Biotecnología aquí!

1. La espectrometría de masas y sus
aplicaciones a la biotecnología
acuícola, agrícola y ambiental.
Virna Cedeño Escobar, Ph.D.

2. “un espectrometrista de
masas es alguien que
identifica lo que es algo a
través de destrozarlo con
un martillo y analizar las
partes".

3. Espectrometría de masa de Biomoléculas
Composición celular
Célula animal
Célula vegetal Célula bacteriana
• Altamente complejas: molecular numerosas de diferentes familias y varias propiedades
físico químicas
Familias de biomoléculas
• Oligonucleótidos (DNA, RNA)
• Proteínas/péptidos
• Lípidos
• Oligosacáridos
• Compuestos orgánicos pequeños (metabolitos, neurotransmisores)

4. La espectrometría de masas (MS)
LA ESPECTROMETRÍA DE MASA ES UNA
PODEROSA TÉCNICA MICROANALÍTICA QUE
PERMITE DETERMINAR CON GRAN
PRECISIÓN LA MASA DE MOLÉCULAS
Un espectrómetro de masa mide la relación masa/carga (m/z) de
moléculas (y/o sus fragmentos) y átomos .
El proceso implica :
- La conversión de la muestra en iones de fase gaseosa.
- Separación de los iones basados en su m/z
- Detección de los iones de cada m/z

5. Espectrometría de masas
Flujo de trabajo para la MS
• Un espectrómetro de masas está siempre compuesto de 3 componentes.
I. Fuente de iones
Creación de iones en fase
gaseosa
II. Analizador de masas
Separación de iones en
fase gaseosa de acuerdo a
su relación masa/carga
(m/z)
III. Detector
Detección por medición
medición de frecuencias.
Espectro de masas MS
M/z
Intensity (a.u.)
M en a.m.u. o u. (químicos) o
Dalton Da (biólogos)
1u = 1Da = 1.660 540 × 10−27 kg
Peaks present
Gaussian profiles
z carga efectiva(no unit)
q= z . e coulombs (e = 1.6 × 10−19 C)
M/z no unit

6. Exactitud de masa: precisión
Mass accuracy (ppm) = x106
Apex
FWHM
observed mass - theoretical mass
990 1030
Mass
Assignment
R =
Mass
FWHM
100%
50%
995 1005 1010 1020 1040
(1000 Da)
m/z
theoretical mass

7. FUENTE DE IONES MALDI (Matrix-Assisted Laser desorption/ionization)

8. Analizador de masas : Time of fligh: TOF (tiempo de vuelo)

9. Láser
(337nm)
Cámara
Detector lineal
Espejos de iones
(Reflectrón)
Zona de decaimiento
TOF2
Fuente de iones 2
Selector de
iones
Detector
Fuente de ionización 1
Zona de aceleración
TOF1
Microplaca
Pila de
desaceleración
La espectrometría de masas:
Maldi TOF-TOF

10. Espectrometría de masas
Flujo de trabajo MS MS: para determinación de estructura
MS MS/MS or MS2
MS spectrum
M4 
M/z
Intensity (a.u.)
M1
M2
M3
 Molecule of interest i.e. parent ion
or precursor ion
F+ Fragment ions or daughter ions
Ion selection
M/z
Intensity (a.u.)

M1
MS2 spectrum
F1+ 
M/z
Intensity (a.u.)
M1
F2+
F5+
F3+
F4+
Ion selection
Fragmentation
m/z separation
of fragment ions

12. Proteomics Classical Bottom-Up Proteins ID strategy
Enzymatic digestion MS (MALDI, ESI)
Protein (M, IP)
M/z
Intensity
f1+
Spot exision
100 kDa
50 kDa
25 kDa
10 kDa
Gel 2D
Isoelectric focusing (IP)
Fragmentation
MS/MS
M/z
Intensity
Databank
identification
"Peptide Mass Fingerprint
PMF
Peptide Sequence Tag
PST
f2+
f3+
f4+
f5+
Parent ion
Databank
identification

13. Imaging Mass Spectrometry
- Permite evaluar mezclas moleculares complejas en células, tejidos u otros tipos de muestra
con una alta especificidad.
- Permite analizar una variedad de especies moleculares (amplio rango de masa, desde
pequeños metabolitos a grandes moléculas tales como las proteínas).
- Localización simultánea de moléculas
- Detección de modificaciones post-traduccionales.
- Provee información cuantitativa relativa en un solo experimento.
- Las imágenes de IMS son únicas y se derivan de medidas moleculares directas sin
depender de reactivos específicos de un blanco (ej anticuerpos)
- Permite mapear la distribución espacial con la exactitud de la masa y la especificidad
química (MALDI TOF TOF).

15. Histología molecular: cortes con el criostato para MSI

17. Mass Imaging: MALDI TOF TOF

18. ESPECTROS DE MASAS OBTENIDOS A PARTIR DE ANÁLISIS DE BACTERIAS COMPLETAS
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
3999.0 6211.4 8423.8 10636.2 12848.6 15061.0
Mass (m/z)
1.4E+4
0
Final - Shots 250 - P1-concha 13-08-14; Run #35; Label P16
4420.5737(R221,S232)
6062.9219(R314,S215)
6620.2803(R358,S103)
6868.4863(R396,S73)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
3999.0 5208.2 6417.4 7626.6 8835.8 10045.0
Mass (m/z)
1.1E+4
0
Final - Shots 250 - P1-concha 13-08-14; Run #33; Label P16
4413.8164(R391,S121)
4424.8374(R679,S101)
6059.7573(R323,S277)
6864.1338(R836,S51)
8407.1768(R650,S58)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
3999.0 6211.4 8423.8 10636.2 12848.6 15061.0
Mass (m/z)
2.4E+4
0
Final - Shots 250 - P1-concha 13-08-14; Run #35; Label P20
8076.5391(R357,S1033)
6506.1621(R300,S537)
6642.3848(R337,S256)
6658.8638(R485,S156)
7278.8105(R295,S197)
8288.5840(R670,S87)

19. ESPECTROS DE MASAS OBTENIDOS A PARTIR DE MUESTRAS DE TEJIDOS VEGETALES
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
1999.0 3605.4 5211.8 6818.2 8424.6 10031.0
Mass (m/z)
9.1E+3
0
Final - Shots 250 - P1-concha 13-08-14; Run #19; Label M4
7370.0371(R479,S568)
6430.3003(R497,S439)
6268.0132(R391,S373)
5174.8882(R323,S332)
4341.2739(R669,S123)
5890.1665(R402,S320)
6687.2476(R797,S107)
7774.3242(R585,S215)
6796.9312(R48746,S5122.663)82(R649,S179) 9216.9277(R815,S143)
7168.2705(R685,S79)
6562.2339(R670,S75)
9191.5742(R727,S81)
8060.9434(R722,S66)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
1999.0 3605.4 5211.8 6818.2 8424.6 10031.0
Mass (m/z)
7342.7
0
Final - Shots 250 - P1-concha 13-08-14; Run #18; Label M4
6428.7466(R481,S434)
6266.0112(R376,S403)
7368.4512(R530,S304)
4340.1709(R920,S130) 5888.4160(R405,S296)
7772.2310(R559,S244)
5171.6875(R845,S157)
6685.6489(R425,S7615601.)4219(R610,S175) 9214.1016(R871,S133)
6795.6934(R857,S85)
7163.7559(R1166,S51)
6561.7158(R1021,S51) 9344.3887(R739,S84)
8058.1855(R693,S67)

20. MALDI y MICROBIOLOGIA
Proteómica y metaproteómica
Metabolómica

21. Microorganismos
- Métodos basados en espectrometría de masas para monitorear
nuevos aislados
- Identificaciones bacterianas de rutina. La velocidad de adquisición
de datos y análisis (5 min/organismo) permite un alto
rendimiento. Los patrones de masas son comparados a perfiles
de miles de bacterias lo que permite la identificación de
organismos a nivel de género, especies y algunas veces al nivel de
subespecie.
- MS puede ser utilizada para estudiar y hacer seguimiento de proteínas
presentes en un microorganismo dado para un fenotipo en particular.
Ej: un proteoma específico. Lactobacillus sakei CRL1756 investigación
proteómica de la tolerancia a la sal.

22. Vertebrados
- Estrés relacionado con las condiciones de cultivo
- Calidad de peces: comprensión de los mecanismos
involucrados en el desarrollo de malformaciones
esqueléticas de la columna vertebral.
- Efectos de la administración de probióticos en las dietas,
con resultados interesantes al nivel de la
inmunoestimulación.
- Estudios in vitro e in vivo sobre infecciones en peces
cultivados
- Desarrollo de vacunas
- Estudios toxicológicos para evaluar las expresiones de
proteínas inducidas por los químicos (contaminantes
ambientales que afectan el crecimiento, reproducción y
salud de los animales.
- Descubrimiento de biomarcadores potenciales para el
monitoreo y evaluación de riesgos.

23. Invertebrados
- Herramienta para comprender
mejor los mecanismos de
respuesta inmmune
- Estudiar los efectos de
antibióticos sobre los patrones
de expresión de proteínas en la
hemolinfa.
- Identificación de organismos
centinelas como los bivalvos que
son reservorios de muchos
contaminantes (proteómica
toxicológica)

24. Algas
- Estudio de la biología de las
microalgas y su respuesta a
señales ambientales para
comprender los mecanismos
que desencadenan el desarrollo
de blooms algales peligrosos.
- Comprensión del metabolismo
para tener aplicaciones
biotecnológicas como es la
producción de compuestos
bioactivos y biocombustible así
como su uso en bioremediación.

25. Proyectos en marcha Universidad Nacional de
Tumbes – Incabiotec – Concepto Azul
- Desarrollo de la tecnología de imágenes de masas con espectrometría de masa
MALDI TOF TOF, in vitro sobre medios gelosados e in situ sobre cortes congelados,
considerando biomarcadores peptídicos, lipidómicos y metabolómicos de
bacterias asociadas a la concha negra Anadara tuberculosa.
- Caracterización metagenómica de la microbiota del trips del banano y alteración
por microorganismos nativos de la filosfera o rizósfera.
- Caracterización de los simbiontes de trips de banano y análisis del efecto de la
microbiota sobre la atracción de los insectos.
- Caracterización molecular genómica y proteómica/mass imaging del hongo de la
sigatoka negra del banano.
- Caracterización metagenómica de suelos y aguas contaminados por cianuro
derivado de actividades mineras y uso de bacterias degradadores caracterizadas
molecularmente para la biodegradación.
- Caracterización de las asociaciones microbianas en las enfermedades de la fruta
del cacao y control biológico mediante el uso de bacterias nativas

26. - Control biológico de los nematodos de la raíz de la uva mediante el uso de
bacterias y hongos nativos que afectan específicamente la microbiota de los
nematodos.
- Caracterización de la bacteria patógena Pasteuria sp. del nematodo de la raíz
de la uva.
- Uso de TALENs para la mutagénesis dirigida de genes de receptores al virus
WSSV en el camarón.
- Uso de talens para la mutagenesis del gene suppresor de tumor p53 para la
imortalizacion in vivo de hemocitos del camaron.
- Modelización de la salmonelosis del cuy y desarrollo de métodos de
prevención basados en la domesticación de la microbiota y en el uso de
vacunas ADN.
- Caracterización molecular (genómica, metagenómica, proteómica,
metabolómica ) de la microbiota del camarón considerando microrganismos
patógenos y benéficos a nivel de la microbiota del tracto digestivo y de la
hemolinfa.

27. - Valorización biotecnológica de desechos de la concha abanico para la
producción de hidrolizado incorporado en la dieta de camarón.
- Caracterización molecular y mass imaging de l sistema hormonal reproductivo
del paiche y del robalo.
- Caracterización molecular de las mutaciones relacionadas a la fibrosis quística
en Perú y caracterización metagenómica y metaproteómica de las infecciones
bacterians pulmonares asociadas.
- Caracterización molecular, proteómica y lipidómica de thraustochytridos
aislados de manglar y evaluados como aditivos alimenticios para larvas
juveniles y reproductores de camarón.

28. Virna Cedeño Escobar, Ph.D.
Post Doc CONCYTEC Universidad Nacional de Tumbes
virna.cedenoescobar@gmail.com