El documento describe un estudio sobre la composición química, actividad antimicrobiana y antioxidante del aceite esencial de Zanthoxylum rhoifolium Lam. Se analizará la composición del aceite esencial extraído de las hojas, su actividad antibacteriana contra microorganismos de referencia y su potencial antioxidante a través de varios ensayos. Los resultados permitirán evaluar las propiedades medicinales atribuidas a esta especie de la familia Rutaceae.

1. 1

2. Composición química, Actividad Antimicrobiana y
Antioxidante del Aceite Esencial de Zanthoxylum
rhoifolium Lam., (Rutaceae).
Lcda. Silvia Osuna R.
Universidad de Los Andes
Facultad de Farmacia y Bioanálisis
Escuela de Bioanálisis
Mérida Edo. Mérida
2

3. 3
Introducción
Patillo y col., 2011; Mendoza, 2008; Fonnegra y Jiménez, 2007; Primo, 1996; Hernández y Gally 1981.

4. Planteamiento del Problema
4
La utilización de las plantas medicinales con fines curativos se remonta
al principio de la historia de la humanidad
(Hernández y Gally, 1981).
Actualmente millones de plantas se emplean con fines curativos pero
la mayoría no poseen suficientes estudios que avalen las propiedades
que se les atribuyen en medicina folklórica
(García y col., 2009).
Los primeros compuestos orgánicos obtenidos por el hombre fueron
productos naturales extraídos de plantas y animales o formados por
microorganismos (Primo, 1996).
Las plantas medicinales utilizadas como materia prima
representan un área en rápida expansión (Sharapin, 2000).

5. 5
La fabricación de medicamentos y productos a partir de sustancias obtenidas
por vía sintética son muy utilizados, sin embargo son los productos naturales
quienes ahora representan beneficios mayores tanto en utilidad como en
economía (Gennaro, 2003).
Planteamiento del Problema
El creciente interés por las plantas medicinales no solo se debe a la presencia
de moléculas farmacológicamente activas, sino a la lucha por reducir los
secundarios que surgen como producto del uso de fármacos sintéticos
(Sharapin, 2000).

6. 6
Debido lo antes mencionado se han formulado las siguientes interrogantes:
¿Cuál es la composición química del aceite esencial obtenido a partir de las
hojas de la especie Zanthoxylum rhoifolium Lam., perteneciente a la familia
botánica Rutaceae?
¿Qué actividad antimicrobiana presentará el aceite esencial de la especie
Zanthoxylum rhoifolium Lam., a través del método de difusión en agar con
discos?
¿Tendrá actividad antioxidante el aceite esencial obtenido de la Zanthoxylum
rhoifolium Lam., por medio de los test ensayados?
Planteamiento del Problema

7. General y Específicos
7
OBJETIVOS

8. Estudiar la composición química, actividad antimicrobiana y antioxidante
del aceite esencial de Zanthoxylum rhoifolium Lam., perteneciente a la
familia botánica Rutaceae en Mérida - Venezuela.
Objetivo General
8

9. Objetivos Específicos
• Extraer el aceite esencial de las hojas de la especie Zanthoxylum rhoifolium
Lam., por hidrodestilación empleando la Trampa de Clevenger.
• Separar e identificar los compuestos del aceite esencial obtenido, por
cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas.
• Analizar la actividad antimicrobiana de los compuestos volátiles extraídos
de Zanthoxylum rhoifolium Lam., a través del método de difusión en agar
con discos frente a bacterias y levaduras de referencia internacional.
• Determinar el potencial antioxidante total de los compuestos extraídos de
Zanthoxylum rhoifolium Lam., a través de varios test, como la Capacidad
Antioxidante sobre el Radical Hidroxilo, método del ABTS o Ensayo de
Decoloración en solución etanólica y la Determinación de la Concentración
de Proteínas.
9

10. Justificación de la
Investigación
10
¿La intención de la
investigación es?

11. Patiño y col., (2011) exponen que las especies del género Zanthoxylum
se caracterizan por presentar diversos tipos de metabolitos secundarios,
muchos de los cuales han mostrado interesantes propiedades biológicas
contra diversos microorganismos patógenos humanos.
Macías y col., (2011) evidenciaron que la actividad antioxidante de
especies del género Zanthoxylum, se debe a la presencia de algunos
metabolitos de tipo flavonoides, lignanos y alcaloides. Por otro lado se
mostró una acción moderadamente efectiva contra la inflamación, y una
actividad biológica antiproliferativa importante en la inhibición del
crecimiento de células de leucemia.
11
Los resultados obtenidos permiten confirmar que el aceite esencial de
Zanthoxylum rhoifolium Lam., tiene cualidades citotóxicas contra
diferentes células tumorales y no mostró citotoxicidad contra las células
no tumorales (Da Silva et al., 2007a).
Marco Teórico Referencial
ANTECEDENTES DE TRABAJOS PREVIOS

12. Validaron la teoría de que los extractos de la corteza Z. rhoifolium Lam.,
presentan actividad antiplasmódica importante contra el Plasmodium
falciparum causante de la malaria en humanos (Jullian et al., 2006).
Otro aspecto en el que se ha visto relacionada la Z. rhoifolium Lam., tiene
que ver con su significativa influencia en los sistemas endocrino e inmune
humanos, donde se demostró que los aceites esenciales extraídos de esta
especie estimulan a las células natural killer (NK), CD4, así como la
producción de cortisol y dopamina (Qing, 2010).
12
En la investigación realizada por De Abreu Gonzaga et al., (2003), donde
se trabajo con aceites esenciales de las partes aéreas de Zanthoxylum
rhoifolium, se reportó que los aceites de las hojas y frutas presentaron
actividad antibacteriana contra la bacteria Staphylococcus aureus, y
contra las bacterias Klebsiella pneumoniae y la Salmonella setubal.
mientras el aceite esencial de las flores fue inactivo.
Marco Teórico Referencial
ANTECEDENTES DE TRABAJOS PREVIOS

13. Marcano, 2002; Vanaclocha, 2003; Contreras, 1998; Ortuño, 2006; Olaya y Méndez , 2005.
Estudio Fitoquímico Los Aceites Esenciales
13
Marco Teórico Referencial
BASES TEÓRICAS
Mezclas obtenidas de especies vegetales,
que presentan una compleja composición
química

14. Marco Teórico Referencial
BASES TEÓRICAS
Especie Zanthoxylum rhoifolium Lam.
14
Arboles y arbustos 4 a 15 metros
Tronco espinoso (1,5 cm), de corteza gris
oscura.
Ramas de unos 45cm por 8 cm.
Hojas son imparipinnadas. De 7 a 23
pares por rama, que miden unos 5 cm
por 1 a 2 cm, son elípticas, con el margen
toscamente dentado, salpicadas de
diminutos puntos translúcidos, el eje de
hoja y las nervaduras centrales se
observan rojizas.
Flores blancas, en pequeños grupos, con
simetría radial.
Frutos secos de superficie finamente
verrugosa.
Gargiullo et al., 2008.

15. 15

16. Marco Teórico Referencial
Hipótesis
16
 En vista de que existen estudios realizados con anterioridad, que
demuestran la alta potencialidad de los géneros pertenecientes a la
familia botánica Rutaceae, en lo que se refiere a su capacidad de
biosintetizar compuestos volátiles, es posible encontrar en la especie
Zanthoxylum rhoifolium Lam., compuestos volátiles estructuralmente
relacionados con los que hasta ahora se han aislados de dicha especie.
• Ya que diferentes especies pertenecientes a la familia botánica
Rutaceae, han demostrado actividad desde el punto de vista biológico y
farmacológico, es posible encontrar actividad antibacteriana y
antioxidante en los aceites esenciales de las hojas y flores de
Zanthoxylum rhoifolium Lam., perteneciente a esta familia botánica en
la ciudad de Mérida – Venezuela.

17. Marco Teórico Referencial
OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES
17
Variable Dependiente:
Actividad antibacteriana
y antioxidante
Variable Independiente:
Compuestos Volátiles del
Zanthoxylum rhoifolium
Variable Interviniente:
Metodología a utilizar en la
preparación de los cultivos
bacterianos y los materiales e
instrumentos a utilizar en la
ejecución de las técnicas.
Toro y Parra 2006.
Objetivos Específicos Variables Dimensiones Indicadores
Extraer el aceite
esencial de las hojas de
la especie Z. rhoifolium
Lam., por
hidrodestilación (trampa
de Clevenger).
Aceite esencial Características
organolépticas
- Color
- Olor
- Sabor
- Solubilidad
Separar e identificar los
compuestos del aceite
esencial obtenido, por
cromatografía de gases
acoplada a
espectrometría de
masas.
Compuestos
presentes en
el aceite
esencial
Moléculas
activas en el
ámbito
medicinal
- Monoterpenos
- Sesquiterpenos
- Alcoholes
- Aldehídos
- Sustancias
azufradas
- Fenoles simples
- Lactonas
sesquiterpénicas
- Diterpenos
- Polisacáridos
Analizar la actividad
antimicrobiana de los
compuestos volátiles
extraídos de Z.
rhoifolium Lam., a
través del método de
difusión en agar con
discos frente a
bacterias y levaduras
de referencia
internacional.
Actividad
antimicrobiana
Bacterias Gram
positivas
Bacterias Gram
negativas
Levaduras
- Staphylococcus
aureus
- Enterococcus
faecalis
- Escherichia coli
- Klesiella
pneumoniae
- Pseudomonas
aeruginosa
- Candida albicans
- Candida krusei
Determinar el potencial
antioxidante total de los
compuestos extraídos
de Z. rhoifolium Lam., a
través de varios test,
como la Capacidad
Antioxidante sobre el
Radical Hidroxilo,
método del ABTS o
Ensayo de
Decoloración en
solución etanólica y la
Determinación de la
Concentración de
Proteínas.
Actividad
antioxidante
Metabolitos
secundarios con
características
antioxidantes
Decoloración en
solución etanólica,
cambio en las
absorbancia.

18. Enfoque de la Investigación
Se plantea un enfoque mixto, en el que se presentaran los resultados tanto
cualitativos como cuantitativos.
Lógica de la Triangulación
Tipo y Diseño de la Investigación
Tipo de investigación explicativa
Diseño experimental y transversal
Población y Muestra
La población Zanthoxylum rhoifolium Lam., (Rutaceae)
presente en el estado Mérida – Venezuela.
La muestra no probabilística integrada por la recolección de dos (2) kilos de hojas de
la especie vegetal
18
Marco Metodológico
Gómez, 2006; Blaxter y col., 2008; Hurtado, 2008; Arias, 2006; Hernández y col., 2010; Lerma, 2004.

19. 19
Skoog et al., 2001; Rojas et al., 1999; Takeoka et al., 1986; Sandra and Bicchi, 1987; Davies, 1990; Adams, 1995.
Cromatografía de Gases Acoplada a
Espectrometría de Masas (CG-EM)
Extracción del Aceite Esencial
Cálculo de los Índices de Kováts
Marco Metodológico
Procedimientos de la Investigación
Instituto de
Investigaciones de la
Facultad de Farmacia y
Bioanálisis (IIFFB) de la
Universidad de Los Andes,
Mérida, Venezuela.

20. 20
Pruebas de susceptibilidad Antimicrobiana
Método de Difusión en Agar con Discos
Impregnación de los Discos
Preparación del Inoculo Bacteriano
Rodríguez , 2005; Velasco y col., 2007; Forbes y col., 2009; Rodríguez , 2005; Rondón y col., 2005; Romero, 2007.
Análisis Microbiológico
Laboratorio de Síndromes
Gastrointestinales y Urinarios
“Lic. Luisa Vizcaya” (S.G.U.),
Departamento de Microbiología y
Parasitología, Facultad de Farmacia y
Bioanálisis de la Universidad de Los
Andes
Marco Metodológico
Procedimientos de la Investigación

21. Marco Metodológico
Procedimientos de la Investigación
21
Concentración Inhibitoria Mínima
Control Negativo
(dimetil-sulfoxido DMS)
Romero, 2007.
Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana
Numero
de
dilución
Volumen
de aceite
Volumen de
dimetil
sulfoxido
Volumen
total μl
Concentraci
ón en
μg/mL
1 14,7 μl 0,3 15 980
2 14,4 μl 0,6 15 960
3 14,1 μl 0,9 15 940
4 13,8 μl 1,2 15 920
5 13,5 μl 1,5 15 900
6 13,2 μl 1,8 15 880
Microorganismos Control Positivo
Staphylococcus aureus
ATCC 6538
Oxacilina® (10μg/10 μg)
Enterococcus faecalis
ATCC 29212
Vancomicina® (30 μg)
Escherichia coli
ATCC 25922
Trobamicina® (10 μg)
Klebsiella pneumoniae
ATCC 23357
Aztreonam® (30μg)
Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853
Ceftazidima® (30 μg)
Candida albicans
CDC B-385
Fluconazol® (100 μg)
Candida krusei
ATCC 6258
Fluconazol® (100 μg)

22. Marco Metodológico
Procedimientos de la Investigación
Test de Actividad Antioxidante
22
Díaz, 2011; Lowry et al., 2010; Roberta et al., 1999; Halliwell et al., 1987.
y = 9,144x - 0,0208
R² = 0,9831
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 0,05 0,1 0,15
Series1
Lineal
(Series1)
y = 0,0036x + 0,0277
R² = 0,9778
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 50 100 150
y = 0,0714x + 0,0496
R² = 0,9958
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
0 5 10

23. 23
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
COMPOSICIÓN QUÍMICA
Picos Componentes TR (min) Área (%) I Kobs I Kref
1 3-Hexen-1-ol 3.608 1.36 845 769
2 2-Hexen-1-ol 3.755 0.19 856 863
3 α-Pineno 5.017 2.47 934 932
4 β-Pineno 5.967 0.38 975 974
5 Mirceno 6.242 0.16 986 988
6 Limoneno 7.246 3.21 1027 1024
7 Trans-β-Ocimeno 7.744 0.15 1046 1032
8 Acetato de Bornil 15.156 0.26 1290 1287
9 α-Elemeno 16.807 0.71 1339 1342
10 α-Cubebeno 17.187 0.22 1350 1345
11 α-Copaeno 18.031 1.72 1373 1374
12 β-Bourboneno 18.314 0.49 1381 1387
13 β-Cubebeno 18.474 0.64 1385 1387
14 β-Elemeno 18.537 1.82 1387 1389
15 Cis-Cariofileno 19.403 4.06 1413 1408
16 γ-Elemeno 19.808 0.38 1428 1434
17 α-Humuleno 20.433 0.82 1451 1452
18 Germacreno-D 21.399 42.99 1484 1484
19 T-Muuroleno 21.615 0.80 1491 1486
20 Biciclogermacreno 21.805 13.09 1498 1500
21 Germacreno-A 22.033 2.74 1505 1508
22 δ-Cadineno 22.526 1.51 1521 1513
23 Germacreno-B 23.590 16.23 1555 1559
24 Ent-Spathulenol 24.118 0.70 1571 1576
25 Tau-Cadinol 26.279 0.53 1649 1638
Adewale, 2009; Adams, 1995; Moura et al., 2006; Boehme et al., 2008; De Abreu Gonzaga et al., 2003.

24. 24
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
COMPOSICIÓN QUÍMICA
Adewale, 2009; Adams, 1995; Moura et al., 2006; Boehme et al., 2008; De Abreu Gonzaga et al., 2003.
Principales Componentes del Aceite Esencial de Z. rhoifolium Lam.

25. 25
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
Smith y col., 1998; Ryan y Ray, 2005.
Microorganismos
Zona de Inhibición (mm)*
CIM
μL/mL
Aceite
esencial
Hojas
Controles Positivos
OX VA NN AZT CAZ FLU VOR
Staphylococcus
aureus
ATCC 25923
9* 23* 920
Enterococcus
faecalis
ATCC 29212
NA 23*
-
Escherichia coli
ATCC 25922 NA 19*
-
Klebsiella
pneumoniae
ATCC 23357
NA 33* -
Pseudomonas
aeruginosa
ATCC 27853
NA 31* -
Candida
albicans
CDC B-385
NA 30* -
Candida krusei
ATCC 6258
NA 30* -

26. 26
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE
Muestra Proteínas Fenoles ABTS
Aceite esencial de las
hojas
1504,5 ± 36,1 475,1 ± 37,3 236,7 ± 11,2
Quercitina 1mM 100,6 ± 1,7 ª
Melatonina 1mM 97,6 ± 5,1 ª
Ac. lipoico 1mM 124,7 ± 3,1 ª
R2 0,990 0,992
Se expresan los valores experimentales el error estándar. Las curvas fueron
correlacionadas con modelos exponenciales dando coeficientes de correlación
p > 0.980.
Suhaj, 2004; Hyun-Jin et al., 2004, Juteau et. al., 2002; Souza et al., 2007.

27. 27
• En la evaluación de la CIM (µL/mL) del aceite de hojas de Zanthoxylum rhoifolium
Lam., a una concentración de 920 μg/mL, presentó actividad contra S. aureus, lo que
permite inferir que es a altas concentraciones cuando este aceite podría ser
empleado como alternativa terapéutica en caso de infección por Staphylococcus
aureus.
• La especie Zanthoxylum rhoifolium Lam., presenta una alta variabilidad en su
rendimiento al momento de la extracción, si esta se realiza en distintas épocas del año
y bajo distintas condiciones de suelo, lo que promete resultados satisfactorios en su
época de floración (se obtuvo 1 mL de aceite a partir de los 989,18 g de hojas
recolectadas).
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
CONCLUSIONES
• El aceite esencial de Zanthoxylum rhoifolium Lam., no presento actividad contra
bacterias Gram negativas ni las levaduras ensayadas.
• En la extracción del aceite esencial de las hojas de la especie Zanthoxylum rhoifolium
Lam., se identificaron 25 componentes estructurales, los cuales representan el
97,63% del total del aceite extraído. Siendo los mayoritarios Germacreno-D (42,99%),
el Germacreno-B (16,23%), el Biciclogermacreno (13,09%), Cis-Carofileno (4,06%) y el
Limoneno (3,21%), los cuales han sido descritos en otros estudios relacionados con el
género Zanthoxylum sp.

28. 28
• Los test aplicados para determinar la actividad antioxidante fueron: La capacidad
antioxidante sobre el radical hidroxilo, método del ABTS o ensayo de decoloración en
solución etanólica y la determinación de la concentración de proteínas. Dichas
técnicas fueron validadas midiendo la capacidad antioxidante de la quercitina, la
melanina y el ácido lipoico.
• Finalmente, es importante destacar que es la primera vez que en
Venezuela se realiza el estudio de la actividad antimicrobiana en
levaduras y antioxidante del aceite esencial de las hojas de esta
especie vegetal.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
CONCLUSIONES
• Los ensayos aplicados revelaron que la capacidad antioxidante es mayor en el aceite
de las hojas del Zanthoxylum rhoifolium Lam., que en los compuestos puros que se
utilizaron en comparación, lo que indica que alguno de los componentes que
constituyen la fracción más pesada del aceite, es la que tiene mayor poder
antirradical.

29. 29
 Estudiar la acción de los aceites de frutos y hojas de la especie Zanthoxylum
rhoifolium Lam., en al menos dos épocas diferentes del año ya que por medio de
esta investigación se logró observar que varía su rendimiento durante el cambio
de estaciones al momento de la extracción, lo que puede dejar como incógnita si
también varía su actividad antimicrobiana.
 Evaluar las propiedades antioxidantes con otros métodos ya que al presentar
resultados positivos con una extracción de bajo rendimiento, sugiere que esta
incremente en los periodos fértiles de la planta.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
RECOMENDACIONES

30. Cree en TI y en
TU fuerza
con soberbia y
seguridad.. 30