Métodos de secuenciación en biología molecular

2. Métodos de secuenciación mejor conocidos
Métodos
de
secuenciación
mejor
conocidos
“Método Sanger”
“Método de terminación de cadena” y “Método dideoxi de secuenciación
“Método Maxam & Gilbert”
“Método de Pirosecuenciación”

3. Método de Sanger
• ADN problema
• Primer modificado
• ADN polimerasa I
 dATP
 dCTP
Nucleótidos terminadores
 dGTP
 dTTP
Desoxinucleótido
Didesoxinucleótido
Reactivos empleados

4. Efecto de la eliminación del grupo 3’-OH en los ddXTP

5. Efecto de la adición aleatoria de lo ddXTPs durante el proceso de elongación
“En cada tubo se obtendrán fragmentos de
ADN con diferente tamaño en donde el
nucleótido terminador será el
didesoxinucleótido”

6. “En cada tubo se obtendrán
fragmentos de ADN con diferente
tamaño en donde el nucleótido
terminador será el
didesoxinucleótido”
Determinar el peso molecular
de los fragmentos y con base
en su peso molecular y el tipo
de terminador utilizado se
determinará la secuencia de
nucleótidos del ADN problema.

7. Autoradiografia de un gel de secuenciación por
método de Sanger y la secuecia de nucleótidos
interpretada en el.

8. Variantes del método Sanger
Polimerasas empleadas
Fragmento Klenow
de la polimerasa I
de E. coli
Polimerasas
termoestables como la
polimerasa Taq.
Marcaje de los
fragmentos
Isotopo
radiactivo32P Moléculas
fluorescentes
Sitio de marcaje
Marcaje del
iniciador
Marcaje
incorporado
en la cadena
Marcaje del
nucleótido
terminal

9. Automatización del método Sanger

12. Método Químico: Maxam & Gilbert
Marcaje del ADN
problema por su
extremo 5’ o 3’.
Degradación
química del ADN
Obtención de
múltiples
fragmentos de
diferente tamaño
Análisis de los
fragmentos por
electroforesis
Metodología básica para la secuenciación por el método de Maxam & Gilbert

13. Método Químico: Maxam & Gilbert
1. Marcaje del ADN
problema por su
extremo 5’ o 3’.
2. Degradación
química del ADN
3. Obtención de
múltiples
fragmentos de
diferente tamaño
4. Análisis de los
fragmentos por
electroforesis
• Los extremos 5’ del ADN de
interés son marcados
radioactivamente con 32P.
• Con enzimas de restricción
se descarta el extremo de
una de las hebras de ADN.
• Se adicionan muestras con
múltiples copias a cuatro
recipientes de reacción.

14. Método Químico: Maxam & Gilbert
1. Marcaje del ADN
problema por su
extremo 5’ o 3’.
2. Degradación
química del ADN
3. Obtención de
múltiples
fragmentos de
diferente tamaño
4. Análisis de los
fragmentos por
electroforesis
• Cada tubo de reacción es sometido a
un método de degradación de ADN
diferente que escinde a las
moléculas en lugares distintos.

15.  1. Corte de las purinas
Metilación de A y G con dimetil sulfato (DMS). Después, la reacción es
tratada en condiciones alcalinas; la molécula de ADN se fragmenta en las
purinas metiladas. Como resultado, se obtiene una serie de bandas
oscuras que corresponden a las guaninas (las cuales se metilan 5 veces más
rápido), y bandas claras que corresponden a las adeninas

16.  2. Corte de adeninas. Esta reacción es una variación de la anterior. Las
purinas metiladas se tratan inicialmente con un ácido diluido. Esto
favorece el corte de las adeninas metiladas. Después de un tratamiento
alcalino las guaninas también son cortadas. Este tratamiento genera una
serie de bandas oscuras y claras que también corresponden a las adeninas,
y las guaninas, respectivamente

17.  3. Corte de pirimidinas. Esta reacción utiliza el reactivo hidracina, que
corta las bases citosina y timina. Posteriormente, se trata con piperidina
para completar la reacción.
 4. Corte de citosina. La presencia de NaCl 2M inhibe la reacción de
hidracina con tiamina, y el tratamiento posterior con piperidina, produce
solamente fragmentos que terminan en citosina

18. Ejemplos de reactivos utilizados en la etapa de escisión

19. Método Químico: Maxam & Gilbert
1. Marcaje del ADN
problema por su
extremo 5’ o 3’.
2. Degradación
química del ADN
3. Obtención de
múltiples
fragmentos de
diferente tamaño
4. Análisis de los
fragmentos por
electroforesis
Obtención de fragmentos de diferente tamaño

20. Método Químico: Maxam & Gilbert
Análisis de los fragmentos mediante electroforesis
1. Marcaje del ADN
problema por su
extremo 5’ o 3’.
2. Degradación
química del ADN
3. Obtención de
múltiples
fragmentos de
diferente tamaño
4. Análisis de los
fragmentos por
electroforesis

22. Diferencias principales entre ambos métodos
 En comparación con el método
Sanger, el Maxam-Gilbert es el más
adecuado para determinar la
secuencia de fragmentos cortos de
ADN, debido a que puede
determinar la secuencia desde la
primera base. En cambio, el método
de Sanger sólo permite la lectura a
partir de la base 10-20.
 Las reacciones de secuenciación del
método enzimático se pueden
realizar en unas horas, en cambio las
del método de Maxam-Gilbert tardan
al menos un día y, además, las
reacciones del método de Sanger son
más “puras”, con menos
contaminantes que puedan afectar la
resolución del gel.

23. Métodos de nueva generación
Desde el año 2008 la nueva generación de métodos de
secuenciación se ha presentado con la aparición de diversas técnicas
sin base en el método Sanger.
Algunos de los métodos más sobresalientes que hoy en día son
usados para la secuenciación de ADN son:
 Pirosecuenciación
 Illumina sequencing
 Roche 454 Genome Sequencing

24. Pirosecuenciación
 La pirosecuenciación se basa
en la formación de cadenas de
ADN y en la detección del
grupo pirofosfato liberado
durante la incorporación de
nucleótidos trifosfato en dicha
cadena.
Enzimas
usadas en
el proceso
Polimerasa
ATP
sulfurilasa
Luciferasa
Apirasa
Enzimas utilizadas en la pirosecuenciación

25. 1.-El equipo libera un dNTP determinado
2.-Al generarse el enlace fosfodiéster, se libera pirofosfato (PPi)
3.-La sulfurilasa usa como sustrato a al PPi para generar ATP
4.- El ATP es sustrato de la luciferasa, el cual libera una señal de
fluorescencia que es detectado por la cámara CCD
5.-La enzima apirasa elimina el exceso de ATP y de nucleótidos no
incorporados.
*La liberación de dNTPS es realizada en forma secuencial.

26. Pirosecuenciación

27. Costo del servicio de secuenciación
Empresa Costo del servicio de secuenciación
TACGen $2.00- 3.50 / por muestra
ACGT $2.50 / por muestra
CCIB DNA Core (MGH) $2.12-$3.38 / por muestra
Genomics & Epigenomics
Shared Resource
$3.25 / por muestra
Nucleic Acid Shared
Resource
$5.0 / por muestra
>48 muestras: $3.31 / por muestra
Empresa
Costo del servicio de
secuenciación
Functional Biosciences, Inc $7.00 / por muestra
DNASU Core Facility Arizona
State University
$3.70 / por muestra
>48 muestras: $3.00 / por
muestra
Genomics Core Facility $3.75 / por muestra
Eurofins $2.5 / por muestra
 La siguiente tabla muestra algunos ejemplos del precio actual que algunas empresas
ofrecen para el servicio de secuenciación.
*Los precios varían de acuerdo al número de muestras, su volumen y a la relación con la empresa del servicio

28. Bibliografía
 Campio RdN, Caultec JC. Instituto de Biotecnología-UNAM. Secuenciación
de Ácidos Nucléicos. 2014 Junio. http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/
met/secuenciacion_acidos_nucleicos.pdf
 Blackburn, G. M. and M. Gait (1996), Nucleic Acids in Chemistry and
Biology, 2nd Ed., Oxford, U. Pr., NY, EUA.
 Ansorge, W., J. Zimmerman, C. Schwager, J. Stegemann, H. Erfle, and H.
Voss (1990) One label, one tube, Sanger DNA sequencing in one and two
lanes on a gel. Nucleic Acids Res 18(11): 3419-3420