3 horas.

7. Vortex 15 segundo

8. Añadir buffer AL 200 ul, vortex e incubar a 70º 10 minutos.

9. Añadir 200 ul de etanol absoluto, vortex.

10. Pipetear todo en una columna de Dneasy spin. Que se coloca en un tubo de recolección de 2 ml.

11. Centrifugar a 6000 g durante 1 minuto y descartar lo que pasó al tubo de recolección

12. Extracción DNA Colocar la columna en otro tubo de recolección. Añadir 500 ml de buffer AW1.

13. Centrifugar 1 minuto a 6000 g y descartar lo del tubo de recolección

14. Colocal la columna en otro tubo de recolección y añadir 500 ml de buffer AW2.

15. Centrifugar a velocidad máxima durante 3 minutos.

16. Colocar la columna en un tubo de microcentrifuga y pipetear 200 ul de buffer AE.

17. Mantener 1 minuto a temperatura ambiente y centrifugar 1 a 6000 g.

18. Repetir los dos últimos pasos y guardar todo el eluido para estudio del DNA.

19. Detección por Sondas de hibridación Sondas: segmentos de RNA o DNA marcados con radioisotopos, emzimas o sustancias quimioluminiscentes. De 15 a 25 nucleótidos

20. Se unen a secuencias complementarias de ácidos nucleicos con gran especificidad.

21. Diseñadas para identificar gérmenes o segmentos genéticos detectando secuencias específicas.

22. Formatos de reacción empleados: fase líquida, fase sólida, in situ

23. Detección por Sondas de hibridación Fase líquida: sonda marcada con ester de acridina se incuba con la cadena de ácido nucleíco diana. Tras la hibridación se produce la hidrólisis alcalina. Aquel ester de acridina que está unido a un dímero de DNA está protegido de la hidrólisis y la sonda unida es medida en un luminometro tras la adición de peroxidasa.

24. La hibridación no requiere retirada de sondas de una sola cadena no unidas o aislamiento de los dímeros de ácidos nucleicos unidos. Fase sólida. El DNA en estudio es unido a membrana de nitrocelilosa o nylon y son hibridados con la sonda en solución.

25. La sonda no unida se retira tras lavados y se detecta la sonda unida mediante fluorescencia luminiscencia, radiactividad o desarrollo de color.

26. Detección por Sondas de hibridación Hibridación in situ: el ácido nucleico se encuentra en tejido o células que están fijadas a un porta de microscopio. Se emplea tejido fijado en formalina o embebido en parafina Baja sensibilidad, limitado a a situaciones en que el número de gérmenes es muy grande. Faringitis por grupo A; uretritis por C. trachomatis y N. gonorrhoeae

27. Más usado para confirmación de cultivo de micobacterias y hongos dimórficos.

28. Detección por Sondas de hibridación Sondas de ácido nucleico peptídico (PNA, peptide nucleic acid) Similares aDNA pero el esqueleto de fosfato es remplezado por esqueleto peptídico. A causa de que no están cargadas no tienen que sobrepasar la repulsión electrostática que existe entre dos cadenas de DNA hibridadas.

29. Por ello la sonda de PNA se une más rapidamente y con más fuerza y por su caracter hidrofóbico son más útiles en hibridación in situ al penetrar las membranas. Utilizadas para detección directa de bacterias desde el frasco de hemocultivos y de Mycobacterium tuberculosis de baciloscopias positivas.

30. Técnicas de amplificación La PCR, la técnica más desarrollada, que tiene 25 años, aunque existen muchas otras técnicas y varias con utilidad clínica.

31. Ctcas: Tienen una sensibilidad única en el laboratorio de medicina

32. Han aportado oportunidades para el cuidado del paciente

33. El nuevo "gold standard" en varios diagnósticos.

34. Amplificación de la señal No se produce el aumento en concentración de la diana.

35. Se produce el aumento en la concentración de moléculas marcadas unidas al ácido nucleico diana. Para ello se ha empleado: Multiples enzimas

36. Múltiples sondas

37. Multiples capas de sonda

38. Reducción del "ruido" de fondo

39. Ventaja de la amplificación de la señal: El número de moléculas dianas no se altera. La señal es directamente proporcional a la cantidad de secuencia diana presente en la muestra clínica. Se reduce los falsos positivos debido a contaminación cruzada y simplifica el desarrollo de técnicas cuantitativas.