Successfully reported this slideshow.
Universidad de Chile
Facultad de Medicina
Escuela de Tecnología Médica
Curso de Microscopía Electrónica

Presentador:
Kenn...
Procesamiento de muestra
 Usar Paraformaldehido al 4% p/v + Glutaraldehído 1% + 0.5 mM
clorhidrato de calcio por 3hrs a T...
La infiltración y polimerización a baja T° favorece la reactividad
antigénica.
 Lowicryl: Resina de baja viscosidad a baj...
Impregnación e inclusión
The Progressive Lowering of Temperature (PTL) Method

For Resin

Concentration
of solvent
KM4 & H...
ImmunoGold
 Bloqueo con suero de cabra o fetal bovino al 5% por 10 min,
diluido en TBS
 Ac primario contra la proteína b...
Contraste

Acetato de uranilo al 4% por 10 min.
y citrato de plomo de Reynolds 5 min.

Tetróxido de osmio 2% por 15min. Y ...
Montaje

Los cortes siempre son sensibles al haz
de electrones. Para mejorar su
resistencia, cubrirlos con FORMVAR en
una ...
Resultados hipotéticos
GFP+ medial ganglionic eminence-derived cells were identified after GFP immunogold staining as mature
neurons 30 day after...
Cromatina fina
Nucléolo

Envoltura nuclear
Aparato de Golgi

RER

Mitocondrias
Microfotografía electrónica por MET. Se observa una sinapsis en la que el botón sináptico (1) se encuentra
cargado de vesí...
Conclusiones

 El método vela por la mantención de la mejor morfología y antigenicidad.
 El método proporciona un buen c...
Bibliografía

1.

H.K. Sreepathi, F. Ferraguti, Subpopulations of neurokinin 1 receptor-expressing neurons in the rat late...
Próxima SlideShare
Cargando en…5
×

Protocolo de trabajo para met

345 visualizaciones

Publicado el

Publicado en: Salud y medicina
  • Sé el primero en comentar

  • Sé el primero en recomendar esto

Protocolo de trabajo para met

  1. 1. Universidad de Chile Facultad de Medicina Escuela de Tecnología Médica Curso de Microscopía Electrónica Presentador: Kenneth Walker
  2. 2. Procesamiento de muestra  Usar Paraformaldehido al 4% p/v + Glutaraldehído 1% + 0.5 mM clorhidrato de calcio por 3hrs a T° ambiente o 24hrs a 4°C.  Lavado en frío con una solución de sucrosa al 3.5% en buffer fosfato salino 0.1M por 2hrs.  Lavado en una solución de clorhidrato de amonio 50 mM en buffer sucrosa-fosfato + clorhidrato de calcio 0.5mM a pH 7.4 por 1hr a 0°C.  Lavar en frío con buffer maleato 0,1M con sucrosa al 3.5%. Utilizado para la remoción de iones fosfato pH 6.5. Luego, deshidratar en acetonas ascendentes.
  3. 3. La infiltración y polimerización a baja T° favorece la reactividad antigénica.  Lowicryl: Resina de baja viscosidad a baja T°  La polimerización con radiación UV es independiente de la T° lo que le permite polimerizar a la T° de infiltración en un tiempo mayor o igual a 24hrs.  Estas resinas también pueden polimerizar químicamente a 60°C (2 a 3 días).
  4. 4. Impregnación e inclusión The Progressive Lowering of Temperature (PTL) Method For Resin Concentration of solvent KM4 & HM20 30% 50% 70% 100% Time in min T in°C 30 min 60 min 60 min 2x60min 0 -20 -35 -50 http://www.emsdiasum.com/
  5. 5. ImmunoGold  Bloqueo con suero de cabra o fetal bovino al 5% por 10 min, diluido en TBS  Ac primario contra la proteína buscada en TBS + NGS (2.5% suero de cabra, 2 mM HEPES, pH 7.2) al 1%  Ac secundario contra FC* conjugado con Au en TBS  Pasar por GA al 2% por 5 minutos para estabilizar los complejos Ag-Ac. Nunca olvidar los tejidos controles a lo largo del procedimiento que son necesarios para validar la técnica y el estudio mismo. Acs. Hechos en especies distintas para evitar reacciones cruzadas.
  6. 6. Contraste Acetato de uranilo al 4% por 10 min. y citrato de plomo de Reynolds 5 min. Tetróxido de osmio 2% por 15min. Y citrato de plomo de Reynold 3min
  7. 7. Montaje Los cortes siempre son sensibles al haz de electrones. Para mejorar su resistencia, cubrirlos con FORMVAR en una etapa final. Esto permitirá el mejor acceso de los anticuerpos por ambos lados del corte.
  8. 8. Resultados hipotéticos
  9. 9. GFP+ medial ganglionic eminence-derived cells were identified after GFP immunogold staining as mature neurons 30 day after transplantation into the brain. The left picture shows a panoramic view of a mature neuron (scale-bar= 2µm). The right picture is a higher magnification image showing morphoogical details such as RER, mitochondria, synapsis (arrows) or nuclear pores.
  10. 10. Cromatina fina Nucléolo Envoltura nuclear Aparato de Golgi RER Mitocondrias
  11. 11. Microfotografía electrónica por MET. Se observa una sinapsis en la que el botón sináptico (1) se encuentra cargado de vesículas de secreción (NT).
  12. 12. Conclusiones  El método vela por la mantención de la mejor morfología y antigenicidad.  El método proporciona un buen contraste entre estructuras y marcaje.  La técnica satisface los requerimientos de la investigación.  Se requiere más información inicial para precisar el protocolo a seguir.  El estudio implica más técnicas a parte de la ME.
  13. 13. Bibliografía 1. H.K. Sreepathi, F. Ferraguti, Subpopulations of neurokinin 1 receptor-expressing neurons in the rat lateral amygdala display a differential pattern of innervation from distinct glutamatergic afferents, Neuroscience, Volume 203, 17 February 2012, Pages 59-77, ISSN 0306-4522. 2. Berryman MA, Rodewald RD. An enhanced method for post-embedding immunocytochemical staining which preserves cell membranes. J Histochem Cytochem. 1990 Feb;38(2):159-70.

×