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PCR

  1. 1. PCR La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
  2. 2. Aplicaciones La PCR tiene multitud de aplicaciones: Permite detectar y controlar fragmentos de ADN de interés (técnica de clonaje, recombinación dirigida) Medicina: Como herramienta de diagnosis de especies que provocan un cuadro infeccioso y en el diagnóstico de enfermedades hereditarias. Paleontología, antropología biológica y ciencias forenses: permite recuperar las escasas cantidades de DNA que aun no se ha degradado. Estudios evolutivos: establecimiento de relaciones filogenéticas de diferentes especies.
  3. 3. Identifica con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
  4. 4. Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse a las polimerasas para que vuelvan a duplicarlas
  5. 5. La PCR consiste en la amplificación de fragmentos de DNA mediante el uso de la enzima DNA polimerasa que tiene capacidad para sintetizar nuevas cadenas de DNA mediante la incorporación de bases nucleotídicas, a partir de una secuencia corta conocida (cebador o primer) que hibrida de forma complementaria con uno de los extremos de la hebra. El crecimiento de la nueva hebra se realiza en sentido 5’ a 3’.
  6. 6. Para realizar la técnica se necesitan: Los 4 dNTP para polimerizar nuevo ADN. Dos cebadores , de 6 a 40 nucleótidos para el inicio la reacción. Delimitan la zona de ADN a amplificar. Iones divalentes. Se suele usar Mg2+ como MgCl2. Actúan como cofactores de la polimerasa. Iones monovalentes, como el K+. Una solución tampón de pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa. ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima alrededor de 70 °C (la más común es la polimerasa Taq). ADN molde, región de ADN que se va a amplificar. Termociclador.
  7. 7. Inicio Este paso lleva la reacción hasta una T0 de 94-98 °C (ó 98 °C si se está usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Desnaturalización Separación las dos hebras del ADN (94-95 °C). La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización depende, por ejemplo, de la proporción de G+C que tenga la hebra, como también del largo de la misma.
  8. 8. dos cebadores Esta técnica utiliza dos cebadores (oligonucleótidos) de unos 20 pares de bases de longitud, sintetizados por métodos químicos y cuyas secuencias corresponden a los extremos de las cadenas del ADN que se quiere reproducir.
  9. 9. El ADN que hay que multiplicar El ADN que hay que multiplicar es calentado a 94° C: El calor separa las ambas cadenas. La temperatura es disminuida para alcanzar la temperatura de "annealing" por los cebadores. Entonces, cada cebador se fija a una sola cadena de ADN. En este momento interviene ADN pol.
  10. 10. La ADN pol La ADN pol alarga la extremidad 3 ' de los cebadores utilizando dNTPs. Se forman dos cadenas complementarias dando lugar a dobles cadenas de ADN. Este proceso repetido varias veces, reacción en cadena, permite obtener cantidades importantes del ADN original. Para cada pareja de primers, hay que también medir la concentración del ión Mg++.
  11. 11. Las etapas de la reacción 1. La separación del ADN: El primero es la separación total (fusión) de las dos cadenas que forman la molécula de ADN que se quiere amplificar. Para hacerlo calentamos La solución que contiene el ADN a 94 ° C. Ambas cadenas obtenidas servirán de plantilla a las reacciones que siguen.
  12. 12. 2. Hibridación de los cebadores: "annealing" Calculamos una " temperatura de base ", con la ayuda de una fórmula o de ábaco. Sometemos a un test luego la temperatura que hay que utilizar aumentando 3 en 3 grados el valor de base: para cada una de estos temperatura efectuamos un PCR. Escogido la temperatura que da más ADN. La temperatura óptima debe ser determinada con el termociclador que servirá luego.
  13. 13. Las ADN polimerasas termoestables Para efectuar una PCR, se deben utilizar ADN polimerasas termoestables. La Taq DNA pol por ejemplo fué aislada de la bacteriaThermus aquaticus que habita en medios acuáticos calientes de temperaturas de alrededor de 70°C. Esta polimerasa funciona de manera óptima a 72°C. La vida media de ésta enzima calentada a 96°C es de 40 minutos.
  14. 14. Taq DNA Polimerasa es obtenida en E. coli a partir de la expresión de un plásmido portador del gen de Thermus aquaticus. Es una enzima termoestable que cataliza la polimerización de nucleótidos en la dirección 5’-a-3’ a 70-74 ºC y exhibe una vida media de 30-45 minutos a 95 ºC. Esta enzima posee actividad polimerasa y exonucleasa en la dirección 5’-3' pero carece de actividad exonucleasa en la dirección 3'-5' (prueba de lectura). La enzima es capaz de amplificar productos de hasta 5 kb de longitud.
  15. 15. Alineamiento o unión del cebador O hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 °C durante 20-40 s. Los puentes de hidrógeno sólo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa se une el híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada.
  16. 16. Extensión o elongación de la cadena La polimerasa, toma el ADN molde y sintetiza la cadena complementaria a partir del cebador para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa añade los dNTP complementarios en dirección 5'→ 3', del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La To depende de la ADN polimerasa que usemos. Para la Taq, está en 75-80 °C (comúnmente 72 °C). En su temperatura óptima, la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un minuto.

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