Aplicación Microsatelites en acuicultura

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Ventajas del uso de microsatelites en peces

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Aplicación Microsatelites en acuicultura

  1. 1. CIVA 2003 (http://www.civa2003.org), 1042-1056La variabilidad microsatélite y sus aplicaciones en la Acuicultura 1,2 2 2 2 Yaisel Juan Borrell , Gloria Blanco , Emilia Vásquez , Jorge Álvarez , 2 1 3 Hermes Pineda , Georgina Espinosa , Carlos Fernández-Pato , Concha 3 2 Martínez , Jose Antonio Sánchez 1 Dpto. Bioquímica, Universidad de la Habana (Cuba) 2 Dpto. Biología Funcional, Universidad de Oviedo (España) 3 I.E.O. Planta de Experimentación en Acuicultura “El Bocal”, Santander (España)Resumen SummaryEste trabajo se propone como objetivo general Microsatellites and its applications in Aquaculturediscutir la utilidad de la variación microsatélite en el The main purpose of this paper is a discussion about themanejo de tres especies con gran interés utility of the microsatellite variation on the managementeconómico: el salmón atlántico Salmo salar L, el of three species with economic interest: the atlanticrodaballo Scophthalmus maximus, y el camarón salmon Salmo salar L., the turbot Scophthalmusblanco Litopenaeus schmitti. Los resultados maximus, and the white shrimp Litopenaeus schmitti.obtenidos, que forman parte de una tesis de Our results, that constituted part of a Doctoral Thesisdoctorado defendida en la Universidad de Oviedo en presented in 2002 at University of Oviedo, show thatel 2002, demuestran que los loci microsatélites microsatellites present high levels of genetic variationmuestran altos niveles de variabilidad en las and detect genetic differentiation among populations ofpoblaciones naturales del camarón blanco que the white shrimp L. schmitti separated only by a fewconstituyen el sostén de la acuicultura en Cuba y hundreds of kilometers. These natural populations aredetectan diferenciación genética entre poblaciones the source of broodstocks for aquaculture. We discussseparadas entre sí solo por pocos kilómetros. Se that those microsatellite loci with minor levels ofdiscute que los loci microsatélites con niveles de variability are more useful for studies on naturalvariabilidad bajos-medios son los más adecuados populations. In the other hand higher variablepara los análisis genéticos de poblaciones naturales. microsatellites are useful tools for the broodstocksPor otra parte los loci microsatélites con altos niveles management in the atlantic salmon and turbot throughde variabilidad son útiles para el manejo de the establishment of individual pedigrees if the previousreproductores en las estaciones de cultivo de salmón analysis of genetic variation and genetic relatednessatlántico y rodaballo a través del establecimiento de among broodstocks, together with the possibility ofpedigríes si además se tienen en cuenta otros appearance of mutation and null alleles, are taken intofactores como lo son: un análisis previo de account. Despite high levels of variability, microsatellitevariabilidad y relaciones genéticas en los alleles related to economic traits in Salmo salar were notreproductores y la posibilidad de mutaciones y alelos found, however enzymatic heterozigosity is related tonulos. A pesar de los altos niveles de variabilidad de favorable traits while microsatellite variation exhibitedlos microsatélites no se encontró una relación alelos- lacks of correlations, this could support the idea thatcaracteres de interés comercial en el cultivo para el enzymes through higher metabolic efficiency enhancecaso del salmón atlántico, no obstante encontramos the individual fitness.asociación entre la heterocigosidad enzimática ycaracteres favorables, mientras parece no existirninguna relación con la heterocigosidadmicrosatélite, lo cual podría apoyar la idea de quelas enzimas, a través del control del metabolismo,juegan un papel fundamental en el incremento de laeficacia biológica de los individuos.IntroducciónLa aplicación de la genética al manejo de poblaciones naturales o cultivadas de especiesmarinas ha experimentado en los últimos años un importante incremento a partir de lautilización de los loci microsatélites (1). Los altos niveles que estos exhiben en cuanto apolimorfismo y número en los genomas de todas las especies, además de su ampliadistribución en cuanto a localización genómica, han contribuido a que prácticamente entodos los trabajos que abordan estudios sobre conservación biológica, ecología, conducta,rendimiento de poblaciones cultivadas, entre otros, hayan sustituido a las enzimas comomarcadores genéticos de elección y hayan sido descritos para casi todas las especies (2).En este trabajo se analiza la utilidad de esa variación microsatélite en determinadosII Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 1042
  2. 2. aspectos concretos que incidirían directamente en la mejora del rendimiento en acuiculturade especies marinas que presentan un alto valor económico como lo son el salmón atlántico(Salmo salar L), el rodaballo (Scophthalmus maximus) y el camarón blanco que habitaaguas cubanas (Litopenaeus schmitti). Los aspectos abordados están relacionados con laaplicación de estudios de parentesco ó la búsqueda de marcadores genéticos relacionadoscon caracteres de interés en especies en cultivo y además, con la caracterización depoblaciones naturales que constituyen la base de la producción por acuicultura en aquellasespecies donde los ciclos de producción no están cerrados, donde fenómenos naturales óepidemias destruyen los bancos de reproductores establecidos ó donde el manejo paragenerar descendientes y nuevos reproductores ha provocado importantes procesosendogámicos (3 y 4). Todos los datos se obtuvieron desde 1998 hasta el 2001 durante larealización de una tesis presentada en opción al Título de Doctor por la Universidad deOviedo en el año 2002.Los microsatélites en poblaciones naturales del camarón blancoLitopenaeus schmittiEn los loci microsatélites se han encontrado altas tasas de mutación; desde 10-6 enDrosophila (5) hasta 10-2 en Escherichia coli (6); lo que determina el que aparezca una grandiversidad alélica en los análisis de poblaciones. Sin embargo, se encuentran locimicrosatélites con niveles de variabilidad bajos, medios y altos y esta característica es deimportancia en el momento de seleccionar que tipo de loci utilizar para abordar unaproblemática concreta. De esta forma Hedrick (7) ha sugerido mayor utilidad de los locimicrosatélites con niveles de polimorfismo medios (7-10 alelos) en los análisis depoblaciones naturales, mientras que en estudios genéticos aplicados al cultivo serecomiendan mayores niveles de polimorfismo (8 y 9).La necesidad de loci microsatélites con niveles de variabilidad medios en los análisisgenéticos de poblaciones naturales, parte de la influencia que sobre los resultados tienenlos tamaños de muestras habitualmente utilizados. Así, cuando se analizan 40-50 individuospor población para loci microsatélites con más de 20 alelos, las frecuencias alélicasencontradas son bajas aún para los alelos mayoritarios en las poblaciones (ver la Tabla I yla Figura 1 donde se muestran las zonas de muestreo y los resultados del análisis de4 poblaciones naturales de camarón blanco con 5 loci microsatélites). La presencia demuchos alelos en bajas frecuencias en las poblaciones origina contradicciones en algunasocasiones entre los resultados obtenidos con muestreos temporales de las mismaspoblaciones, detectándose inestabilidades de frecuencias génicas que no se deben acambios genéticos en las poblaciones sino a efectos de muestreo (7 y 10). Lo mismo ocurrecon los constantes hallazgos de deficiencias de heterocigotos para loci con altos niveles devariabilidad en los análisis de poblaciones naturales (11 y 12).Estos desequilibrios de Hardy-Weinberg, cuando aparecen en la mayoría de los locianalizados, pueden deberse también a la utilización de muestras pequeñas en losexperimentos (11). No obstante hay que tener en cuenta que se pueden obtener los mismosresultados (déficit de heterocigotos) cuando se estudian mezclas de poblaciones ópoblaciones sub-estructuradas (13) ó cuando en algún locus, en particular, aparecen alelosnulos (14 y 15). En el caso del camarón blanco el locus Pse028 presenta en todas laspoblaciones estudiadas un déficit significativo de heterocigotos y frecuencias estimadaspara posibles alelos nulos significativamente grandes (0.2209 en la Población Batabanó,0.2690 en Cienfuegos, 0.1992, en Tunas de zaza y 0.1748 en Manzanillo; Programa Cervus(13 y 16)), siendo esta la causa que con mayor probabilidad podría atribuirse aldesequilibrio genético que exhiben las poblaciones de L. schmitti (Tabla II).II Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 1043
  3. 3. Tabla IFrecuencias génicas y parámetros de variabilidad genética en poblaciones naturales de Litopenaeusschmitti de Cuba al utilizar 5 loci microsatélites Poblaciones Poblaciones Poblaciones Alelos BT CF TZ MZ. Alelos BT CF TZ MZ. Alelos BT CF TZ MZ. Locus Lsch-1 Locus Pse028 Locus Pse036 (n) 42 39 45 39 (n) 40 35 37 33 (n) 39 39 40 33 136 .560 .282 .344 .538 146 .025 .000 .000 .000 134 .000 .013 .000 .000 142 .012 .000 .011 .000 154 .000 .000 .000 .015 136 .013 .000 .000 .000 162 .036 .064 .033 .090 156 .000 .000 .027 .015 138 .000 .013 .000 .000 174 .000 .000 .011 .000 158 .087 .157 .176 .121 140 .013 .000 .013 .015 176 .393 .641 .567 .321 160 .013 .071 .027 .000 142 .051 .013 .013 .015 206 .000 .013 .033 .051 162 .025 .086 .000 .015 144 .090 .026 .050 .030 164 .087 .000 .027 .000 146 .038 .051 .025 .091 Locus Lsch-2 166 .013 .000 .000 .000 148 .051 .115 .063 .061 (n) 35 35 46 38 174 .000 .000 .000 .015 150 .064 .077 .112 .091 206 .000 .014 .000 .000 180 .013 .000 .000 .000 152 .064 .115 .050 .091 208 .000 .014 .011 .000 182 .000 .014 .000 .015 154 .051 .051 .075 .061 209 .014 .000 .011 .000 186 .013 .014 .000 .000 156 .103 .064 .112 .061 210 .200 .257 .228 .211 188 .000 .029 .027 .000 158 .103 .064 .013 .045 211 .000 .029 .011 .039 190 .025 .071 .041 .045 160 .038 .038 .075 .106 212 .071 .014 .054 .026 192 .087 .043 .081 .061 162 .051 .115 .100 .061 213 .000 .029 .054 .000 194 .000 .014 .027 .030 164 .051 .090 .112 .061 214 .657 .614 .620 .697 196 .000 .029 .000 .015 166 .038 .090 .063 .061 215 .057 .029 .011 .026 200 .013 .014 .000 .000 168 .077 .026 .050 .000 202 .000 .000 .014 .015 170 .038 .000 .013 .121 Locus Lsch-3 204 .000 .000 .014 .061 172 .038 .013 .038 .000 (n) 39 34 38 37 206 .025 .000 .014 .015 174 .013 .013 .013 .030 134 .013 .015 .000 .000 208 .063 .000 .000 .015 176 .013 .013 .013 .000 136 .026 .000 .105 .014 210 .112 .014 .054 .030 137 .692 .676 .697 .743 212 .000 .029 .027 .000 138 .141 .162 .118 .122 214 .000 .014 .000 .045 139 .077 .088 .026 .095 216 .050 .043 .081 .045 140 .000 .029 .000 .000 218 .175 .000 .108 .045 143 .051 .029 .053 .027 220 .063 .071 .095 .076 222 .050 .129 .095 .061 224 .000 .057 .027 .152 226 .013 .071 .000 .030 230 .000 .000 .000 .015 250 .013 .000 .027 .030 P0.95 100 100 100 100 252 .013 .014 .014 .000 Na 11.6 11.6 11.6 11.0 254 .013 .014 .000 .015 Ho 0.609 0.653 0.605 0.612 258 .013 .000 .000 .000 He 0.688 0.691 0.696 0.678BT: Batabanó, CF: Cienfuegos, TZ: Tunas de Zaza, MZ: ManzanilloLos alelos privados están subrayados y los alelos más frecuentes por locus en cada población aparecen en negritas. P0.95 : % loci polimórficos. Na: Número medio de alelos por locus. Ho: Heterocigosidad media observada. He: Heterocigosidad media esperada.II Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 1044
  4. 4. Figura 1Mapa de Cuba con las localizaciones geográficas de las cuatro muestras utilizadas para el estudio depoblaciones naturales del camarón blanco L. schmitti con 5 loci microsatélites 23N 1 Golfo de Batabanó Cienfuegos 2 3 Golfo de 21N Ana María Golfo de 4 200 km Guacanayabo 84W 81W 78W 78 75W 1. Batabanó, 2. Cienfuegos, 3. Tunas de Zaza (Golfo de Ana María), 4. Manzanillo (Golfo de Guacanayabo) Tabla II Desviaciones del equilibrio de Hardy-Weinberg (FIS) en poblaciones naturales de L. schmitti de Cuba al utilizar 5 loci microsatélites. Poblaciones Locus Batabanó Cienfuegos Tunas de Zaza Manzanillo Lsch-1 -0.019 -0.257* -0.065 +0.067 Lsch-2 +0.025 -0.070 +0.192* -0.115 Lsch-3 -0.083 -0.147 +0.037 -0.201* Pse028 +0.357*** +0.453*** +0.362*** +0.298*** Pse036 +0.108* +0.010 +0.037 +0.161** *: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001Cuando se intenta comparar composiciones genéticas entre poblaciones utilizando locimicrosatélites con altos niveles de variabilidad, aparecen alelos exclusivos en bajasfrecuencias que son por lo tanto poco útiles para utilizarlos como marcadores genéticos depoblación. Este es el caso de la caracterización genética de poblaciones de camarón blancollevada a cabo en este trabajo donde se encontraron 13 alelos exclusivos pero todos enbaja frecuencia (un 77% de ellos en los loci Pse028 y Pse036, Tabla I) y lo mismo haocurrido previamente en estudios con salmón atlántico (10 y 17) y en trucha común (18 y19). Por otra parte el locus Lsch-1 (6 alelos) aparece como el que más contribuye a detectardiferenciación genética entre poblaciones (5.5%) (FSTtotal=0.012 p<0.001) (Tabla III),encontrándose una inversión significativa de frecuencias de alelos mayoritarios entre losgrupos de poblaciones Batabanó-Manzanillo y Cienfuegos-Tunas de Zaza (Tabla I). De estaforma con el número de individuos analizados por población (más de 40 individuos comomedia), los loci con niveles de variabilidad medios parecen ser de mayor utilidad en laII Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 1045
  5. 5. caracterización genética de las mismas. La utilización de tamaños grandes de muestras enlos análisis genéticos de poblaciones naturales puede ser un requisito indispensable paraque la alta variabilidad que ostentan loci como Pse028 y Pse036 aporte informaciónsignificativamente diferente a la que se puede obtener en caracterizaciones poblacionalesllevadas a cabo con enzimas o con loci microsatélites menos variables y tamañosmuestrales más pequeños, por lo general más accesibles en los estudios genéticos (10). Tabla III Diversidad genética total (HT) y su distribución dentro (HS) y entre muestras (DST) en poblaciones naturales de L. schmitti de Cuba al utilizar 5 loci microsatélites. Valores absolutos Valores relativos Loci HT HS DST HS DST Lsch-1 0.580 0.548 0.032 0.945 0.055 Lsch-2 0.528 0.524 0.003 0.994 0.006 Lsch-3 0.480 0.477 0.004 0.992 0.008 Pse028 0.940 0.921 0.019 0.980 0.020 Pse036 0.936 0.926 0.011 0.989 0.011 Medias 0.693 0.678 0.014 0.980 0.020Los loci microsatélites con altos niveles de variabilidad pueden tener sin embargo unaaplicación concreta en algunos aspectos de interés en el manejo de poblaciones naturales.Tal es el caso del marcaje genético de individuos en especies en peligro de extinción dondePalsboll y cols. (20) y Cipriano y Palumbi (21) han investigado conductualmente a ballenasidentificadas mediante composiciones genotípicas microsatélites; o en trabajos publicadossobre conductas de apareamiento en otras especies (22 y 23). Finalmente, en laadscripción de individuos a poblaciones de origen en las pesquerías la alta variabilidad delos loci microsatélite juega un papel fundamental (24) y de ahí el interés que los loci Pse028y Pse036 podrían tener en el caso del camarón blanco L. schmitti (Tabla IV). Tabla IV Asignación correcta de individuos a poblaciones naturales de origen en el camarón blanco L. schmitti utilizando el método Bayesian (Geneclass) luego del análisis de 5 loci microsatélites (entre paréntesis el número de muestra por población). Asignación correcta Muestras Batabanó 73.9% 42 Cienfuegos 79.5% 39 Tunas de Zaza 73.3% 45 Manzanillo 71.8% 39Los microsatélites en poblaciones de cultivo de rodaballo y salmónatlánticoEn los estudios genéticos aplicados al cultivo es indispensable utilizar loci microsatélitescon altos niveles de variabilidad. La alta variabilidad y la codominancia permitiríanestablecer pedigríes en el cultivo (1 y 13) y además inferir relaciones de parentesco entrereproductores de los cuales no se conoce su origen, esto último a través de índices que aII Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 1046
  6. 6. partir de la composición genotípica microsatélite, reflejen la similitud genética entre ellos(Coeficiente de relación genética R (25)). También permitirían implementar programas deselección genética asistidos por marcadores moleculares (MAS). Actualmente loscultivadores utilizan el marcaje físico (imposible en edades tempranas) ó el cultivo enestanques separados de las descendencias (costoso en recursos y espacio) para llevar acabo programas de selección; utilizando estas metodologías se han enfrentado a lacreación de sus bancos de reproductores para establecer cultivos estables, ignorando aveces si desde el mismo punto de partida los individuos de la generación cero estáncomprometidos en cuanto a la existencia de relaciones de parentesco entre ellos ó si laexistencia de una ínfima variabilidad genética impedirá posteriormente llevar a cabo unaestrategia de selección genética exitosa.En este trabajo se llevó a cabo un estudio preliminar de parentesco en salmón atlánticodonde siete loci microsatélites con niveles de variabilidad medios (2-10 alelos) y que hancontribuido significativamente al estudio genético de poblaciones asturianas de la especie(17, 24 ,26 y 27), aportan muy poco en los estudios de parentesco en un escenario en elcual las asignaciones de descendientes a parentales tuvieran que realizarse entre altosnúmeros de posibles genitores (las asignaciones de paternidad entre 10 padres candidatosson correctas en un 80%, pero en las simulaciones con mayor número de padrescandidatos las asignaciones correctas disminuyen hasta un 30-50%). Sin embargo, Norris ycols. (28) seleccionando ocho loci microsatélites con altos niveles de variabilidad(10-29 alelos por locus) logran asignaciones correctas de paternidad de más del 95% en lamisma especie y una discriminación absoluta entre individuos emparentados y noemparentados a través del uso de los coeficientes de relación genética. Tabla V Contenido de Información polimórfica para 8 loci microsatélites, reportados con PIC>0.700 en la literatura, en lotes de reproductores de dos estaciones para el cultivo del rodaballo. Estación 1 Estación 2 Locus - a b c d Smax-01 0.718 0.639 0.582 0.700 0.598 Smax-02 0.537 0.700 0.633 0.740 0.615 Smax-03 0.807 0.614 0.570 0.650 0.599 Sma1-125 0.723 0.606 0.526 0.648 0.432 Sma3-8 0.647 0.532 0.350 0.553 0.321 Sma3-12 0.516 0.480 0.362 0.527 0.355 Sma3-129 0.779 0.625 0.596 0.724 0.605 F1-OCA19 0.723 0.601 0.457 0.593 0.427 PIC(m) 0.681 0.600 0.509 0.642 0.494 He 0.730 0.659 0.583 0.701 0.570 Na 6.88 6.13 5.00 6.75 6.13 n 35 28 25 26 60 a, b, c, d son lotes diferentes de reproductores de la Estación 2 PIC: Contenido de información polimórfica. He: Heterocigosidad esperada. Na: número medio de alelos por locus. n: número de reproductores analizados.Para el caso del rodaballo Scophthlamus maximus se seleccionaron, en la literatura, ocholoci microsatélites descritos con altos niveles de polimorfismo (Contenido de InformaciónPolimórfica, PIC>0.700) y se ensayó su utilidad en las asignaciones de paternidad y en lainferencia de relaciones de parentesco entre individuos con origen desconocido en2 estaciones para el cultivo de la especie (5 lotes de reproductores en total (174 individuos)II Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 1047
  7. 7. y descendencias de 2 de ellos (158 descendientes)). Los resultados obtenidos (Tabla V,Figuras 2, 3, 4 y 5), confirman la necesidad de altos niveles de polimorfismo para abordarestudios de parentesco, elemento que a través de simulaciones ya había sido sugerido (1, 8y 9). No obstante, en este estudio se han encontrado varios elementos, además de la altavariabilidad genética, que deben ser tenidos en cuenta en este tipo de análisis dentro de lasestaciones de cultivo a partir de que encontramos diferencias significativas entre lasasignaciones correctas esperadas, según las simulaciones basadas en los niveles devariabilidad genética, y las encontradas al asignar descendientes virtuales generados con elprograma Probmax (29) (Lotes b y d de la Estación 2) ó descendencias reales (Lote a de laEstación 2) (Figura 2).Figura 2Relación entre el Contenido de Información Polimórfica (PIC), el porcentaje de asignación correctaesperada luego de simulación con frecuencias génicas (Cervus) (I), el porcentaje de asignacióncorrecta luego de generar con Probmax 200 descendientes virtuales de 25 familias y asignarlos (II) yfinalmente los porcentajes de asignación correcta a ambos parentales encontradas al asignar un totalde 50 (Estación 1) y 108 descendientes de rodaballo (Estación 2a) a partir de los genotipos para 8loci microsatélites (III). 81,2 76,2 0,681 75,1 69,5 71,5 70,5 0,642 65,5 0,600 59 0,509 0,475 38,9 40,5 38,7 6,5 PIC I II III Estación 1 Estación2(c ) Estación 2(a) Estación 2(b) Estación 2(d) Figura 3 Relación entre la asignación correcta a parentales luego de asignar descendientes virtuales generados con el programa Probmax y el PIC y número medio de alelos (Na) en 5 lotes de reproductores de rodaballo luego del análisis con 8 loci microsatélites. 100 b=319,65 F=20,070 p=0,021* 100 b=24,12 F=34,240 p=0,010* 80 1 80 1 % asignación correcta % asignación correcta A A C 60 60 C 40 B 40 B 20 20 D D 0 0 .4 .5 .6 .7 4.0 5.0 6.0 7.0 PIC Número de alelosII Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 1048
  8. 8. Figura 4Relación entre la asignación correcta a parentales de individuos generados con Probmax y losporcentajes de individuos no emparentados según r ≤ 0 en 5 lotes de reproductores para el cultivodel rodaballo luego del análisis con 8 loci microsatélites. a) considerando las relaciones genéticasentre todos los reproductores. b) considerando las relaciones genéticas entre las hembras.c) considerando las relaciones genéticas entre los machos. 100 b=4,35 F=0,870 p=0,419 a 100 b=6,42 F=11,870 p=0,041* b 100 b=-1,29 F=0,350 p=0,596 c 1 1 1 % asignación correcta 80 80 80 % asignación correcta A A% asignación correcta A C C 60 C 60 60 40 40 B 40 B B 20 20 20 D D D 0 0 0 45 50 55 60 30 35 40 45 45 50 55 60 65 70 % individuos no emparentados % individuos no emparentados (hembras) % individuos no emparentados (machos)Nota: Las hembras son los parentales más emparentados entre sí según r ≤ 0 entre ellas en los 5 lotes de reproductoresestudiados.Figura 5Distribución de coeficientes de relación genética y medias (± D.E) por tipo de parentesco endescendientes de dos estaciones para el cultivo del rodaballo (8 loci microsatélites). a) Estación 1. b)Estación 2 (lote A). (Por debajo de r ≤ 0 o de r < r (media de los individuos no relacionados) el 100%(Estación 1) y 71% (Estación 2) de los individuos encontrados son efectivamente individuos norelacionados). 14 % 12 r≤0 100% no relacionados 10 8 r≤r(m) (no relac.) 6 100% no relacionados 4 2 0 (r ) 05 15 25 35 45 55 65 75 85 95 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 ,9 ,8 ,7 ,6 ,5 .4 .3 .2 .1 .0 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. -0 -0 -0 -0 -0 -0 -0 -0 -0 -0 h. completos r(m)=+0,4885±0,1657 no relac. r(m)=-0,0782±0,2271 b) 14 % r≤0 12 71% no relacionados 10 r≤r(m) (no relac.) 8 71% no relacionados 6 4 2 0 (r ) 05 15 25 35 45 55 65 75 85 95 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 ,9 ,8 ,7 ,6 ,5 .4 .3 .2 .1 .0 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. -0 -0 -0 -0 -0 -0 -0 -0 -0 -0 h. comple tos r(m)=+0,4898±0,2356 me dios he rmanos r(m)=+0,0220±0,3481 no re l ac. r(m)=-0,0824±0,3126II Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 1049
  9. 9. La composición genética de los lotes de reproductores constituye un factor de importanciapara las asignaciones de paternidad. Nótese que utilizando el mismo conjunto de locimicrosatélites se encuentran niveles de variabilidad dispares en los lotes de reproductoresanalizados, lo que determina que los resultados de asignación entre ellos sean tambiéndispares (Figura 2). Esta amplia variación encontrada en cuanto a asignaciones correctas,está relacionada con la variabilidad genética en los lotes de reproductores analizados(promedios de PIC y números de alelos) (Tabla V, Figuras 2 y 3) y además con lacomposición en cuanto a similitudes genéticas entre reproductores de los mismos sexosdentro de cada uno de los lotes de reproductores, en este caso con las hembras queaparecen siempre como los parentales más relacionados genéticamente (Figura 4). Loslotes de reproductores b y d de la Estación 2 son aquellos donde existe una mayor relacióngenética entre las hembras de cada lote y por ello se dificulta la asignación y se observandiscrepancias entre las asignaciones correctas observadas y las esperadas a partir de lassimulaciones hechas sobre la base de los niveles de variabilidad genética (Figura 2). Estosresultados sugieren que cada lote de reproductores representa por lo tanto una entidadúnica con características peculiares en lo que se refiere a su composición genética, la cualdependerá del origen de los individuos que lo componen (poblaciones naturales deprocedencia), ciclos de cultivo que hayan experimentado y tipo de manejo establecido paraobtenerlos. Por lo tanto es necesario identificar dentro de un conjunto amplio de locimicrosatélites, seleccionados en la literatura en función de sus altos niveles de variabilidad,cuales funcionan mejor en cada lote de reproductores a través de un estudio previo en elcual los elementos mencionados (PIC, número de alelos y relaciones genéticas entrereproductores, en general y por sexos) sean los criterios de selección. Puede ocurrir quedeterminados lotes de reproductores exhiban muy bajos niveles de variabilidad microsatélitecon todos los loci ensayados debido a que los individuos que los componen están muyemparentados (el Lote d de la Estación 2 es un ejemplo). En esas condiciones seríarecomendable sugerir a los productores una renovación de este lote de reproductoresutilizando individuos disponibles en otros lotes dentro de la misma estación ó con individuosprocedentes de otras estaciones y con orígenes diferentes, antes de implementar unmanejo “asistido” por marcadores genéticos donde la alta variabilidad genética es condiciónindispensable.El diseño del estudio de parentesco llevado a cabo en rodaballo donde se analizanprogenitores y descendientes y se conoce además el origen de todos los descendientes(sólo Norris y cols. han publicado un diseño equivalente (28)), ha permitido identificarademás de la importancia que tiene la composición genética de los lotes de reproductores,otros elementos que también afectan a la capacidad de asignación de los loci microsatélitesy las inferencias que se hacen a través de los coeficientes de relación genética sobre lasrelaciones de parentesco entre individuos con origen desconocido: la aparición demutaciones y de alelos nulos (14 y 15).En el trabajo con progenitores y descendientes de la Estación 2 para el cultivo en rodaballo(Lote a) se encontró una tasa de mutación de 10-4 (1 mutación en las 1 264 meiosisestudiadas), tasa que se encuentra dentro de los rangos descritos para la variaciónmicrosatélite (30). Esto determinaría que sólo uno de cada 10 000 individuos no se podríaasignar a ningún parental, en el caso de que la mutación produjese un alelo nuevo que nose encuentra en el lote de reproductores, ó sería mal asignado si el cambio es hacia uno delos alelos ya existentes. Sin embargo, los errores de asignación que podrían cometersedebido a la presencia de alelos nulos constituyen un elemento de mayor importancia, ennuestro caso un 70% de los descendientes de un reproductor que portaba un alelo nulo enel Lote a de la Estación 2 fueron mal asignados en el estudio llevado a cabo en rodaballo.Considerar la posibilidad de que en un estanque de cría donde se han mezcladodescendientes, un reproductor que porta un alelo nulo sea responsable de una contribuciónimportante de gametos y por ello las inferencias basadas en los datos microsatélites seanII Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 1050
  10. 10. significativamente erróneas, debe ser una responsabilidad a asumir por parte de losresponsables de cada programa genético en una estación de cultivo. Solo un elementopodría parcialmente ayudar a resolver esta problemática y está relacionado con evitar lautilización de loci microsatélites que exhiban, en particular, un déficit significativo deheterocigotos. No obstante, en una situación en la cual todos o casi todos los microsatélitesensayados exhiban déficits significativos de heterocigotos en los reproductores es probableque estemos en presencia de una mezcla importante de acervos génicos diferentes (efectoWahlund, muy frecuente en las estaciones de cultivo de peces) y no ante una evidencia dealelos nulos, lo cual podría comprobarse investigando el origen de los reproductores, si esque está disponible (13).El uso de los coeficientes de relación genética como herramienta para la selecciónadecuada de parejas de reproductores en las estaciones cuando se desconoce el origen(pedigrí) de los mismos, es un método que contribuiría a evitar la endogamia en lasestaciones de cultivo. Doyle y cols. (31) han demostrado que un número mínimo de losreproductores utilizados en una estación, pueden acumular casi toda la diversidad alélica yheterocigosidad del conjunto de genes de los parentales. En este estudio comprobamosque realmente estos coeficientes se comportan tal y como predice la teoría para cada unode los tipos de parentesco que estaban disponibles, y también que se pueden establecerciertos “valores de corte” para los coeficientes de relación genética (ej.: r ≤ 0), quedemuestran tener niveles aceptables de confidencia a la hora de identificar a individuos norelacionados (Figura 5).Teniendo en cuenta los elementos previamente mencionados es muy probable que en elcaso del rodaballo se pueda establecer, en la práctica, un programa que utilizando unnúmero mayor de loci microsatélites ó sustituyendo algunos de los que por sus niveles devariabilidad en los lotes de reproductores analizados no son convenientes, revierta en unmejor rendimiento productivo de las estaciones de cultivo con las que se ha trabajado.Los loci microsatélites y su asociación con caracteres favorablespara el cultivoEl otro elemento mediante el cual se espera que la alta variación microsatélite constituyauna herramienta de importancia en el cultivo de especies marinas es en la selecciónasistida. Existen expectativas referidas a la posibilidad de encontrar alelos microsatélitesmarcadores que estén relacionados con caracteres de interés comercial en numerosasespecies debido al alto polimorfismo que exhiben y a su distribución ubicua en loscromosomas (1, 32 y 33). En este trabajo se abordó este enfoque en el salmón atlánticoanalizando 257 individuos con 8 loci microsatélites, no obstante, no se encontró unarelación entre los alelos microsatélites y ninguno de los caracteres de interés estudiados(sexo, momento de la primera alimentación activa, estadio fisiológico, talla y peso).Danzmann y cols. (34), Jackson y cols. (35), y además Streelman y Kocher (36) hanencontrado marcadores microsatélites relacionados con la tolerancia a la temperatura enfamilias de trucha común y con la expresión de prolactina en tilapia, respectivamente. Noobstante, se necesita probar muchos marcadores moleculares y un esfuerzo común devarios equipos de investigación, tal y como ocurre en los proyectos sobre mapas genéticosde algunas especies (37), para obtener resultados satisfactorios en este objetivo. De estaforma es posible localizar la mayor cantidad posible de marcadores genéticos en el genoma(no solo microsatélites, sino también otros marcadores de ADN muy variables) pararelacionarlos posteriormente con caracteres de interés económico. Por lo tanto es deesperar que los loci microsatélites sean útiles en este empeño, pero sólo a través de esteenfoque amplio que comprenda la elaboración de un mapa genético de salmón. A pesar deII Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 1051
  11. 11. que no se encontraron en nuestro trabajo alelos marcadores microsatélites, ni enzimáticos,si se observaron diferencias entre ambos tipos de marcadores en cuanto a las asociacionesentre heterocigosidad y eficacia biológica.En este trabajo se encontraron asociaciones positivas entre la heterocigosidad enzimática yel momento de la primera alimentación activa (correlacionado con la eficacia biológica) (38,39 y 40), la talla y el peso de los peces mientras ese tipo de asociaciones no existen alconsiderar la heterocigosidad microsatélite; también los individuos más heterocigotos paralas alozimas son menos asimétricos, mientras no se encuentra relación entre laheterocigosidad microsatélite y la asimetría (Tablas VI y VII) (la eficacia biológica y laestabilidad del desarrollo han sido correlacionadas desde los estudios de Lerner en 1954(41)). Estos resultados se implican en un extenso e histórico debate entre neutralismo yseleccionismo para explicar el porque se encontraban correlaciones entre heterocigosidadenzimática y eficacia biológica y sus consecuencias para el cultivo de especies acuícolas, apartir de que las variantes solo representen polimorfismos transientes de alelos neutrales óvariantes alélicas que por sí mismas implican ventajas adaptativas para los individuos (42 y43). Tabla VI Heterocigosidad y caracteres morfológicos en salmones con diferentes momentos de alimentación activa Salmones Salmones tempranos tardíos F Nº de individuos por muestra 141 116 He 0.189 0.145 6.11* Hµ 0.488 0.497 0.14 ns Asimetría Global 0.8481 1.1849 3.01 ns Nº de caracteres asimétricos (media) 0.6424 0.8451 3.97* Talla (cm) 41.58 26.52 39.94*** Peso (g) 15.21 12.50 34.18*** He = heterocigosidad enzimática (MDH-3,4*, mMEP-2*, IDHP-3*, sAAT-4*, IDDH-1* e IDDH-2*). Hµ = heterocigosidad microsatélite (SsaF43, SsaD30, Ssa2019, Ssa1337, SSOSL311, SSOSL417, Str543 y Str15). Asimetría Global: Calculada como la suma de los valores de asimetría (A) de tres caracteres morfométricos (radios de las aletas pélvicas y pectorales, y número de branquiespinas) corregidas mediante normalización, al dividir por la media de cada carácter en cada población. *: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001; ns: No significativo.Tabla VII Relación entre la heterocigosidad y caracteres de interés en el cultivo de salmón atlántico. En paréntesis el número de individuos por muestra. Salmones tempranos (141) Salmones tardíos (116) Asimetría global Talla (cm) Peso (g) Asimetría global Talla (cm) Peso (g)He b = -0.546*** τ = +1.000*** τ = +0.333*** b = -1.021*** τ = +1.000*** τ = +1.000***Hµ b = +0.323 τ = +0.200 τ = +0.467 b = +0.178 τ = -0.810* τ = -0.905**b: Coeficiente de regresión lineal; τ: Coeficiente de rangos de Kendall; He, Hµ y Asimetría Global: Ver tabla VI.*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001; ns: No significativo.Este tipo de experimentos (relaciones entre heterocigosidad de marcadores enzimáticos yde ADN con caracteres relacionados con la eficacia biológica) han sido sugeridos como unaforma válida de demostrar la hipótesis de la sobredominancia asociativa como base de lasasociaciones observadas en multitud de organismos (42, 43, 44 y 45), es decir si lasII Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 1052
  12. 12. asociaciones eficacia biológica-heterocigosidad enzimática son una consecuencia dedesequilibrios de ligamiento entre los loci enzimáticos y genes deletéreos, se espera quetambién los loci microsatélites, con distribuciones ubicuas en los genomas (32 y 33),aparezcan en desequilibrio con estos genes. Nuestros resultados contradicen lospresupuestos de la hipótesis de la sobredominancia asociativa; el momento de la primeraalimentación activa, la estabilidad del desarrollo (simetría), la talla y el peso de losindividuos muestran asociaciones significativas y positivas con la heterocigosidadenzimática y no aparecen asociaciones consistentes con la heterocigosidad microsatélite.Este experimento parece sugerir como alternativa que las enzimas y los loci microsatélitesson diferencialmente afectados por la selección natural y que posiblemente los locienzimáticos, a través del control de las reacciones metabólicas, juegan un papel fundamentalen el incremento de la eficacia biológica de los individuos. Al menos otros dos resultadospublicados parecen reforzar esta hipótesis: Zouros y Pogson trabajando con juveniles dePlacopecten magellanicus, que exhiben correlaciones positivas y significativas entre laheterocigosidad enzimática (7 loci) y la tasa de crecimiento, no encuentran correlación algunacon la heterocigosidad de marcadores de ADN (42) y Thelen y Allendorf en un estudio conOncorhynchus mykiss utilizando 10 loci enzimáticos y 10 loci microsatélites, obtienenresultados similares a los nuestros y llegan a la misma conclusión (45).No obstante, de la misma forma en que en varios experimentos se ha fallado en el intentode demostrar la hipótesis de la sobredominancia asociativa, la sobredominancia directa delas enzimas ha sido demostrada en muy contadas ocasiones en experimentos donde se haapreciado directamente ventajas selectivas de los individuos heterocigotos frente a loshomocigotos. Tal es el caso del polimorfismo de la alcohol deshidrogenasa en salamandra,que a través de los niveles de oxígeno produce variaciones en crecimiento y supervivencia,o del polimorfismo en la glicerato deshidrogenasa asociado en plantas al crecimiento y a laviabilidad en sitios secos (43). De esta forma los resultados obtenidos aquí deben serinterpretados exclusivamente como un experimento en el cual no se ha podido demostrar lahipótesis de la sobredominancia asociativa, pero no como una confirmación de la hipótesisde la sobredominancia directa, objetivo para el que se necesitaría un enfoque distinto alabordado en este trabajo.Conclusiones• Los loci microsatélites muestran mayores niveles de variabilidad que los encontrados con enzimas en los estudios con poblaciones naturales del camarón blanco Litopenaeus schmitti, y detectan diferenciación genética entre poblaciones cercanas geográficamente. En estos estudios los loci microsatélites con niveles de variación “medios” resultan ser los de mayor utilidad.• Los loci microsatélites con altos niveles de variación son útiles en el diseño del manejo de reproductores en programas de cultivo del rodaballo Scophthlamus maximus a través de estudios de parentesco aunque es imprescindible tener en cuenta los siguientes elementos: - La variabilidad de los loci microsatélites en los reproductores y relaciones genéticas existentes entre los reproductores (PIC, heterocigosidad y número de alelos, coeficientes de relación genética en general y por sexos). - La posibilidad de mutaciones y presencia de alelos nulos.• A pesar de la alta variación que exhiben los loci microsatélites es difícil encontrar asociaciones entre alelos, ó composiciones genotípicas, y caracteres favorables para elII Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 1053
  13. 13. cultivo del salmón atlántico. Las asociaciones existentes entre los niveles de heterocigosidad enzimática y momento del inicio de la alimentación activa, estabilidad del desarrollo, talla y peso de los individuos, no se observan al considerar los niveles de heterocigosidad microsatélite. Estos resultados apoyan la idea de que las enzimas y los microsatélites son diferencialmente afectados por la selección natural y que los loci enzimáticos, posiblemente a través del control de las reacciones metabólicas, juegan un papel fundamental en el incremento de la eficacia biológica.AgradecimientosLos autores agradecen al Servicio de Recursos Naturales y Protección Ambiental de laConsejería de Medio Ambiente del Principado de Asturias y al Instituto Español deOceanografía por su colaboración.Y. Borrell y H. Pineda disfrutaban de una beca AECI durante la realización de este trabajo.Referencias1. ESTOUP A, ANGERS B. Microsatellites and 8. BLOUIN MS, PARSON M, LACAILLE V, LOTZ minisatellites for molecular ecology: S. Use of microsatellite loci to classify Theoretical and empirical considerations. individuals by relatedness. Molecular En: CARVALHO GR (ed). Advances in Ecology. 1996;5:393-401. Molecular Ecology. IOS press. Amsterdam. 1998;55-86. 9. ESTOUP A, GHARBI K, SANCRISTOBAL M, CHEVALET C, HAFFRAY P, GUYOMARD R.2. GOLDSTEIN DB, SCHLOTTERER Ch. Parentage assignment using microsate- Microsatellites, evolution and applications. llites in turbot (Scophthalmus maximus) Oxford University Press. 1999;1-343. and rainbow trout (Onco-rhynchus mykiss)3. HEDGECOCK D, MALECHA S. Prospects for hatchery populations. Canadian Journal of the application of biothecnology to the Fisheries and Aquatic Sciences 1998; development and improvement of shrimp 55:715-725. and prawn. En: SANDIFER A (ed). Shrimp 10. FERNÁNDEZ A. Caracterización genética de Culture in North America and Caribbean. poblaciones de salmón atlántico (Salmo Advances in World Aquaculture, Vol 4. salar L) utilizando loci microsatélites: World Aquaculture Society, Baton Rouge, influencia del tamaño de muestra y del LA, USA. 1991; 161-200 número de loci analizados. Seminario de4. BENZIE JAH. Population genetic structure investigación. Universidad de Oviedo. in penaeid prawns. Aquaculture Research. 1999 2000;31: 95-119. 11. PONGSOMBOON S, W HAN V, MOORE SS,5. SCHUG MD, MACKAY TFC, AQUADRO CF. TASSANAKAJON A. Characterization of tri- Low mutation rates of microsatellite loci in and tetranucleotide microsatellites in the Drosophila melanogaster. Nature black tiger prawn Penaeus monodon. Genetics. 1997;15: 99-102. Science Asia. 2000;26:1-8.6. LEVINSON G, GUTMAN GA. High 12. XU Z, PRIMAVERA JH, DE LA PENA L, PETIT frequencies of short frameshifts in poly P, BELAK J, ALCÍVAR-W ARREN A. Genetic Ca/TG tandem repeats borne by diversity of wild and cultured Black Tigre bacteriophage M13 in Escherichia coli. Shrimp (Penaeus monodon) in Philippines Nucleic Acids Research. 1987;15: 5323- using microsatellites. Aquaculture. 2001; 5338. 199:13-40.7. HEDRICK PW. Highly variable loci and their 13. MARSHALL TC, SLATE J, KRUUK LEB, interpretation in evolution and PEMBERTON JM. Statistical confidence for conservation. Evolution. 1999;53:313-318. likelihood-based paternity inference inII Congreso Iberoamericano Virtual de Acuicultura 1054
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