Este documento describe varios métodos para estudiar la transcripción en eucariotas, incluyendo ensayos de corrida continua para medir la velocidad de transcripción, análisis de deleciones 5' para localizar secuencias de control génico, y el uso de α-amanitina para separar e identificar las tres ARN polimerasas eucariotas. También compara las subunidades de las ARN polimerasas de levaduras y E. coli y analiza secuencias reguladoras como la caja TATA e iniciadores en genes eucariotas

1. TranscripciónTranscripción
en Eucariotas

2. Ensayo de cadenas nacientes (corrida continua
run–on ) determina la velocidad de transcripción de un gen

3. Demostración de la
Síntesis diferencial de
12 ARNm
• ADNc de codificadores de 12
proteínas hepáticas (por ej.,
[3]: α1-antitripsina; [4]:[3]: α1-antitripsina; [4]:
albúmina; [6] transferrina
• A: actina
• α-tubulina
• β-tubulina
• pB: ADN del plásmido B
• ARNt de metionina

4. Análisis por serie de deleciones 5´ para
localizar secuencias de control génica

5. Separación e identificación de las tres ARN
polimerasas eucariontes
• α- amanitina
(octapéptido de acción
diferencial)
• Polimerasa I: nucleolar• Polimerasa I: nucleolar
(pre-ARNrs)
• Polimerasa II: ARNm y
cuatro ARNnps
• Polimerasa III: ARNts,
ARNr 5,8S y ARNp
estables (U6, S7)

6. Comparación
de las
Subunidades
de las ARN
160-220
128-150
19-22 kDa 44 kDa 19-22 kDa
156kDa
151kDa
37 kDa
=(Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser)n
polimerasas
de las
Levaduras
con las de
E. coli
19-22 kDa 44 kDa 19-22 kDa
10 – 27 kDa
37 kDa

7. Mapeo
aproximado
del sitio de
iniciación deiniciación de
la
Transcripción
in vivo

8. Mapeo preciso del sitio de iniciación de la unidad
de transcripción tardía de los adenovirus

9. Secuencias reguladoras en los genes
eucariotas codificadores de proteínaseucariotas codificadores de proteínas
La caja TATA los iniciadores y las Islas CpG

10. Comparación de secuencias de nucleótidos
hacia 5´ del sitio de inicio en 60 genes de
vertebrados
• En algunos genes de eucariotas en lugar de cajas TATA hay un elemento
Iniciador : (5´) Y-Y-A+1-N-T/A-Y-Y-Y(3´)
• Las Islas CpG(20-50) son típicas de los genes que codifican las proteínas del
metabolismo intermedio

11. Los elementos proximales del promotor
(promotores distantes a más de 100-200pb hacia 5´)(promotores distantes a más de 100-200pb hacia 5´)

12. Análisis de las mutaciones rastreadoras de
ligadores
(linker scanning mutations: LSm )

13. Identificación de los elementos proximales del promotor que
controlan el gen de la tk por LSm del virus del herpes simple

14. Identificación de los elementos proximales del
promotor que controlan el gen de la tk por LS
mutations
del virus del herpes simple

15. Identificación de
los elementos
proximales del
promotor que
controlan el gen
de la tk por LSm
del virus deldel virus del
herpes simple