Revisión de artículo: Mutantes mucoides de Escherichia coli

1. Mucoid Mutants of Escherichia coli
SAM M. BEISER AND BERNARD D. DAVIS
United States Public Health Service Tuberculosis Research Laboratory, Cornell University Medical College, New York,
New York
Received for publication March 4, 1957
LINA MARÍA PINEDA BERRIO
2017

2. Objetivos
• Determinar una posible relación entre la propiedad mucoide y la
mutación bioquímica asociada.
• Proporcionar información sobre los mecanismos genéticos y
metabólicos que controlan la síntesis capsular.

3. Escherichia coli W
(ATCC 9637)
Características:
• Cepa no mucoide comunmente sembrada e incubada a 35°C.
• Utiliza sacarosa como fuente de carbono.
* Aislada originalmente de la tierra de un cementerio cerca de la
Universidad de Rutgers, hacia 1943.

4. Materiales y métodos
• La cepa mutante se derivó de E. coli cepa W (ATCC 9637) después de
irradiación UV.
Mutantes auxotróficos. Método de penicilina.
Mutantes meiotróficos producidos por reversiones de las mutaciones
auxótrofas.
Mutantes resistentes a la inhibición por D-serina.
*Algunos mucoides

5. Materiales y métodos
• Medio Mínimo A con 0,2% glucosa.
 Auxotrófo 161-51: medio con 40 µg/mL α-ácido aminobutírico con
20 µg/mL L-tryptofano.
 Auxotrófo 83-20: medio con 20 µg/mL L-tirosina con 40 µg/mL L-
tryptofano.
 Cepa D-Serina resistente 6-4: 200 µg/mL de D-Serina.
*Cultivados a 35°C

6. Materiales y métodos
Caldos cultivados
por 18h con
agitación.
centrifugación.
Sobrenadante + 3
vol. de etanol +
cristales de
acetato de sodio.
24h
+ Cristales de
acetato de sodio =
precipitación.
Centrifugación.
Disolver en agua
destilada hasta
quedar libres de
fosfato.
Lavado con etanol,
secado en vacío
sobre hidróxido de
sodio y pentóxido
de fósforo.
• Preparación del material capsular
Polvo seco almacenado a
temperatura amb.
*Caldos cepas 161-51 y 2-1 a 35°C
*Cepa 83-20 temp. Amb.

7. Materiales y métodos
• Análisis de materiales capsulares aislados
 Nitrógeno (destilación), glucosa, Metil-Pentosa y ácido hexurónico
(espectrofotometría).
 Determinación de azúcares:
50mg de cada material capsular aislado fue hidrolizado por 2h a 100°C
en 2N HCl. Evaporación hasta secar. Residuo disuelto en 0,5mL de
agua. Cromatografía.

8. Materiales y métodos
• Preparación de vacunas
 Formaldehído 0,2% agregado a un cultivo de 18h de la “cepa
apropiada”. Reposo overnight a temperatura ambiente.
 Suspensión centrifugada, lavada 2 veces con solución salina 0,85% y
resuspendidas.
 Contenido de N fue determinado. Vacunas fueron disueltas antes
de su uso para contener 0.1 mg de N/mL.

9. Materiales y métodos
• Preparación de antisueros
 Inmunización de conejos con las vacunas de las cepas mucoides 2-
1 (reversión auxótrofo 81-83 de lisina) y 6-4 (D-Serina resistente).
 Recibieron un total de 20 mL en 16 inyecciones:
1° semana 2° semana 3° semana 4° semana
0.5 mL x 4
inyecciones
1.0 mL x 4
inyecciones
1.5 mL x 4
inyecciones
2.0 mL x 4
inyecciones

10. Materiales y métodos
• Preparación de antisueros
 Conejos fueron sangrados mediante punción cardiaca 5-7 días
después de la última inyección.
 Los sueros fueron separados y luego conservados con merthiolate.
 Los controles de sangría fueron tomados de todos los conejos antes
de la inmunización.

11. Materiales y métodos
• Preparación de antisueros
 Antes de ser usados, todos los sueros fueron absorbidos con una
vacuna preparada a partir de la cepa salvaje no mucoide sembrada a
35°C.
 10 mL de sueros son mezclados con 0,1 mL de la vacuna,
incubados:
A. 1h en baño de María a 37°C.
B. Overnight a 4°C.

12. Materiales y métodos
• Preparación de antisueros
Centrifugación
Decantación
sobrenadante
Adición de 0.5
mL solución
salina al 0.85%
Se repitió el
proceso con
más adiciones
de la vacuna
hasta que no se
observó
aglutinación
Se realizaron
curvas de
precipitación
*Para algunos estudios el suero se adsorbe más con vacunas preparadas a partir de varias mutantes mucoides.

13. Resultados
Aislamiento de mutantes
Genealogía

14. Resultados
Aislamiento de mutantes
Cepa Característica
161-51 y 83-20 Auxotróficas.
2-1 Reversión de auxótrofo de lisina 81-83.
6-4 Resistente a la inhibición por D- Serina.

15. Resultados
Independencia de la mutación mucoide de las otras mutaciones

16. Resultados
Propiedades analíticas de la sustancia capsular

17. Resultados
Preparaciones capsulares
inmunoquímicamente idénticas.

18. Resultados
Vacunas
La absorción con vacunas preparadas a partir de diversas cepas no
mucoides no pudo eliminar aglutininas para los mutantes mucoides.

19. Discusiones
• Las variantes mucoides de la cepa W de E. coli no son muy comunes.
• Puesto que se encontraron ciertos mutantes bioquímicos, parece
posible que el carácter mucoide y la propiedad seleccionada para
ambos pudieran resultar de una sola mutación.
• No se excluye la posibilidad de que en una población tratada con UV
se favorezca la aparición de una mutación mucoide en las células
sometidas a otro tipo de mutación.

20. Discusiones
• Crecimiento mucoide no sólo por mutación, también por la
reducción de la temperatura.
• Variaciones en la concentración o naturaleza de la fuente de
carbono, ni pH no indujo crecimiento mucoide.
• Diversas variantes mucoides estudiadas elaboraban el mismo
material capsular

21. Conclusiones
• A baja temperatura, mismo material capsular también está presente en
el tipo salvaje.
• Material capsular parcialmente caracterizada.

22. Conclusiones
• Propiedad mucoide y el requerimiento de crecimiento surgieron de
dos mutaciones distintas.
Unos pocos mucoides 37°C.
Uno a 25ºC.
15°C incluso el tipo silvestre exhibió crecimiento mucoide.

23. ¡Gracias!