Proyecto

2. ÍNDICE
- Justificación, antecedentes y marco teórico
- ¿Qué son las Chlorellas? ¿Por qué nos interesa estudiar las microalgas?
- La cinética de crecimiento en microalgas.
- Objetivo
- Método
- Método empleado para la obtención de cepas de Chlorellas a partir del suelo.
- Método empleado para la determinación del indice de Margalef.
- Método empleado para la determinación de la cinética de crecimiento.
- Resultados
- Resultados del método empleado para la obtención de cepas de Chlorellas a partir del
suelo.
- Resultado del método empleado para la determinación del indice de Margalef.
- Resultado del método empleado para la determinación de la cinética de crecimiento.
- Conclusiones
- Agradecimientos
- Bibliografía

3. JUSTIFICACIÓN, ANTECEDENTES Y MARCO TEÓRICO
Qué es Chlorella y por qué nos interesan estudiar las microalgas
Chlorella (nombre común clorela) es un género de algas verdes unicelulares del filo
Chlorophyta. Tienen forma esférica midiendo de 2 a 10 μm de diámetro y no poseen
flagelo. Chlorella contiene los pigmentos verdes fotosintetizadores clorofila-a y -b en sus
cloroplastos. A través de la fotosíntesis se multiplica rápidamente, requiriendo sólo
dióxido de carbono, agua, luz solar y pequeñas cantidades de minerales. Chlorella es un
organismo experimental ampliamente utilizado en los laboratorios. Su uso permitió a Otto
Heinrich Warburg ganar el premio Nobel de Medicina en 1931 por sus estudios sobre la
fotosintesis. En 1961, Melvin Calvin recibió el premio Nobel de química por su estudio
sobre la asimilación del CO2 en plantas usando Chlorella en sus investigaciones (Figura 1).
Figura 1. La fotografía muestras varias células algales del genero Chlorella.
Chlorella presenta una eficiencia fotosíntetica que puede alcanzar el 8%
(comparables con otros cultivos como la caña de azucar). Además presenta una alta
proporción de nutrientes esenciales para el ser humano (figura 2).
Figura 2. Composición general por cada 100 gramos de Chlorella.

4. Estas características hicieron que los cultivos de Chlorella se vieran a fines de la
década de 1940 como una posible solución a la crisis mundial de alimentos. Finalmente se
demostró que la eficiencia fotosíntetica de Chlorella disminuye hasta reducirse a los
valores similares de un cultivo tradicional (aproximadamente un 2,5%) cuando en vez de
usar iluminación artificial es expuesta a la luz solar. Esto unido a otros problemas técnicos
como el uso de agua carbonatada que se requiere para su cultivo y que encarece su
producción, así como los procesos complejos que se requieren para su cosecha hizo que se
abandonase esta idea (Belasco, 1977).
En la actualidad el uso de la Chlorellas se esta extendiendo a campos muy diferentes
(figura 3)
Figura 3. Principales áreas de utilización de las microalgas (Forján et al. A. Al 2014).
Algunos estudios realizados en animales demostraron que la administración de
Clorela puede tener efectos antitumorales y de control de la hipertensión (Tanaka et al.,
1990; Miyazawa et al., 1988; Konishi et al., 1985). Otra línea de investigación usa las
Clorelas para la obtención de biodiesel a partir del aceite que se obtiene de sus cultivos
(Han Su et al., 2009). Por último su capacidad para crecer en medios con altos niveles de
nitratos y fosfatos hace que sea utilizada como un filtro verde a la hora de tratar aguas
residuales.
Como ejemplo podemos citar el proyecto llevado a cabo por el departamento de la
universidad que llevó nuestro proyecto. Este proyecto recibe el nombre de Life Plus
Integral Carbon.

5. Cinética de crecimiento.
En la actualidad los cultivos masivos de algas tienen lugar en lagunas de oxidación
cuando se trata de depurar aguas residuales y en fotobiorreactores cuando se trata de
obtener alimentos o compuestos de alto valor económico (figura 4). Los fotobiorreactores
deben permitir el control de los parámetros que aseguren una alta productividad como
son: el pH, la taxa de oxígeno y dióxido de carbono, los macro y micronutrientes, la
salinidad, la temperatura, la aireación que permitan la homogenización del medio, la luz y
la concentración de células.
Figura 4. La fotografía de la izquierda muestra una laguna de oxidación. La fotografía de la derecha muestra
diferentes modelos de fotobiorreactores.
Hay que tener en cuenta que el crecimiento algal se rige por la ley del mínimo, es
decir, el factor limitante del crecimiento es aquel que está presente en cantidades más
próximas al mínimo crítico necesario para la microalga. Es importante conocer las
condiciones óptimas y los límites de tolerancia de una microalga para todos o el mayor
número de parámetros (Cañizares.1994). Para conocer el valor óptimo de estos parámetros
antes de iniciar un cultivo a escala industrial se experimenta con cultivos estáticos. Un
cultivo estático es un recipiente que contiene una población de algas en unas condiciones
determinadas. En un cultivo estático se observa que las algas presentan una cinética de
crecimiento estándar que es común a todas las especies y es independiente del volumen
del medio donde es cultivada. Este patrón estándar presenta las siguientes fases (Figura 5)
(Fogg y Thake, 1987):
Lag o fase de adaptación: en donde no ocurre incremento en el número de células,
pudiendo incluso llegar a disminuir en número con respecto al inoculo inicial.
Exponencial: una vez adaptadas al medio de cultivo, las microalgas comienzan a
multiplicarse de forma exponencial.
Declinación: El aumento del número de células produce una disminución de los
nutrientes, cambios en el pH y alteración de otros factores que provocan una disminución
en la tasa de división celular.
Estacionaria: No se aprecia una división celular neta, es decir, se mantiene constante la
tasa entre la natalidad y la mortalidad.
Muerte: La tasa de mortalidad supera a la tasa de natalidad.

6. Los cultivos estáticos nos permiten averiguar cuáles son las condiciones más
óptimas para mantener crecimiento exponencial en las poblaciones de algas a escala
industrial.
Figura 5. Curva representativa de crecimiento de un cultivo estático de microalgas (Modificado de Fogg y
Thake, 1987). 1.- Fase de adaptación; 2.- Fase de crecimiento exponencial; 3.- Fase de declinación relativa de
crecimiento; 4.- Fase estacionaria; 5.- Fase de muerte.
OBJETIVO
El objetivo del proyecto es obtener un cultivo puro de Chlorella sp. a partir de
diferentes muestras y estudiar su cinética de crecimiento así como algunos factores de
cultivo que pueden afectar a la misma. La finalidad última de estas cepas extraídas del
suelo, sería hacerlas crecer en agua residual para incorporar CO2 y nutrientes y finalmente
retornarlas al suelo como biofertilizantes.
MÉTODO
El método seguido consta de varias etapas:
- Obtención y purificación de las algas a partir de diferentes muestras tomadas en el
campo.
- Determinación del índice de Margalef.
- Determinación de la cinética de crecimiento.

7. Método empleado para la obtención de algas a partir de muestras de suelo.
Se tomaron muestras de cuatro localidades distintas donde trabajos anteriores nos
habían indicado la presencia de Chlorella. Estas localidades son:
a) Aldea del Obispo (Salamanca). Fecha 5 de octubre de 2015. Coordenadas 40º42'30,7''N
6º47'45,1''W. Agua de la fuente del pueblo
b) Torrecilla del Pinar (Segovia). Fecha 10 de octubre de 2015. Coordenadas 41º22'15,2''N
4º02'24,1''W. Tierra del pinar
c) Burgos (Burgos). Fecha 30 de septiembre de 2015. Coordenadas 42º 20´35,1'' N 3º39´44,9''
W. Arena de la playa de Fuentesblancas
d) Burgos (Burgos). Fecha 30 de septiembre de 2015. Coordenadas 42º21´14,2'' N 3º39´59,6''
W- Suelo del Instituto.
A partir de estas muestras se realiza una siembra en tres medios diferentes:
1) BG 11 (Grobbelaar, 2013) (Figura 6) este medio se caracteriza por tener todos los macro
y micronutrientes que necesita un alga para su desarrollo.
2) BG 11 sin NO3 este medio que no tiene fuente de nitrógeno se emplea para favorecer el
desarrollo de aquellas algas o cianobacterias que son capaces de fijar nitrógeno del aire.
3) BG 11 + DOC que es un extracto que contiene moléculas orgánicas que algunas algas
requieren para su desarrollo como son vitaminas.
Composición del
medio BG11
K2HPO4 (1mL); NaNO3 (10 mL); MgSO4 (1mL); CaCl2 (1mL);
Na2CO3 (1mL); Na2SiO3 (1mL); ácido cítrico + EDTA (Etilen-
diamino-tetraacético, sal disódica) + cloruro férrico (1mL); silicato (1
mL); Micronutrientes (1mL); Agua destilada (enrasar a 1L)
Figura 6. Composición del medio BG11 (Grobbelaar J.U. 2013). Este medio es esterilizado en un autoclave
antes de su uso.
En el laboratorio, se utiliza una cabina de flujo laminar, se coge 4 placas de 12
pocillos esterilizadas y en cada una de estas echamos 0’5 ml de cada muestra de suelo con
ayuda de una pipeta automática. Después con una pipeta de doble enrase echamos 3’5 ml
de un tipo de medio diferente de forma que en cada placa hubiera 4 pocillos con el mismo
medio, en la primera fila de pocillos echamos BG11, en la segunda BG11 sin NO3 y en la
tercera BG11 +DOC (Figura 6). Las cuatro placas se mantienen a temperatura constante y
están expuestas a las variaciones naturales de luz (figura 7).

8. Figura 7. La fotografía muestras las cuatro placas de doce pocillos. De izquierda a derecha: MB es la muestra
de Torrecilla del Pinar; MC, Instituto; MD, Fuentesblancas y MA, Aldea del Obispo. Cada columna de la
placa presenta el encabezamiento del medio BG11, BG11 - NO3
2
y BG 11 + DOC. El experimento se inició el 1
de octubre de 2015.
Cuando las algas se desarrollan en los pocillos, utilizando asas de siembra se hace
un replicado de las algas a placas de Petri. Las placas de Petri contienen como medio de
cultivo BG 11. En este caso al BG 11 se le añade 11 g de agar por litro. El medio fue
esterilizado en un autoclave a 120º C durante dos horas. Después de sacarlo del autoclave
se deja atemperar hasta alcanzar una temperatura de 50º, para echarlo a continuación en
unas placas de Petri también esterilizadas. Una vez solidificado se usa una cabina de flujo
laminar para replicar las muestras. Es importante cambiar el asa de siembra siempre y
cuando cambiemos de muestra. Una vez que se tienen preparadas las placas se meten en
una cámara climática ( marca Ibercex) a una temperatura de 25 ºC y con un fotoperiodo de
16:8 horas de luz: oscuridad y un nivel de iluminación PAR (radiación fotosintéticamente
activa) de 100 micromol m-2
· s-1
(Figura 8).
Figura 8. Fotografía del interior de la cámara climática. Se observan las placas de Petri. La letra A indica que
corresponde a Aldea del Obispo. Observar que cada placa se encuentra envuelta en papel parafinado para
evitar la pérdida de agua.

9. Cuando las algas se han desarrollado sobre las placas Petri, pasamos a tomar
muestras para observarlas al microscopio y poder determinar si realmente tenemos el
género Chlorella en nuestros cultivos (figura 9).
Figura 9. En la fotografía se muestra el microscopio óptico utilizado en la determinación de las algas. Es un
microscopio marca Leica de cuatro objetivos de 10 x 10, 4, 10, 40 y 100 aumentos así como la posibilidad de
zoom digital de hasta x3 aumentos.
A partir de los cultivos que dan positivo en la presencia de Chlorellas se hace un
nuevo replicado en placas de Petri con BG 11 y se cultivan en cámaras climáticas. Tras
varios replicados obtenemos cepas puras de Chlorella sp.. Finalmente empleamos estas
cepas en un cultivo en un medio líquido de BG 11 que se emplea para las fases posteriores
del método, dividiendo este cultivo en dos muestras Chlorella 1 y Chlorella 2 que se
diferencian en que la primera tenía una aireación continua y la segunda una aireación
intermitente. Con el término aireación nos referimos a la renovación del CO2, el que la
tiene continua tiene más concentración de CO2 que el que la tiene intermitente.
Método empleado para la determinación del índice de Margalef.
El índice Margalef se obtiene a partir del cociente entre el valor de la absorbancia de
los carotenos de un extracto algal y la absorbancia de la clorofila a de dicho extracto. Este
cociente nos da una idea del estado de madurez del cultivo de algas. Cuando el valor del
índice es bajo (alrededor de 2) indica que se trata de un cultivo joven con alta
productividad por unidad de biomasa y cuando es alto (de 5 a 7) se trata de un cultivo
maduro con baja tasa de renovación (Margalef, 1983).
Para conseguir los pigmentos cogemos catorce muestras de Chlorella 1 y 2 que se
encontraban en los borboteadores durante veinte días. Para ello, centrifugamos las
muestras durante dos minutos, y así conseguiremos el pelet. Después con una pipeta
automática retiramos el líquido sobrante y añadimos metanol. Finalmente las dejamos en
el frigorífico durante toda la noche. Al día siguiente cogemos con la pipeta automática un
mililitro de cada muestra y lo añadimos en una cubeta para medir la longitud de onda a
(figura 10):
– 750 nm: turbidez de la muestra
– 665 nm: clorofila a

10. – 430 nm: carotenoides
Figura 10. La fotografía muestra el espectofotometro utilizado en el proyecto. Delante de el se situan las
celdas que contienen los extractos de algas.
Método empleado para la elaboración de la Cinética del Crecimiento
Una vez que tenemos nuestro cultivo puro de Chlorellas y que el índice Margalef
nos indica que se trata de un cultivo joven con alta productividad procedemos a
determinar cómo será su cinética de crecimiento. Para ello, el primer paso consiste en
determinar la concentración de células algales que tenemos en nuestro cultivo. Para ello
echamos 10 microlitros de muestra de Chlorella que tenemos en un tubo Falcon en la
cámara Neubauer. Después enfocamos la muestra en el microscopio y una vez localizado
el área de contaje, calculamos el número de células por celda y apuntamos el resultado. La
cámara de Neubauer nos da el número de células por mililitro (figura 11).
Figura 11. Plantilla que se puede observar en la cámara de Neubauer. Dependiendo del número de células
que se cuenten en cada área, indicada por números, se utiliza un índice de transformación para calcular las
células por mL.

11. Figura 12. Gráficas de absorbancia a 750 y a 680 de los cultivos de Chlorella 1 y 2.
A continuación construimos una recta patrón donde relacionamos la concentración de
algas (nº de células/mL) con la absorbancia de la turbidez medida en un
espectrofotómetro a 750 y 680 Para ello hacemos diluciones de nuestro cultivo en BG 11
en las siguientes proporciones:
mL de BG 11 mL de cultivo de Chlorellas
2 0
1,9 0,1
1,8 0,2
1,5 0,5
1 1
0,5 1,5
0 2
Estas gráficas (figura 12) nos sirven para conocer cuántas células hay por mililitro en
función de la turbidez en cualquier momento.
A lo largo de catorce días se toma la absorbancia a 750 y 680 nm de dos cultivos de
Chlorella que designaremos como Chlorella 1 y Chlorella 2. Ambos cultivos se diferencian
porque en uno el borboteador que genera corriente dentro del cultivo y lo oxigenaba
funcionaba a un régimen distinto del otro. Los valores obtenidos se ajusta en una gráfica
donde se expresa en el eje de la Y el nº de células/ mL y en el eje de las X los días. Para
realizar los ajustes estadísticos a los valores de la gráfica empleamos una curva logística
que se obtiene a partir de la ecuación de Verhulst (figura 13). Estos ajustes nos los
realizaron en la universidad utilizando el programa informático SPSS v.18.

12. Figura 13. La gráfica muestra la función logística o curva en forma de S. Es una función matemática que
aparece en diversos modelos de crecimiento de poblaciones. El crecimiento inicial es aproximadamente
exponencial y al cabo de cierto tiempo aparece la competencia por algún recurso crítico que hace que la tasa
de crecimiento disminuya hasta deternerse en la madurez. La gráfica de la función logística responde a la
ecuación de Verhulst (1838) donde P0 es la población inicial, e es la constante de Euler, t es el tiempo, K es
capacidad de carga o población máxima que puede crecer en él y r es la tasa de crecimiento característico de
cada especie.
RESULTADOS
Resultado al método empleado para la obtención de algas a partir de muestras de
suelo.
Tras treinta días a condiciones ambientales se produce un cambio de color en los
pocillos que denotan el crecimiento de algas en su interior (figura 14).
Figura 14. En la fotografía se pueden observar los pocillos donde han crecido algas. De izquierda a derecha:
MA, Aldea del Obispo; MB es la muestra de Torrecilla del Pinar; MC, Instituto y MD, Fuentesblancas Cada
columna de la placa presenta el encabezamiento del medio BG11, BG11 menos NO3
2-
y BG 11 mas DOC.
A partir de las algas crecidas en los pocillos se hacen replicas en placas de Petri que
son cultivadas en cámaras climáticas en las condiciones descritas sobre un medio sólido
formado solo por BG 11 y 10 % de agar. Tras dos semanas de cultivo se obtiene el
resultado que se muestra en la figura 15.

13. Figura 15. La fotografía muestra las placas Petri cultivadas en la cámara climática. Aunque el medio de
crecimiento es el mismo, las letras escritas en las tapas designan los pocillos de los que se tomo una muestra
para hacer la réplica.
A continuación se procede a observar las diferentes colonias al microscopio para
identificar las microalgas formadoras de las colonias (figura 16).
Figura 16. Las fotografías muestran en la parte superior izquierda una colonia de algas filamentosas, a su
derecha una diatomea (Navicula sp.). En la parte inferior izquierda Chlorellas sp. y a la derecha la foto de un
paramecio ciliado que se alimenta de microalgas.
De las colonias de Chlorellas se hacen sucesivos replicados hasta obtener cultivos
puros.

14. Resultado del método empleado para la determinación del índice de Margalef.
A partir de dos cultivos puros que designaremos como Chlorella 1 (Chl-1) y
Chlorella 2 (Chl-2) se procede a seguir el crecimiento del cultivo durante veinte días
tomando catorce muestras. Cada día se toma una muestra para analizar la absorbancia de
los diferentes tipos de pigmentos en el espectrofotómetro (figura 17).
Muestra
Absorbancia Pigmentos Relación Margaleff
750 665 652 430 [Chla] (mg/L) Abs 430/Abs 665
Inoculo 0,002 0,169 0,099 0,340 1,90372 2,012
Chl_1_1 0,001 0,026 0,017 0,111 0,27144 4,269
Chl_2_1 0,003 0,050 0,032 0,149 0,5202 2,980
Chl_1_2 0,000 0,090 0,052 0,202 1,02848 2,244
Chl_2_2 0,003 0,074 0,044 0,191 0,81156 2,581
Chl_1_3 0,002 0,133 0,075 0,274 1,52164 2,060
Chl_2_3 0,003 0,071 0,043 0,184 0,77056 2,592
Chl_1_4 0,003 0,126 0,073 0,278 1,41536 2,206
Chl_2_4 0 0,071 0,042 0,198 0,8024 2,789
Chl_1_5 0,003 0,279 0,155 0,454 3,2224 1,627
Chl_2_5 0,008 0,148 0,086 0,242 1,62632 1,635
Chl_1_6 0,002 0,374 0,207 0,634 4,34204 1,695
Chl_2_6 0,006 0,164 0,093 0,289 1,84484 1,762
Chl_1_7 0,003 0,423 0,233 0,722 4,9156 1,707
Chl_2_7 0,002 0,208 0,115 0,354 2,40924 1,702
Chl_1_8 0,005 0,380 0,212 0,678 4,37388 1,784
Chl_2_8 0,002 0,188 0,105 0,325 2,16644 1,729
Chl_1_9 0,004 0,476 0,266 0,851 5,49192 1,788
Chl_2_9 0,004 0,185 0,105 0,324 2,10116 1,751
Chl_1_10 0,034 0,546 0,321 0,975 5,93172 1,786
Chl_2_10 0,002 0,148 0,084 0,268 1,69 1,811
Chl_1_11 0,004 0,451 0,253 0,823 5,193 1,825
Chl_2_11 0,002 0,187 0,108 0,342 2,12224 1,829
Chl_1_12 0,004 0,492 0,275 0,882 5,677 1,793
Chl_2_12 0,007 0,186 0,109 0,336 2,05856 1,806
Chl_1_13 0,004 0,470 0,263 0,852 5,41908 1,813
Chl_2_13 0,003 0,181 0,105 0,340 2,04184 1,878
Chl_1_14 0,077 0,588 0,363 1,018 5,92416 1,731
Chl_2_14 0,005 0,191 0,112 0,358 2,1298 1,874
Figura 17. En la tabla se muestran los distintos valores de absorbancia registrados a lo largo de 14 días. A
partir de estos datos se puede calcular utilizando diferentes fórmulas una estima de la concentración de
pigmentos en la muestra de agua (Clesceri et al., 1998). En la columna de la derecha se muestra el índice
Margalef.
Calculamos el indice Margalef como el valor de la absorbancia de los carotenoides
dividido por la absorbancia de la clorila a y podemos ver como los valores oscilan durante
el periodo experimental entorno a un valor próximo a dos lo que nos quiere decir que
estamos manejando dos cultivos que se encuentran en una fase joven con una alta
productividad por unidad de biomasa o lo que es lo mismo en la fase de crecimiento
exponencial condición indispensable para estudiar su cinética (figura 18).

15. Figura 18. Variaciones de los valores del Índice de Margalef en una cinética de crecimiento.
Resultado del método empleado para la elaboración de la Cinética del
Crecimiento
Una vez que conocemos que nuestros dos cultivos se encuentran en una fase activa
de crecimiento pasamos estudiar su cinética de crecimiento.
Utilizando la recta patrón de turbidez y registrando la absorbancia durante los
veinte días que dura el experimento obtenemos el número de células/mL que hay cada
día del ensayo en nuestro cultivo. A continuación en la universidad nos ajustaron los
puntos de los valores observados a la función logística de la ecuación de Verhulst
obteniendo la gráfica de la cinética de crecimiento (figura 19).
Figura 19. Gráficas de las cinéticas de crecimiento a 680 de los cultivos de Chlorella 1 y 2.
Parámetro Estimación
K 5,749E+05
r 3,629 E+05
Parámetro Estimación
K 1,188E+06
r 3,933E+05
Figura 20. Tablas con los parámetros K y r de cada una de las gráficas.

16. La capacidad de carga (K) depende de las condiciones de crecimiento y como Chlorella 1 y
Chlorella 2 han tenido condiciones distintas su capacidad de carga es diferente, en cambio
la tasa de crecimiento (r) que característica de cada especie es parecida ya que se trata de la
misma especie (figura 20).
CONCLUSIONES
A lo largo de este proyecto hemos podido demostrar la presencia del microalga
Chlorella sp. en los suelos arenosos de Torrecilla del Pinar (Segovia) y el agua de la fuente
pública de Aldea del Obispo (Salamanca). Además se pudo detectar la presencia de otras
especies que fueron descartadas para nuestro estudio. El motivo del mismo fue centrarnos
en un alga que tuviera aplicación como biofertilizante de suelo. Como Chlorella era la más
abundante que encontramos presente en una alta concentración en las muestras de suelo y agua
empleadas con ella realizamos los sucesivos procesos de réplica conducentes a la obtención de un
cultivo puro, utilizando siempre como medio el BG11. Una vez obtenido este cultivo fue nuestro
objetivo demostrar como los procesos de tratamiento en los cultivos de algas afectan a la cinética de
crecimiento de las mismas. Para ello empleamos dos cultivos de Chlorella que tenían similares
índices de Margalef, es decir, eran cultivos con una alta productividad por unidad de biomasa. A
uno de ellos le pusimos un borboteador (figura 21) con una aireación continua y el otro tenía una
aireación intermitente. Durante veinte días se hizo un seguimiento de ambos cultivos llegando a la
conclusión que el borboteador forma parte de la ley de mínimos que mencionábamos en la
introducción limitando el crecimiento del cultivo en el de bajo régimen frente al de alto.
Figura 21. La fotografía muestra el modelo de borboteador empleado en los cultivos de algas.
AGRADECIMIENTOS
Este proyecto no se podría haber realizado sin la estimable ayuda del profesor Juan
Carlos Rad Moradillo promotor del trabajo. Su labor no terminó ahí, sino que además nos
explicó el manejo del instrumental de laboratorio y nos ayudó en los cálculos posteriores.
Tampoco queremos olvidar a Rajae Kholsi que amablemente nos cedió unas fotografías de
microscopio para ilustrar el trabajo y fue una compañera más en el laboratorio. Por último
al profesor Luis de Benito Aparicio por su paciencia a la hora de corregir los sucesivos
borradores que este proyecto ha ido generando. A todos muchas gracias.

17. BIBLIOGRAFÍA
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