El documento detalla la historia y evolución de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) desde sus inicios en la década de 1970 hasta las técnicas avanzadas de PCR en tiempo real. Se describen los componentes necesarios, tipos de PCR y sus aplicaciones en microbiología y diagnóstico. Además, se mencionan las ventajas y desventajas de la técnica, así como variaciones como la PCR de extensión solapada y la PCR múltiplex.

2. Tejido ADN
Total
Reacción en Cadena de la Polimerasa
(PCR)

3. Un poco de historia
Hasta
principios
de 1970
• Única estrategia para aislar un gen y obtener grandes cantidades del mismo en estado
puro era el clonado molecular en plásmidos y fagos.
1956
• Komberg descubrió en E. coli. la ADN polimerasa, con la cual sintetizó por primera vez
ADN en un tubo de ensayo.
1960
• Gobind Khorana fue pionero en las técnicas necesarias para crear y utilizar
oligonucleótidos de ADN. Los oligonucleótidos se utilizaron como bloques para construir
por primera vez un gen sintético funcional y como cebadores para la ADN polimerasa.
1969
• Thomas Brock aisló la bacteria Thermus aquaticus. En 1976 se aisló una ADN polimerasa
de esta bacteria que conservaba su actividad a temperaturas superiores a 75⁰C.
1977
• Frederick Sanger informó sobre un método para determinar la secuencia del ADN,
empleando un cebador, ADN polimerasa y oligonucleótidos. Secuenció el genoma del
bacteriófago Φ-X174

4. 1979: Cetus Corporation
Sondas para la detección
de genes clonados
Técnica alternativa al
método de secuenciación
del ADN de Sanger
sintetizar
oligonucleótidos
1983
Agregar un segundo
cebador en la
cadena opuesta
Inespecífico para una única
ubicación en el genoma
1985: PCR
(Cortázar y Silva,2004)

5. PCR: en sus inicios
• Poco eficiente
• Utilizaba grandes cantidades de ADN polimerasa
• Necesitaba supervisión durante todo el proceso
Automatizar
“DNA Termal Cycler”
1985
1990 Fundamento para PCR
en tiempo real
"Mr. Cycle"
(Rodríguez y Barrera, 2004)

6. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
(Rodríguez y Barrera, 2004)

7. ¿Con qué ingredientes se realiza una PCR?
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
(Rodríguez y Barrera, 2004)

8. Empleo de adyuvantes: aumentan la especificidad y fidelidad.
• Dimetilsulfóxido: disminuye la estructura secundaria del ADN.
• Tween 20, Tritón X-100: estabilizan la enzima.
• Polietilenglicol, glicerol, formamida o seroalbúmina bovina…
Magnesio
Manganeso
0.5-2.5mM
Magnesio: bajo rendimiento.
Magnesio. Amplificaciones inespecíficas.
dATP
dCTP
dGTP
dTTP
0.2 a 1 mM
[ ] disminuyen la fidelidad de la
polimerasa e incluso pueden inhibir su
actividad
[]Magnesio=0.5-1mMx[]dNTPs
(Garrido, 2013)

9. Cebadores: 0.1-0.5μM
• Contenido de G+C≈40-75%.
• Evitar zonas con largas secuencias de una sola base.
• Se recomienda que en los extremos las últimas
bases sean una G o C.
• Evitar la complementariedad.
• Tamaño de18-30 pb.
• Carecer de estructuras secundarias.
Enzimas:
Taq polimerasa (Thermus aquaticus):actividad exonucleasa 5´-3´
Vent polimerasa (Thermococcus litoralis): actividad correctora
Pfu polimerasa (Pyrococcus furiosus): actividad correctora
UITma polimerasa (Thermotoga maritima): actividad de reverso transcriptasa
(Garrido, 2013)

11. ¿Cómo se analiza el producto de amplificación?
Electroforesis
Gel de agarosa Gel de poliacrilamida
La elección de la matriz y el porcentaje en la cual separar
los productos, dependerá del tamaño de los mismos
3% para ADN< 500 pb
2% para AND 500 pb-1000 pb
1.5% para AND 1kb-2kb
Bromuro de etidio: agente intercalante.
Fluoresce cuando es expuesto a luz UV
Nitrato de plata: se une al ADN
por interacciones electostáticas
(Garrido, 2013)

12. Agarosa se disuelve en
buffer (TBE o TAE)
Colorantes de corrida:
• xilen-cianol: migra igual que los
fragmentos de 4 kb.
• azul de bromofenol: migra junto
con los fragmenos de 300pb.
(Garrido, 2013)

13. Ventajas
• Rapidez y sencillez de uso
• Sensibilidad
• Robustez
Desventajas
• Necesidad de disponer de
información sobre la secuencia
del ADN diana
• Tamaño corto de los productos
de PCR
• Infidelidad en la replicación del
ADN
• Peligro de contaminación

14. • PCR con transcriptasa inversa
• PCR inversa
• PCR de extensión solapada
• PCR anidada
• PCR múltiplex
• PCR en tiempo real
• PCR asimétrica
• PCR in situ
• PCR con adaptadores
• PCR larga
• PCR de colonia
• PCR específica de alelo
Variantes de la PCR convencional

15. PCR con transcriptasa inversa
• Oligo dT: permite la síntesis de
ADNc a partir del ARNm o ARN
con colas poli A.
• Hexanucleótidos al azar: se
unen al azar en cualquier región
del ARN molde.
• Primer específico:
(Pinilla et al., 2008)

16. PCR inversa
Se emplea para clonar regiones
desconocidas de un ADN, situadas
en posición vecinal a secuencias
diana conocidas. En lugar de
amplificar la región interna,
flanqueada por los dos iniciadores,
se amplifica la región externa que
flanquea los iniciadores
(Pinilla et al., 2008)

17. PCR de extensión solapada (Mutagénesis)
Se introducen cambios de
secuencia dentro de
fragmentos (clonados) de
ADN. Se requieren 2
cebadores mutagénicos.
(Pinilla et al., 2008)

18. PCR anidada (nested)
Aumenta la especificidad al
realizarse una segunda
reacción de PCR, con dos
iniciadores nuevos que
hibridan dentro del
fragmento diana amplificado
en la primera reacción.
(Pinilla et al., 2008)

19. PCR múltiplex
• PCR en la cual se amplifica más de
una secuencia en una misma reacción.
• Se obtiene la información de varios
loci en una sola reacción, requiere
menor cantidad de molde para el
análisis y menor cantidad de reactivos.
• Diagnóstico de agentes infecciosos.
(Pinilla et al., 2008)

20. PCR en tiempo real
Permite detectar y cuantificar las secuencias específicas de ácidos nucleicos
mediante el uso de agentes fluorescentes en la reacción.
La detección de los productos amplificados sucede en cada ciclo de la reacción.
El producto de amplificación es monitoreado conforme transcurre la reacción sin
que haya la necesidad de que sea manipulado en un gel de agarosa.
Si utilizamos ADN genómico: qPCR (quantitativePCR), si por lo contrario, primero
obtenemos ADNc y luego hacemos la PCR: RT-qPCR.
1
2
3
4
(Pinilla et al., 2008)

21. PCR en tiempo real
Técnicas basadas en
fluorocromos no específicos
Técnicas basadas en sondas
específicas
SYBR Green
Sondas hidrolizadas
Sondas de hibridización.
(Pinilla et al., 2008)

22. Aplicaciones de la PCR
(Rodríguez y Barrera, 2004)

23. (Rodríguez y Barrera, 2004)
Microbiología:
identificar el agente
infeccioso
independientemente
de su respuesta
serológica
Diagnóstico de
enfermedades
prenatales
Evolución:
relaciones
filogenéticas

24. Amplificación isotérmica mediada por lazo (LAMP) (Notomi et al., 2000)
• Toda la reacción se realiza a
una única temperatura.
• Los productos de amplificación
se pueden observer
directamente.
• Presenta una alta especificidad
(seis cebadores).