Guía de estudio para el tercer examen de cromatografía

1. Guía de estudio para el tercer examen de cromatografía
1) Derivatizantes
1.1. Definición: La derivatización es el proceso donde se transforma un analito químicamente, con la finalidad de obtener
compuestos derivados que poseean prop. Fq. distintas al original, para facilitar el proceso de análisis. En ella se mejora la
volatilidad, estabilidad térmica y la detección del analito. En ellas, no se conoce las estructuras de los derivados obtenidos.
1.2. Características: Sus condiciones de elaboración son sencillas, el número de etapas es menor, generan alto rendimiento del
compuesto derivatizado.
1.3. Tipos de derivatización
1.3.1. Sililación: Reacción que reemplaza a un H+ de un analito por un grupo alquilsililo.
1.3.2. Acilación: Conversión de compuestos con hidrógenos activos como –OH, -SH, y –NH en esteres, tioesteres y aminas,
respectivamente.
1.3.3. Alquilación: Reemplazo de un hidrógeno activo en R-COOH, R-OH, R-SH, R-NH2 con un grupo alquilo o arilo.
1.4. Derivatización para GC/HPLC quiral: Cuando no es posible separar una mezcla de material quiral en un entorno quiral, se
puede derivatizar con otro reactivo quiral que sea óptimamente puro para formar un par de diasteroisómeros, estos presentan
diferente espectro. Para designar la utilización de esta derivatización, es necesario determinar la pureza enantiomética, la cual
se puede obtener por dos vías:
1.4.1. Método directo: Se emplea una fase estacionaria quiral.

2. 1.4.2. Derivatización quiral: Al utilizar un reactivo enantiométicamente puro, se obtiene una pareja de diastereoisómeros, los
cuales pueden ser separados en columnas convencionales.
El analito a determinar requiere que sus funcionalidades sean las adecuadas para reaccionar rápido con los reactivos que se
utilizarán. El quiral derivatizador debe contar con alta pureza enantiomérica, reaccionar rápidamente, llevar un cromóforo para
su detección en UV o fluorescencia. Los alcoholes y grupos funcionales –OH se convierten en ésteres diasteroisómeros al
reaccionar con reactivos enantiómeros como el ácido carboxílico, HCl y ácido anhidro.
En el caso de los grupos amono, pueden convertirse en amidas y urea al usar HCl o isocinato, respectivamente.

3. 1.5. Derivatizantes utilizados
Tipo de derivatizante Estructura Características Reacción (S) Aplicaciones y tipo
de Crom.
Tricloruro de Boro y
Metanol
BCl3-CH3OH Su rxn varía según
el analito a
diveratizar,
afectando a
condiciones como
el tiempo
principalmente.
En caso de que no
haya una
derivatización
completa, se
recomienda
utilizar exceso de
metanol, en
relación al ácido o
al éster.
Esterificación:
Un RCOOH se calienta con H2SO4 en un
disolvente CH3OH. Esto provoca la formación de
agua y un compuesto éster (RCOOCH3).
Transesterificación
El BCl3 catalizar la reacción de un RCOOR´ en un
disolvente CH3OH, obteniedo un producto
alquilado (RCOOCH3) y un ROH.
Es útil para la
preparación de
ésteresmetálicosy
ésteres.
Estos
derivatizadores se
utilizan para
derivatizar ácidos
carboxílicos y
trasesterificar
ésteres,
principalmente en
lípidosbacterianos
y semillas.
Se utiliza
principalmente en
la Cromatografía
de Gases.
BSA (N,O-Bis
(Trimetilsilil)
Acetamida.
Sus derivados son
muy volátiles, lo
que beneficia al
proceso
cromatográfico, al
no causar
interferencias. Sus
reacciones son
muy rápidas y sus
productossonmuy
estables. El grupo
Si contribuye en la
formación de
cristales grandes
para favorecer su
manejo. Pueden
usar otros
Sililación: En esta reacción, un hidrógeno activo
de un compuesto se sustituye por un grupo
alquilsililo.
El grupo sufre un ataque nucleofílico debido al
contacto con la muestra, esto provoca que el
analito tenga una baja basicidad y se una al BSA
por medio del grupo Si.
Diveratiza fácilmente en el sig. Orden;
alcohol>fenol>ác. Carb.> amina>amida. Entre
más impedido esté un compuesto, será mal
difícil derivatizarlo.
Reacciona
principalmente
con grupos –OH
(no est.imp.),
aminas, amidas,
ác. Carb. Y enoles.
Es utilizada para
muestras de
compuestos no
térmicamente
sensibles,
macromoléculas,
proteínaspequeña
(p. ej. fármacos,
drogas).
Son utilizadosenla
Cromatografía de

4. solventes para
mejorar su
eficiencia, p. ej.
DMF.
(Dimetilfumarato
).
Gases y la de
HPLC.
Ácido sulfúrico y
Metanol
H2SO4 y CH3OH Son compuestos
utilzados para
convertir ácidos
grasos en esteres.
En este caso, el
ácido sulfúrico
actúa como
catalizador y el
metanol como
diluyente.
Esterificación:
Un ROOH sufre una protonación del catalizador
hasta formaragua. El medioR1
-OHreaccionacon
la molécula, dejando un ROO+
RH, el cual sufre
una segunda protonación, hasta generar un
éster (ROOR1
).
Trasesterificación:
Un éster (ROOR1
) sufre una protonación,
causando que se genere una carta positiva en el
O. El medio R2
OH causa la formación de un
producto inestable, el cual sufre una catálisis,
formando un nuevo éster (ROOR2
).
Esta derivatización
se utiliza para
esterificar ác.
Carboxílicos y
transestericar
ésteres. En el
medio,esutilizado
para esterificar
ácidos grasos y
libres, asu vez,
para
transesterificar
ácidos grasos en
estado éster.
Se aplica en la
Cromatografía de
Anhidridos de ácidos
perfluorados
1. Anhídrido de ácido
trifluorurooacético (TFAA)
2. Anhídrido de ácido
pentafluoropropiónico (PFPA)
3. Anhídrido de ácido
heptafluorurobutírico (HFBA)
1. Es el más
reactivo de los
anhídridos. No se
forman productos
ácidos en su
reacción. Se
utilizan como
catalizadores
trietilamina y
trimetilamina en
su rxns. No se
utiliza ECD
(electron capture
detector).
2. Se usa en ECD o
FID (Flame
ionization
Los tres compuestos realizan acilación, donde,
un grupoacilose introduce enunamolécula que
tiene un H reemplazable (OH, NH o SH). A
excepción del TFAA, los reactivos forman
subproductos ácidos que deben ser removidos
antes del análisis para evitar anomalías. Suele
usarlle en presencia en piridina,
tetrahidrofurano. La humedad dificulta la
reacción.
Reaccionan
principalmente
con grupos OH, NH
y SH. Para el TFAA,
se utilizan
aminoácidos y
esteroides como
analitos,PFPA para
alcoholes, aminas
y fenoles
(derivados en
temp. Bajas) y el
HFBA para analitos
como alcoholes,
aminas y fenoles.
Son utilizadospara
preparar una

5. detector).Se
producen ácidos
en las
derivatizaciones,
requiere de un
eliminador de
ácidos.
3. Producen
derivados
sensibles al ECD y
requiere
eliminador de
ácidos.
captura de e-
derivados cpor
detección por
captura de GC. Se
producen
derivadosvolátiles,
con la finalidad de
utilizarlos en
análisis como
captura de
electrones o para
la detección de
ionización de
llama. Son
aplicados en la
detección de
drogas.
Trifloruro de boro en
metanol
El BF3 es un ácido
de Lewis,el cual se
utiliza como un
bloque de
construcción
versátil. Mientras
que el metanol
interviene como
disolvente. Al
unirse ambos
compuestos,
forman un
complejo
catalizador.Puesto
que el protón
cuenta con un
orbital 1s, lo hace
bastante reactivo
para donar
electrones.
Tiene una vida útil
limitada a T.A. y
debe refrigerarse.
Esterificación: Por si solo, el MeOH es usado
para esterificar ácidos orgánicos (en presencia
de HCl), en el cual se protona el ácido para que
el ion H+ forme un intermediario, el cual pierde
un protón y forme un éster. Por otro lado, los
tiempos de la reacción son prolongadamente
largos. En el caso del complejo, al usar como
BF3, acorta la esterificación de ác. Grasos en dos
minutos, en proporción del 12 al 14%.
Trasnesterificación: Ocurre en las mismas
condicionesdonde se utilizael ácidosulfúrico.En
el caso del complejo, se puede usar como
transesterificador en los lípidos que presenten
enlaces éster, pero los tiempos de reacción son
más largos.
En la esterificación
con MeOH y en
formade complejo
con BF3, se
esterifican ácidos
grasos libres o se
transesterifican
ácidos grasos con
éster, variando
entre ellas los
tiempos de
reacción y
proporción de
producto.
Las condiciones
preferidas para
esterificación o
trans-esterificación
son por
consiguiente un
exceso del alcohol
con el que se
quiere esterificar y

6. El complejogenera
metóxidos a partir
de su reacción con
ác. Grasos
insaturados por la
adición de
metanol.
ausencia de agua.
Es utilizado para
HPLC y GC.
Bromuro de
pentafluorobencilo
(PFBBr)
Es un compuesto
conformado por
radicales Fluor y
con un Bromo.
Este compuesto
convierte los ác.
Carboxílicos,
mercaptanos,
fenoles y
sulfamidas a
derivados
halogenados, los
cuales, son
fácilmente
detectado por la
captura de e- La
captura de
electrones sirve
como antesala al
análisis de GC de
ác. Grasos de
cadena corta.
El PFBBr se utiliza en la alquilación extractiva
(extracción y derivatización), en conjunto con
sulfato de tetrabutilamonio de hidrógeno como
el contraanión. El analito se separa como un ion
a través del uso de un catión de amonio
cuaternario. El anión se mueve desde la fase
acuosa a la fase orgánica cuando hay un pH
específico. Una vez en la fase orgánica, el anión
entra con el PFBBr, el cual lo deriva fácilmente.
Se puede utilizar
para la
identificación y
detección de
cantidades traza
de ácidos
carboxílicos,
mercaptanos, y
fenolesenpotable
agua
Además, permite
analizar la
extracción /
derivatización de
fármacos a partir
de matrices
biológicas. Es
utilizado para GC.
1,4,7,10,13,16-
hexaoxaciclooctadecan
o
(18 crown 6)
Es un anillode éter
de 18 miembros,
con 6 átomos de
oxígeno. Es un
catalizador de
transferencia de
fase, forma de
complejos con
muchos cationes,
especialmente
potasio, en
Cuando reacciona con la sal de potasio de un
ácido el ion de potasio, está complejado en el
centrode laanillo,principalmente atravésde las
fuerzas electrostáticas.
Esto hace a laporciónaniónicade la moléculade
analito muy reactiva a un haluro de alquilo, que
conduce a alquilación en condiciones suaves.
PFBBr y 18 crown 6
se utilizan en
combinación para
prepararderivados
pentafluorobencilo
-fenol para
Protección
Ambiental de
EE.UU.

7. disolventes
orgánicos no
polares.
Ácido trifluoroacético
(TFA)
Presenta dos desventajas que afectan
los resultados:
• La necesidad de emplear
reactivoscompletamente secos
debido a que los reactivos de
sililación y los derivados TMS
son inestableshidrolíticamente
• La deposición de sílice es
diferente partes del detector
cromatógrafico, causando un
incremento en los niveles de
ruido y una disminución en la
sensibilidad
Es un reactivo muy
versátil, el cual es
usado como
catalizador silio, el
cual derivatiza
carbohidratos,
iones reactivos de
par, etc. Participa
como un
catalizador ácido,
donde se debilita
el grupo saliente X
del Si,
favoreciendo la
derivatización del
analito. directa
GC. Los analitos
más atacados se
encuentran los
ácidos, alcoholes,
tionles, amidas,
aminas, cetonas y
aldehídos.
Este compuesto realiza la reacción de sililación,
donde sustituye al hidrógeno activo de la
molécula por un el grupo alquilsililado (R-OH +
Cl-Si(CH3)3 —> R-O-Si(CH3)3 + HCl), en los
cualesse puedenusar piridina como disolvente,
y ocurre muy rápidamente. Estos compuestos
tienen una gran afinidad por elementos muy
electronegativos.
En termino generales la sililación reduce la
polaridad de las moléculas para facilitar, su
análisismediante laespectroscopiade masasyla
cromatografía de gases.
El TFA se usa en la
fase reversade par
iónico en una
columnano iónica.
Se emplea para
diferenciar la
polaridadde los
analitos,
principalmente
entre proteínas o
péptidos en una
muestramezclada,
con la finalidad de
mejorar la
separación
cromatográica. Al
usarse como
adivitivo en la FM
del HPLC,
proporciona prop.
Detectables y le
confiere afinidad a
la base sólida. No
es sugerible para
determinación

8. Hidróxilo de
trimetilanilinio
(Trietilanilinio)
El hidróxido de
trimetilanilinio al
0.2M es un
reactivo
esterificante. Es
usado para
moléculas que
tienen protones
remplazables
adjuntos a
nitrógeno.
Realizar reacciones de esterificación y
transesterificación.
Particularmente es
utilizado para
metilación de
barbitúricos,
sedantes, bases
xantinasalcaloides
fenólicos,
anticonvulsivos y
ácidos grasos.
Tambiénpuede ser
utilizado para
alquilación Flash.
Trifloruro de Boro Reacción limpia
(sin reacciones
secundarias) con
subproductos
volátiles.
Resultantes de n-
butilo son
estables,volátiles,
y solublesenagua.
Se utiliza para
preparar
monocarboxílicos
de cadena corta
(C1-C10 y ácidos
dicarboxílicos para
GC.
Cómoda, rápida,
esterificación
cuantitativa de
ácidos grasos o
transesterificación
de esteres.
2. Espectroscopia de masas: Es una técnica microanalítica usada en la identificación de compuestos, cuantificarlos y elucidar la
estructura y propiedades químicas de la misma. Esta técnica requieres cantidades pequeñas de muestra, con la finalidad de
obtener la información de características como el peso y la estructura del mismo. Los procesos realizados por el aparato
destruyen la muestra y no puede recuperarse, debido a que la ioniza.
En ella se proporciona información acerca de la composición de la muestra (orgánicas, inorgánicas y biológicas), verifica la
composición cualitativa y cuantitativa de muestras complejas, etc. Este aparato obtiene iones a partir de moléculas orgánicas en
fase gaseosa, separándolos de acuerdo con su masa y carga, para luego ser detectadas por el dispositivo adecuado. La

9. El equipo encargado debe realizar 4 funciones; 1. Ser capaz de vaporizar sustancias de volatilidades distinas, 2) Al volatilizar la
muestra, debe ser capaz de originar iones a partir de la muestra en fase gaseosa, 3) Tras generar los iones, debe separarlos en
función masa/carga y 4) Tras separarlos, el espectro debe ser capaz de detectar los iones formados y registrarlos adecuadamente.
Cuando se trabaja con los sistemas de GC-MS, la identificación se basa en utilizar el espectro obtenido como “Huella química”,
comparando los resultados obtenidos con espectros de compuesto patrón. Como se ha indicado anteriormente cuando se
introduce una molécula en la cámara de ionización y se bombardea con una corriente de electrones esta sufre la ionización, es
decir pierde un electrón dando lugar a la formación de un ión-radical. Este estos equipos se pueden detectar tres tipos de iones.
a) Ion molecular: Son los iones moleculares que presentaran la misma masa que la molécula neutra y se registrará en el
espectro como “M+”. La primera forma ionizada será la que tenga el pico más alto en el registro, la cual se origina a partir de
un compuesto. Para separar un ion molecular de una molécula, se requieren alrededor de 70 Ev por cada electron.
b) Ion isotópico: Son los compuestos encontrados en estado natural, que tienen la capacidad de formar mezclas con otros
isotopos.
c) Fragmentos moleculares: Son fragmentos moleculares de la muestra ionizada.
El registro de una molécula puede detectarse por medio de la fórmula R= m/z, donde R es el registro obtenido por el espectro, m
es el peso molecular del ión y z es el número de cargas obtenidas en el espectro.
Además, este espectro se rige por dos reglas para detectar analitos:
A) Regla del nitrógeno: Moléculas sin o con núm. par de N, tienen peso molecular par. Si tiene o cuenta con número impar de
atomos de N, la estructura tiene un PM impar.
B) Reglas de fragmentación: Se basan en la estabilidad de iones y fragmentos neutros. En ella, se establecen distintos tipos de
rupturas; La ruptura olefinica corresponde a una fragmentación secundaria a partir de un carbocatión. La Ruptura alílica
ocurre cuando los enlaces dobles favorecen la escisión homolítica de los enlaces en posición alfa, para tomar iones arílicos,

10. conduciendo a la formación de un bencílico. La ruptura becílica ocurre con la presencia de un anillo aromático, el cual
induce la ruptura de los enlaces simples en posición alfa, conduciendo a la formación de un ión bencílico.
En el registro, el pico base (el más alto) es el más abundante en el espectro, mientras que el ion molécular (M+) es aquel que la
mayor cantidad de masa en un espectro.
El espectro tiene una gran cantidad de aplicaciones, principalmente para la determinación de PM de péptidos, proteínas y
oligonucleicos. Además, ayuda en la identificación de compuestos de cromatogramas en capa fina y papel. Interviene en la
identificación de drogas de abuso y sus metabolitos.
3. Reglas de Woowar-Fieser: Son reglas empíricas que permiten predecir la absorción máxima en el espectro UV de; 1) Dienos
conjugoados con sustituyentes alquilo sobre enlaces insaturados y 2) Grupos carbonilos conjugados como acetonas. En ella
influyen entre los factores que influyen destacan la naturaleza del disolvente, pH de la solución, la temperatura y la presencia
de sustancias interferentes.
4. Detectores: Los componentes que salen de de la columna, es necesario contar en la salida de la muestra con un sistema de detección, capaz de señalar la
elución de un componente de la muestra y ofrecer, una señal proporcional a la cantidad de sustancia por él. Por otro lado, los detectores usados en la GC
son de tipo diferencial, los cuales responden ante alguna propiedad que pueda variar cuándo éste se encuentra mezclado con alguna sustancia eluida de la
columna.
A) FID: Conocido como el Detector de ionización de llama es un detector utilizado en GC, es uno de los detectores más usados. Básicamente es un quemador de
hidrógeno/oxígeno, donde se mezcla el eluyente de la columna (gas portador y analito) con hidrógeno. Inmediatamente, este gas mezclado se enciende mediante
una chispa eléctrica, produciéndose una llama de alta temperatura.
B) Fluorescencia:
C) UV-Visible:
D) Conductividad:
Características, en especial UV-Vis y Fluorescencia.
Inyectores: Dispositivo que permite la introducción de la muestra en la corriente del gas portador. Existe una cierta variedad de diseños según el tipo de muestra
que se trata de analizar. El más común es el inyector de líquidos, que puede utilizarse para sólidos (en disolución) y gases (mediante jeringas especiales). El
inyector se trata de una cámara situada a la entrada de la columna y calentada independientemente de ésta, que suele tener una membrana de caucho a través
de la cual se introduce la muestra con ayuda de una jeringa hipodérmica.
inyectores de GC, permite inyectar volúmenes superiores a lo que entra a la columna:

11. A) ECD
B) NPD
C) Split/Splitless
D) On column
y esto, en este documento encontraran los tipos de inyectores