1. Universidad de Chile
Facultad de Medicina
Escuela de Tecnología Médica
Curso de Microscopía Electrónica
Presentador:
Kenneth Walker

2. Objetivo
Investigadores solicitan nuestra participación para
el diseño de un protocolo basado en el uso de la
técnica GFP-ImmunoGold con el objetivo de
comprobar diferenciación neuronal en modelos
murinos post-trasplante intracraneal de células
ganglionares

3. Materiales y métodos
 Se dispone de ratones a los que se les realizó
un trasplante intracraneano de células
ganglionares derivada de la eminencia media.

4. Surgen las siguientes interrogantes
 ¿Qué modelo murino se está utilizando para llevar a cabo los
procedimientos? ¿Es el típico Mus musculus?
 ¿Fue un modelo inmunodeprimido?¿Qué edad?
 ¿Cuál es el origen de las células trasplantadas?¿Es humano?
 ¿Cuál es el estímulo para que las células se diferencien a
neuronas maduras?
 ¿En qué sitio del cerebro murino se espera observar la
diferenciación? ¿Acaso es en la zona de inoculación?
Es esencial conocer al detalle el contexto del estudio que se quiera
realizar antes de comenzar el diseño de un protocolo que involucre
ME.

5. Suponiendo que…
 El modelo de estudio es Mus musculus.
 Acepta el trasplante pues es un modelo
inmunodeprimido.
 Las células para trasplantar son de origen
humano (xenotransplante).
 Que el proceso de trasplante es por inoculación.
 El estímulo que gatille la diferenciación sea el
microambiente
producto
del
daño
del
procedimiento quirúrgico.

6. Resultados esperados por
investigadores
Al cabo de 30 días se espera observar:
• Diferenciación de células ganglionares
trasplantadas a neuronas maduras.
humanas
• Se espera ver esta situación en la zona de inoculación.
Se sugiere realizar un muestreo del cerebro del animal para
comprobar la migración de las células en caso de que
disminuya su cantidad en la zona de inoculación.

7. Generalidades
La eminencia media se ubica en la base del hipotálamo y
sirve como interfaz entre el sistema neural y sistema
endocrino periférico.
Es el sitio donde las hormonas hipotalámicas son vertidas al
lecho capilar portal para ser transportadas a la pituitaria
anterior, que proporciona señales bioquímicas adicionales
para dirigirlas a los sistemas endocrinos.

8. Resultados para estudios de Síndrome de West
(SW) demuestran que los progenitores neurales fetales
derivados de la eminencia ganglionar media (MGE) se
diferencian hacia interneuronas GABAérgicas tras ser
implantadas en el cerebro neonatal y adulto en modelos
animales (CABIMER. CSIC. Sevilla).
El síndrome de West (SW) o síndrome de los espasmos infantiles es una
encefalopatía epiléptica de la infancia, grave y poco frecuente, que debe su nombre
a William James West (1793-1848), médico inglés que describió por primera vez el
cuadro (presente en su propio hijo)

9. http://es-cl.invitrogen.com/

10. GFP; 26,9 kDa; 717 bp
http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/

11. http://es-cl.invitrogen.com/

12. http://mouse.brain-map.org/static/atlas

13. http://mouse.brain-map.org/static/atlas

14. http://es-cl.invitrogen.com/

15. Salomé et al.

16. Comprobar la transfección
http://tissuediagnostics.com/

17. www.acris-antibodies.com

18. Trasplante
Salomé et al.

19. Luego de 30 días…

20. Procesamiento de muestra
Asumiendo que la GFP corresponde a un Ag no lábil, colocar la
muestra en la solución fijadora y lavar.
 Usar Paraformaldehido al 4% p/v + Glutaraldehído 1% + 0.5 mM
clorhidrato de calcio por 3hrs a T° ambiente o 24hrs a 4°C.
 Lavado en frío con una solución de sucrosa al 3.5% en buffer
fosfato salino 0.1M por 2hrs.
 Lavado en una solución de clorhidrato de amonio 50 mM en
buffer sucrosa-fosfato + clorhidrato de calcio 0.5mM a pH 7.4
por 1hr a 0°C.
 Lavar en frío con buffer maleato 0,1M con sucrosa al 3.5%.
Utilizado para la remoción de iones fosfato pH 6.5.
Luego, deshidratar en acetonas ascendentes.

21. La infiltración y polimerización a baja T° favorece la reactividad
antigénica.
 Lowicryl: Resina de baja viscosidad a baja T°
 La polimerización con radiación UV es independiente de la T° lo
que le permite polimerizar a la T° de infiltración en un tiempo mayor
o igual a 24hrs.
 Estas resinas también pueden polimerizar químicamente a 60°C (2
a 3 días).

22. Impregnación e inclusión
The Progressive Lowering of Temperature (PTL) Method
For Resin
Concentration
of solvent
KM4 & HM20
30%
50%
70%
100%
Time in min
T in°C
30 min
60 min
60 min
2x60min
0
-20
-35
-50
http://www.emsdiasum.com/

23. Muestra de la zona de
trasplante
Cerebro
murino
GFP (-)
Semifino: Usar para la
observación al microscopio de
fluorescencia para comprobar si
el área seccionada tiene GFP y
re-tallar pirámide trunca.
GFP(+)
Fino: Usar para la observación al
MET. Se continúa procesando
para obtener GFP visible a través
de ImmunoGold.

24. ImmunoGold
 Bloqueo con suero de cabra o fetal bovino al 5% por 10
min, diluido en TBS
 Ac primario contra GFP* en TBS + NGS (2.5% suero de
cabra, 2 mM HEPES, pH 7.2) al 1%
 Ac secundario contra FC* conjugado con Au en TBS
 Pasar por GA al 2% por 5 minutos para estabilizar los complejos
Ag-Ac.
Nunca olvidar los tejidos controles a lo largo del procedimiento que son
necesarios para validar la técnica y el estudio mismo.
Acs. Hechos en especies distintas para evitar reacciones cruzadas.

25. Contraste
Acetato de uranilo al 4% por 10 min.
y citrato de plomo de Reynolds 5 min.
Tetróxido de osmio 2% por 15min. Y citrato de
plomo de Reynold 3min

26. Montaje
Los cortes siempre son sensibles al haz
de electrones. Para mejorar su
resistencia, cubrirlos con FORMVAR en
una etapa final. Esto permitirá el mejor
acceso de los anticuerpos por ambos
lados del corte.

27. Resultados hipotéticos

28. GFP+ medial ganglionic eminence-derived cells were identified after GFP immunogold staining as mature
neurons 30 day after transplantation into the brain. The left picture shows a panoramic view of a mature
neuron (scale-bar= 2µm). The right picture is a higher magnification image showing morphoogical details such
as RER, mitochondria, synapsis (arrows) or nuclear pores.

29. Cromatina fina
Nucléolo
Envoltura nuclear
Aparato de Golgi
RER
Mitocondrias

30. Microfotografía electrónica por MET. Se observa una sinapsis en la que el botón sináptico (1) se encuentra
cargado de vesículas de secreción (NT).

31. Conclusiones
 El método vela por la mantención de la mejor morfología y antigenicidad.
 El método proporciona un buen contraste entre estructuras y marcaje.
 La técnica satisface los requerimientos de la investigación.
 Se requiere más información inicial para precisar el protocolo a seguir.
 El estudio implica más técnicas a parte de la ME.

32. Bibliografía
1.
H.K. Sreepathi, F. Ferraguti, Subpopulations of neurokinin 1 receptor-expressing neurons in the rat lateral amygdala display
a differential pattern of innervation from distinct glutamatergic afferents, Neuroscience, Volume 203, 17 February 2012,
Pages 59-77, ISSN 0306-4522.
2.
Berryman MA, Rodewald RD. An enhanced method for post-embedding immunocytochemical staining which preserves cell
membranes. J Histochem Cytochem. 1990 Feb;38(2):159-70.
3.
José M. Gallego, Francisco J. Sancho, Sandra Vidueira, Laura Ortiz, Ulises Gómez-Pinedo, Juan A. Barcia, Injection of
embryonic median ganglionic eminence cells or fibroblasts within the amygdala in rats kindled from the piriform cortex,
Seizure, Volume 19, Issue 8, October 2010, Pages 461-466, ISSN 1059-1311.
4.
M. Salomé Sirerol-Piquer, Arantxa Cebrián-Silla, Clara Alfaro-Cervelló, Ulises Gomez-Pinedo, Mario Soriano-Navarro, JoséManuel García Verdugo, GFP immunogold staining, from light to electron microscopy, in mammalian cells, Micron, Volume
43, Issue 5, April 2012, Pages 589-599, ISSN 0968-4328
5.
http://mouse.brain-map.org/static/atlas
6.
http://es-cl.invitrogen.com/

33. Stereotactic surgery
•
Works on the basis of three main components:
•
A stereotactic planning system, including atlas, multimodality image matching tools, coordinates
calculator, etc.
•
A stereotactic device or apparatus
•
A stereotactic localization and placement procedure
•
Modern stereotactic planning system are computer based. The stereotactic atlas is a series of
cross sections of anatomical structure (for example, a human brain), depicted in reference to a
two-coordinate frame. Thus, each brain structure can be easily assigned a range of three
coordinate numbers, which will be used for positioning the stereotactic device. In most atlases, the
three dimensions are: latero-lateral (x), dorso-ventral (y) and rostro-caudal (z).
•
The stereotactic apparatus uses a set of three coordinates (x, y and z) in an orthogonal frame of
reference (cartesian coordinates), or, alternatively, a polar coordinates system, also with three
coordinates: angle, depth and antero-posterior location. The mechanical device has head-holding
clamps and bars which puts the head in a fixed position in reference to the coordinate system (the
so-called zero or origin). In small laboratory animals, these are usually bone landmarks which are
known to bear a constant spatial relation to soft tissue. For example, brain atlases often use
the external auditory meatus, the inferior orbital ridges, the median point of the maxilla between
the incisive teeth. or the bregma (confluence of sutures of frontal and parietal bones), as such
landmarks. In humans, the reference points, as described above, are intracerebral structures
which are clearly discernible in a radiograph or tomograph.

34. Vibrótomo