Presentación llevada a cabo por Paloma Abad de la Universidad Politécnica de Valencia en el FORO INIA TEMÁTICO DE COLABORACIÓN PÚBLICO-PRIVADA No 18: LA SECA celebrado el 3 de Julio de 2014 en la sede de CICYTEX en Mérida.

1. Detección e identificación de
Phytophthora spp. como
herramienta de prevención
Paloma Abad Campos
Instituto Agroforestal MediterráneoInstituto Agroforestal Mediterráneo
Universidad Politécnica de Valencia
pabadcam@eaf.upv.es
Foro INIA: Enfermedad de la Seca Mérida, 3 julio 2014

8. Síndromes observados:
lento decaimiento progresivo
rápido colapso mortal
Múltiples factores implicados
¿están las raíces del árbol infectadas por el microorganismo
patógeno Phytophthora cinnamomi?
¿están las raíces infectadas por otras especies de Phytophthora
que también pueden ser patógenas?

9. Ciclo de infección
Reproducción asexual
1ddi

10. 3ddi 4ddi
5ddi4ddi

11. 6ddi 7ddi
micelio esporangios
clamidosporas
7ddi

12. DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
DETECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE PHYTOPHTHORA SPP.
Detección molecular eAislamiento de
Métodos modernosMétodos clásicos
Detección molecular e
identificación de especies
de Phytophthora mediante
pirosecuenciación
Detección molecular de
P. cinnamomi con sonda
específica
Foro INIA: Enfermedad de la Seca Mérida, 3 julio 2014
Aislamiento de
Phytophthora en medios
de cultivo semiselectivos a
partir de raíces
Detección de propágulos de
Phytophthora en suelo mediante
material vegetal trampa y su
aislamiento en medios de cultivo

13. Toma de muestras en campo
Dehesa muestreada
• 3 árboles sintomáticos en la parte aérea
• 3 árboles asintomáticos en la parte aérea
Cada árbol muestreado
• 4 submuestras raíces
• 4 submuestras suelo
Árbol
1m2
1m21m2
1m2
Foro INIA: Enfermedad de la Seca Mérida, 3 julio 2014

14. Aislamiento de raíces Aislamiento a partir de lesiones desarrolladas
en las trampas vegetales
Métodos clásicos: aislamiento
PARPBH
PDA

15. Phytophthora
Pythium

16. Métodos modernos: análisis del ADN
Extracción del ADN de cultivos puros (Phytophthora, Pythium)
Amplificación de la región ITS del ADN ribosomal
Secuenciación de los productos de la amplificación
Comparación con secuencias depositadas en la base de datos
GenBank
1) Identificación molecular de los aislados
GenBank

17. 2a) Detección molecular de Phytophthora spp. por PCR
a tiempo real en raíces de encina
Extracción del ADN genómico de raíces (50 mg)

18. 2a) Detección molecular de Phytophthora spp. por PCR
a tiempo real en raíces de encina
No. Colour Name Genotype Peak 1 Peak 2 Peak 3 Peak 4 Peak 5
4 R22 78.8 87.8
6 R24 74.5 79.2 87.7 92.5
9 R27 75.8 85.5 91.2
10 R28 75.2 79.8 88.0 92.5
11 R29 80.0 87.8
12 R30 79.5 88.0
13 R31 78.5 87.5
15 R33 79.0 87.5 92.7
Las curvas melting relacionan la
temperatura de desnaturalización del
ADN con el tamaño del amplicon, e
indican presencia de varias especies de
Phytophthora en la mayoría de raíces

19. 2b) Detección molecular de Phytophthora spp. por PCR
a tiempo real en suelo de dehesas con encinas
Extracción del ADN genómico de suelo (500 mg)

20. 2b) Detección molecular de Phytophthora spp. por PCR
a tiempo real en suelos de dehesas con encinas
Las curvas melting indican presencia de
varias especies de Phytophthora en las
muestras de suelo de diversas dehesas

21. 3) Pirosecuenciación de muestras de raíces y suelo para la
detección de Phytophthora spp.
Pirosecuenciación 454 (Roche): técnica de secuenciación masiva de DNA
basada en la detección de pirofosfatos liberados durante la síntesis del DNA
Generación de librerías de amplicones
Primera PCR: 30 ciclos, calculados mediante qPCR
Segunda PCR: 25 ciclos
A ,B: adaptadores de pirosecuenciaciónA ,B: adaptadores de pirosecuenciación
Key (TCAG): se añade para la calibración de la señal
MID: se añade para la identificación de la muestra

22. Cuantificación de las librerías
Fluorimetría: Quant-iT PicoGreen kit (Invitrogen Molecular
Probes)
Cálculo del número de moléculas por cada amplicón y su longitud
3) Pirosecuenciación de muestras de raíces y suelo para la
detección de Phytophthora spp.
PCR en emulsión
Se suministró el mismo número de moléculas de cada librería
Pirosecuenciación 454
Las librerías se secuencian en una placa de la plataforma Junior
Genome Sequencer (454 Life Sciences⁄Roche Applied Biosystems)

23. 25,64
1,72
20,56
3,820,03 0,08
48,15
CLADO 2
CLADO 3
CLADO 4
CLADO 6
CLADO 7
CLADO 9
Pythium sp.
Encinas sintomáticas
Resultados de pirosecuenciación del ADN extraído de raíces
10,25
42,44
1,36
6,47 0,01
0,40
39,07
CLADO 2
CLADO 3
CLADO 4
CLADO 6
CLADO 7
CLADO 9
Pythium sp.
Encinas asintomáticas
Adaptado de Cooke et al. 2000 por G. Abad

24. • GRUPO DE INVESTIGACIÓN EN HONGOS FITOPATÓGENOS
IAM-UPV
José García Jiménez, Mónica Berbegal, Maela León, Santiago
Catalá, Beatriz Mora, Alexandra Puértolas, Rubén Moliner,
Miguel Ángel Redondo
Agradecimientos
Ministerio de Ciencia e Innovación Programa Nacional
I+D+i AGL2011-30438-C02