Este documento analiza estrategias para la producción a gran escala de cecropina A en Escherichia coli. Describe los métodos utilizados como cultivo en medio LB a 37°C, uso de rojo Congo para detectar fibras curli, SDS-PAGE y Western blot para separar proteínas, y pruebas MIC para medir actividad antimicrobiana. Los resultados muestran que la cecropina A se produjo y purificó exitosamente de E. coli, formando agregados amiloides extracelulares. Esta producción biológica de péptidos antim

1. Laura Alejandra Lambis
Laura Melisa Ordoñez

2. INTRODUCTION

3. E. Coli
• Gram-negative bacillus and oxidase-negative
organism of the family Enterobacteriaceae
• Grows well aerobically and anaerobically,
preferably at 37°C.
• Approximately 90% of strains ferment lactose
and produce indole and cadaverine by means
of lysine decarboxylase.

4. Cecropin A
• Cationic, 37-residue antimicrobial
peptide (AMP)
• Isolated from the moth Hyalophora
cecropia
• Kills bacteria by disrupting
membrane potential and
permeabilizing membranes at low
concentrations

5. C-terminal with carboxyl group
C-terminal with amide group

6. Curli assembly: proteinaceous fibrous structures produced on the surface of
many gram-negative bacteria. They mediate bacterial cell–cell interactions, host-
pathogen interactions and attachment to biotic and abiotic surfaces.

7. GENERAL
OBJECTIVE

8. To analyze strategies for
large-scale production of
Cecropin A in Escheria coli

9. MÉTODOS

10. RECOMBINANTE

11. CULTIVO
MEDIO LB
Contiene NaCl + Triptona o
Peptona + Extracto de
levadura
Todos estos aportan los
nutrientes necesarios para el
desarrollo óptimo de los
microorganismos y el
mantenimiento de las cepas de
E-coli recombinante.
En el artículo el medio LB
para cultivar células
necesarias para la
determinación de su
expresión en la membrana
celular externa. El tiempo
requerido fue de 3 horas a
una temperatura de 37ºC,
luego fue examinado el
resultado por medio de
fluorescencia

12. ROJO DEL CONGO
1. Molécula de Rojo del Congo
con un tamaño de 21 Aº,
tiene un tamaño similar al de
la proteína amiloide, el cual es
de 19Aº y ambas estructuras
se unen a través de puentes
de H
2. Molécula de Rojo del Congo
se intercala entre proteínas
adyacentes las cuales
normalmente están unidas
por puentes de H .
En el articulo se usó
para determinar la
producción de fibras
curli en la proteína
salvaje y en cepas
mutantes

13. MICROSCOPIA DE TRANSMISIÓN DE
ELECTRONES (TEM)
Los electrones difractados
al pasar a través de la
muestra generan un
difractograma que puede
ser transformado
directamente en imagen
mediante lentes
magnéticas que es la
proyección de la estructura
cristalina a lo largo de la
dirección de los electrones.
Se usó para la
observación de
muestras celulares
tras proceso de
dilución y deteccion
de fusiones de
Cecropina A

14. SDS-PAGE
Migración de
partículas o solutos
cargados en un
medio liquido
cargado
negativamente y bajo
la influencia de un
campo eléctrico.
• Separación de
proteínas
amiloideas.
• Se complementó
con una
transferencia
Western usando
anticuerpos His
para reaccionar con
las proteínas

15. RECOLECCIÓN
E-coli BL21 ( DE3 ) Csg BAC
que alberga el plásmido dirigido a
la exportación , fue extendida en
platos de YESCA
Después del cultivo por 3 días a
25ºC, las células fueron
extendidas y re-suspendidas en
Buffer S1 y S2 , luego fueron
centrifugadas para empezar con
la escisión gracias al DTT
contenido en los Buffers
Δ
En el articulo se
realizó este
procedimiento para
poder separar la
Cecropina A del
plásmido formado

16. MIC TEST
Para este articulo se uso
la técnica de dilución la
cual es cuantitativa y se
hace en un medio
liquido. Se colocan
concentraciones
decrecientes del agente
antimicrobiano en tubos
que mantienen el
desarrollo del
microorganismo
Se usó para
detectar
actividad
antimicrobiana
del bio-producto

17. RESULTADOS

22. A. Cleavage conditions
B. After ultrafiltration
Arrows: Cecropin A
peptides

24. DISCUSSION

25. AUTHORS QUOTE AGREE/DISAGREE
Garrity, S. J., Sivanathan, V., Dong,
J., Lindquist, S., & Hochschild, A.
“ A conversion of yeast prion
protein to an infectious form in
bacteria”
Sivanathan, V. & Hochschild, A. “ Sup35NM, a yeast prion
protein,was secreted from E. coli
by the curli export system and
formed extracellular amyloid fiber
at the cell surface”
Wiegand, I., Hilpert, K. &
Hancock, R.
“Agar and broth dilution methods
to determine the minimal
inhibitory concentrations of
antimicrobial substances”
Halfmann, R. & Lindquist, S. “Screening for amyloid aggregation
by Semi-Denaturing Detergent-
Agarose Gel Electrophoresis”

26. CONCLUSIONS

27. This method is useful to
produce many AMPs and
viable peptides and therefore
defend us from external
pathogens.
Bioproduction of AMPs could
provide a sustainable supply
that improves the outcomes of
public health measures.
The effect of cecropin A is
proportional to its
concentration, which is useful
to determine how the
produced amyloid aggregates
will act.
MIC confirmed equal
antimicrobial activity between
bioproduced peptide and the
chemically-synthesized
cecropin A.