La PCR anidada es una modificación de la PCR diseñada para aumentar la sensibilidad de la reacción del ensayo. Esta modificación consta de dos grupos de cebadores dirigidos contra la misma diana. El primer grupo de cebadores se desarrolla de la manera usual, mientras que el segundo grupo son cebadores situados internamente o anidados con respecto al primer grupo.

1. MÉTODOS DE EXTRACCIÓN
DE ÁCIDOS NUCLEICOS:
“NESTED PCR O PCR ANIDADA”
SEMINARIO DE
BIOLOGÍA MOLECULAR
INTEGRANTES:
 BELTRÁN UBE CARLOS
 GUERRERO MACIAS SELENA
 PEÑAFIEL JESÚS
GRUPO #7
DOCENTE: Blgo. Saúl Escobar

2. NESTED PCR O PCR ANIDADA
La PCR anidada es una modificación de la PCR, diseñada para aumentar la
sensibilidad de la reacción del ensayo. Esta modificación consta de dos grupos de
cebadores dirigidos contra la misma diana. El primer grupo de cebadores se
desarrolla de la manera usual, mientras que el segundo grupo son cebadores
situados internamente o anidados con respecto al primer grupo.
ESPECIFICIDAD
La especificidad de la PCR ANIDADA depende,
fundamentalmente, de la temperatura empleada en la fase
de hibridación y de la cantidad de iones divalentes que se
incorporan a la reacción (además de depender de la
secuencia de los cebadores).

3. COMPONENTES DE LA PCR ANIDADA
Sabemos que el objetivo de la reacción en cadena de la polimerasa es obtener
muchas copias de un fragmento de DNA, para después poder visualizar este
fragmento y utilizarlo en otras aplicaciones si es necesario.
Para alcanzar este resultado, se necesita:
 El DNA a partir del cual queremos obtener una copia de un fragmento, es decir,
el DNA que queremos amplificar. Este DNA se conoce como DNA molde.
 Una enzima capaz de generar una copia de DNA a partir del DNA molde: una
DNA polimerasa. La reacción se lleva a cabo en un tampón apropiado para el
funcionamiento de la enzima polimerasa. Además, como cofactores de la
polimerasa se añaden cationes divalentes, generalmente en forma de cloruro
de magnesio (MgCl2).
 Iniciadores de la reacción: Las enzimas DNA polimerasas únicamente son
capaces de añadir nucleótidos al extremo 3’ libre de una doble cadena de DNA.
 Nucleótidos libres: las enzimas DNA polimerasas van a crear una cadena
complementaria a la cadena molde mediante la incorporación de nucleótidos al
extremo 3’ libre del cebador que se ha unido a la cadena molde.

4. PASOS PARA REALIZAR PCR ANIDADA
Inicio
Este paso consiste en llevar la
reacción hasta una temperatura
de 94-96 °C (o 98 °C si se está
usando una polimerasa
termoestable extrema), que se
mantiene durante 1-9 minutos.
Esto sólo es necesario para ADN
polimerasas que requieran
activación por calor.

5. Desnaturalización
La primera reacción consiste
en la desnaturalización del
DNA, separándose las dos
cadenas por ruptura de los
enlaces de hidrógeno. Las
condiciones típicas de
desnaturalización son 95ºC
por 30 segundos, o 97ºC por
15 segundos; sin embargo
temperaturas más altas
pueden ser apropiadas
especialmente para templados
ricos en G + C
Alineamiento
La segunda reacción consiste en la
hibridación de los primers. Para ello se
baja la temperatura y las condiciones
serán tales que se facilitará la unión de
los primers a las cadenas. La
temperatura y el tiempo requerido
para el alineamiento de los primers
dependen de la composición, tamaño y
concentración de los primers
amplificadores. Una temperatura de
alineamiento óptima es 5ºC por debajo
del Tm de los primers.

6. Extensión
La tercera reacción se efectúa
a 72º C, temperatura a la cual,
la polimerasa lleva a cabo su
acción, insertando los
diferentes nucleótidos
complementarios en el orden
que le va indicando la cadena
que actúa como molde. El
tiempo de extensión depende
de la longitud y concentración
de la secuencia blanco y de la
temperatura. La extensión del
primer se realiza
tradicionalmente a 72ºC.
CICLOS
Las nuevas cadenas de ADN creados en la
etapa de extensión y las plantillas de ADN
originales se desnaturalizan por
calentamiento de la reacción, y otra ronda o
ciclo de PCR comienza. El ciclismo es
esencialmente tomando desnaturalización,
hibridación y extensión y haciendo una y otra
vez.
La polimerasa de ADN de la termófilo T.
aquaticus se utiliza para construir nuevas
cadenas de ADN en la PCR debido a que la
etapa de desnaturalización utiliza para
separar las hebras de ADN no afecta a la
polimerasa. Por lo tanto, las etapas se pueden
repetir muchas veces, cada vez con más
plantilla de ADN disponible para la
hibridación del cebador y extensión por la
polimerasa. La cantidad de ADN aumenta
exponencialmente, generando cantidades
utilizables de ADN de alta calidad en un
tiempo relativamente corto.

7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 BioPharmaceutical Technology Center. (2013). BioPharmaceutical Technology Center. Obtenido de
BioPharmaceutical Technology Center: http://www.btci.org/k12/bft/pcr/pcr_geneticscreening.html
 Prats, P. G. (2005). Limitaciones de la PCR. En P. G. Prats, Microbiología Clínica (pág. 196). Madrid :
Editorial Médica Panamericana.
 Prats, P. G. (2005). Marcado de los amplicones. En P. G. Prats, Microbiología Clínica (pág. 196). Madrid:
Editorial Médica Panamericana.
 Prats, P. G. (2005). Ventajas de la Nested PCR. En P. G. Prats, Microbiología Clínica (pág. 196). Madrid :
Editorial Médica Panamericana.