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Diagnóstico de Phytophthora spp., gran laboratorio e instalaciones

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Presentación llevada a cabo por Paloma Abad de la Universidad Politécnica de Valencia en el FORO INIA TEMÁTICO DE COLABORACIÓN PÚBLICO-PRIVADA No 18: LA SECA celebrado el 3 de Julio de 2014 en la sede de CICYTEX en Mérida.

Publicado en: Ciencias
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Diagnóstico de Phytophthora spp., gran laboratorio e instalaciones

  1. 1. Detección e identificación de Phytophthora spp. como herramienta de prevención Paloma Abad Campos Instituto Agroforestal MediterráneoInstituto Agroforestal Mediterráneo Universidad Politécnica de Valencia pabadcam@eaf.upv.es Foro INIA: Enfermedad de la Seca Mérida, 3 julio 2014
  2. 2. Síndromes observados: lento decaimiento progresivo rápido colapso mortal Múltiples factores implicados ¿están las raíces del árbol infectadas por el microorganismo patógeno Phytophthora cinnamomi? ¿están las raíces infectadas por otras especies de Phytophthora que también pueden ser patógenas?
  3. 3. Ciclo de infección Reproducción asexual 1ddi
  4. 4. 3ddi 4ddi 5ddi4ddi
  5. 5. 6ddi 7ddi micelio esporangios clamidosporas 7ddi
  6. 6. DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE PHYTOPHTHORA SPP. Detección molecular eAislamiento de Métodos modernosMétodos clásicos Detección molecular e identificación de especies de Phytophthora mediante pirosecuenciación Detección molecular de P. cinnamomi con sonda específica Foro INIA: Enfermedad de la Seca Mérida, 3 julio 2014 Aislamiento de Phytophthora en medios de cultivo semiselectivos a partir de raíces Detección de propágulos de Phytophthora en suelo mediante material vegetal trampa y su aislamiento en medios de cultivo
  7. 7. Toma de muestras en campo Dehesa muestreada • 3 árboles sintomáticos en la parte aérea • 3 árboles asintomáticos en la parte aérea Cada árbol muestreado • 4 submuestras raíces • 4 submuestras suelo Árbol 1m2 1m21m2 1m2 Foro INIA: Enfermedad de la Seca Mérida, 3 julio 2014
  8. 8. Aislamiento de raíces Aislamiento a partir de lesiones desarrolladas en las trampas vegetales Métodos clásicos: aislamiento PARPBH PDA
  9. 9. Phytophthora Pythium
  10. 10. Métodos modernos: análisis del ADN Extracción del ADN de cultivos puros (Phytophthora, Pythium) Amplificación de la región ITS del ADN ribosomal Secuenciación de los productos de la amplificación Comparación con secuencias depositadas en la base de datos GenBank 1) Identificación molecular de los aislados GenBank
  11. 11. 2a) Detección molecular de Phytophthora spp. por PCR a tiempo real en raíces de encina Extracción del ADN genómico de raíces (50 mg)
  12. 12. 2a) Detección molecular de Phytophthora spp. por PCR a tiempo real en raíces de encina No. Colour Name Genotype Peak 1 Peak 2 Peak 3 Peak 4 Peak 5 4 R22 78.8 87.8 6 R24 74.5 79.2 87.7 92.5 9 R27 75.8 85.5 91.2 10 R28 75.2 79.8 88.0 92.5 11 R29 80.0 87.8 12 R30 79.5 88.0 13 R31 78.5 87.5 15 R33 79.0 87.5 92.7 Las curvas melting relacionan la temperatura de desnaturalización del ADN con el tamaño del amplicon, e indican presencia de varias especies de Phytophthora en la mayoría de raíces
  13. 13. 2b) Detección molecular de Phytophthora spp. por PCR a tiempo real en suelo de dehesas con encinas Extracción del ADN genómico de suelo (500 mg)
  14. 14. 2b) Detección molecular de Phytophthora spp. por PCR a tiempo real en suelos de dehesas con encinas Las curvas melting indican presencia de varias especies de Phytophthora en las muestras de suelo de diversas dehesas
  15. 15. 3) Pirosecuenciación de muestras de raíces y suelo para la detección de Phytophthora spp. Pirosecuenciación 454 (Roche): técnica de secuenciación masiva de DNA basada en la detección de pirofosfatos liberados durante la síntesis del DNA Generación de librerías de amplicones Primera PCR: 30 ciclos, calculados mediante qPCR Segunda PCR: 25 ciclos A ,B: adaptadores de pirosecuenciaciónA ,B: adaptadores de pirosecuenciación Key (TCAG): se añade para la calibración de la señal MID: se añade para la identificación de la muestra
  16. 16. Cuantificación de las librerías Fluorimetría: Quant-iT PicoGreen kit (Invitrogen Molecular Probes) Cálculo del número de moléculas por cada amplicón y su longitud 3) Pirosecuenciación de muestras de raíces y suelo para la detección de Phytophthora spp. PCR en emulsión Se suministró el mismo número de moléculas de cada librería Pirosecuenciación 454 Las librerías se secuencian en una placa de la plataforma Junior Genome Sequencer (454 Life Sciences⁄Roche Applied Biosystems)
  17. 17. 25,64 1,72 20,56 3,820,03 0,08 48,15 CLADO 2 CLADO 3 CLADO 4 CLADO 6 CLADO 7 CLADO 9 Pythium sp. Encinas sintomáticas Resultados de pirosecuenciación del ADN extraído de raíces 10,25 42,44 1,36 6,47 0,01 0,40 39,07 CLADO 2 CLADO 3 CLADO 4 CLADO 6 CLADO 7 CLADO 9 Pythium sp. Encinas asintomáticas Adaptado de Cooke et al. 2000 por G. Abad
  18. 18. • GRUPO DE INVESTIGACIÓN EN HONGOS FITOPATÓGENOS IAM-UPV José García Jiménez, Mónica Berbegal, Maela León, Santiago Catalá, Beatriz Mora, Alexandra Puértolas, Rubén Moliner, Miguel Ángel Redondo Agradecimientos Ministerio de Ciencia e Innovación Programa Nacional I+D+i AGL2011-30438-C02

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