[1] El documento analiza los efectos de la exposición al etanol en la expresión de proteínas en un modelo de ratón de trastornos del espectro alcohólico fetal. [2] Los investigadores encontraron alteraciones en la expresión de proteínas involucradas en la proliferación celular, diferenciación, apoptosis y otras funciones, lo que puede explicar el retraso en el crecimiento y las anormalidades observadas en los embriones expuestos al alcohol. [3] El análisis de proteínas clave reveló cambios en la regulación

1. Ethanol Exposure Alters Protein
Expression in a Mouse Model of
Fetal Alcohol Spectrum Disorders
Stephen Mason
Bruce Anthony
Natalia Zapata Zuluaga
Steven Olaya Ramírez
Tercer Semestre Medicina
Universidad Pontificia Bolivariana

2. INTRODUCTION
• Ethanol: Ethanol is the systematic name defined by the IUPAC nomenclature of
organic chemistry for a molecule with two carbon atoms (prefix "eth-"), having a
single bond between them (suffix "-ane"), and an attached -OH group (suffix "-ol").
Ethanol is produced both as a petrochemical, through the hydration of ethylene
and, via biological processes, by fermenting sugars with yeast.

3. INTRODUCTION
• Animal model (The Mouse): The Mice (Mus Musculus) are the perfect animal
model for this research for some reasons: primarily because they are
mammals, and also because they share a high degree of homology with
humans, and virtually all mouse genes have human homologs. Mice are
small, inexpensive, easily maintained, and can reproduce quickly; several
generations of mice can be observed in a relatively short period of time. Mice have
the same organs in the same places than humans, just different proportions.

4. INTRODUCTION
Disorders with alcohol (Ethanol):
• Alcohol exposure during development can result in variable growth retardation and
facial dysmorphology known as fetal alcohol spectrum disorders (FASD).
• Aberrant changes in gene expression and in the epigenome of embryos.
• The teratology induced in the embryos is expressed in the neurulation process.
• Alteration of proteins with roles in cellular function, cell cycle, and the ubiquitin-
proteasome pathway was induced by alcohol.
• Researchers have found aberrant DNA methylation results in the misexpression of
neurospecification genes Ngn and Sox5.

5. INTRODUCTION
• Relationship about all
This research was made about the disorders that ethanol can cause in the
development of the embryo. Because the components of ethanol, this can be
dangerous to the genome of the embryo by causes such as DNA methylation and
the shackles of neurogenesis, to study the above, an animal model was selected
that met certain characteristics mentioned above, the mouse (mus musculus) is a
specimen easy to handle and gives very good results for such projects.

6. OVERALL OBJECTIVE
• Recognize the obvious and not obvious alterations phenotypically that ethanol can
cause in embryogenesis (especially FASD) to certain proteins using different tests
to analyze and compare proteic features; in addition to confirm the alterations
already nominated and hypotheses proposed by other researchers.

7. MATERIALES Y MÉTODOS
Cultivo Embrionario
• El útero grávido se separó y se colocó en un buffer que contiene solución salina
(PBS) a 37°C.
• Tres embriones que llevan de 3 a 6 somitas fueron colocados en un frasco de
cultivo (20 ml) conteniendo el cultivo medio.
• Después del período de precultivo (2-4 horas; máximo, 4 horas), la exposición al
alcohol se inició mediante la transferencia de los embriones en el medio que
contiene 6 μl/ml de 95% etanol (aproximadamente 400 mg / dl).
• La concentración de etanol en 24h fue medida en 0, 12 y 22h.

8. MATERIALES Y MÉTODOS
Análisis Gel 2D
• Permite la separación de cientos o miles de proteínas (“spots”) en un único gel,
mostrando un patrón característico.
• Se provoca la desnaturalización de las proteínas por ruptura de puentes de
hidrógeno y disulfuro.
• Isoelectroenfoque Punto Isoeléctrico, pH.
• Peso Molecular Electroforesis en gel de acrilamida con SDS.
• Coloración con Coomasie Blue.
• Evaluación de Imágenes.

9. MATERIALES Y MÉTODOS
Ingenuity Pathways Analysis (IPA)
• IPA se basa en redes basadas en la información extraída de la literatura científica y
se deposita en el Ingenuity Knowledge Base. IPA proporciona una evaluación de la
señalización y las rutas metabólicas, redes moleculares y procesos biológicos que
están más significativamente perturbados en la condición experimental.

10. MATERIALES Y MÉTODOS
Western Blot
• Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio
que se desee: peso molecular en este caso. Luego son transferidas a una
membrana adsorbente (nitrocelulosa) para poder buscar la proteína de interés con
anticuerpos específicos contra ella. Finalmente, se detecta la unión antígeno-
anticuerpo por actividad enzimática o fluorescencia.

11. MATERIALES Y MÉTODOS
Análisis Inmunohistoquímico
• En este análisis las muestras de tejido se seccionan en pequeñísimas partes (en
este caso de 40 micras). Todas las secciones se lavan con PBS y se incuban en
peróxido de hidrógeno, además de los anticuerpos 1 para las proteínas a evaluar.
Luego se incuban con anticuerpos 2, seguido por un complejo de peroxidasa; se
deben lavar las muestras con PBS entre las incubaciones 1 y 2. En el caso de esta
investigación, se dio una coloración marrón producida por una solución añadida
que reveló la actividad peroxidasa.
• La aplicación directa de anticuerpos sobre secciones tisulares permite la
localización microanatómica de su expresión y su correlación con los parámetros
morfológicos.

12. RESULTADOS
Retardo del crecimiento
embrionario y anormalidades.
Solo los embriones cultivados que mantuvieron activos los latidos del corazón y la
circulación activa (95%) fueron utilizados para los análisis.
En los embriones que se encontraron expuestos al alcohol, se observo un cambio grande
en su desarrollo, en comparación con los embriones de control.
- Retraso en el crecimiento
- Anomalías del cerebro
- Anomalías en el corazón
- Defectos del tubo neural
- Ojos pequeños
- Morfología anormal
- Cola sin giro
- Reducido sistema vascular

13. Figura 1: El alcohol inducida dismorfología del
desarrollo embrionario.
-FB: Cerebro anterior
-MB: Cerebro medio
-HB: Romboencéfalo
-H: Anomalías del corazón
-Flechas negras: Ojos pequeños en
comparación con el de la derecha.
-Menor coloración roja: Reducido sistema
vascular
-Alcohol-NTC: Tubo neural cerrado pero con
retrazo en el desarrollo
- Alcohol-NTO: Tubo neural abierto
(Flechas Rojas)

14. Análisis en gel 2D
Se muestran las proteínas y los genes implicados en la
proliferación, diferenciación, apoptosis, el crecimiento del
tejido, remodelación, crecimiento neuronal y supervivencia, que sufrieron
cambios a causa de la exposición al alcohol.
-El número total de puntos de gel detectado fueron 2.050. Cuarenta puntos de
gel con un peso significativo (P < 0,01)
-De los restantes 32 puntos, 24 fueron downregulated y 8 upregulated en los
embriones expuestos a alcohol.
-Para dar prioridad a el estudio, sólo los puntos con una parte muy significativa
(p < 0,007) fueron seleccionados para análisis.
- 5 upregulated y 4 downregulated se les aplico LC-MS/MS (cromatografía
líquida acoplada a la espectrometría de masas) para evaluar la toxicidad
causada por el tratamiento con alcohol.

15. En la siguiente tabla se muestran las proteínas expresadas a
partir del análisis 2D, están agrupadas en up- or
downregulated.

16. Nueve proteínas con una
expresión diferente debido al
tratamiento con alcohol se
destacan con una "x" blanca
y están marcados con el
nombre de los genes.

17. Análisis de Western Blot
Técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra
mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio
que se desee y posteriormente se buscan con anticuerpos específicos para ella.
Las proteínas que marcaron un upregulation fueron:
- Serotransferrina (Tf) ( Transporte de hierro)
- Triosa fosfato isomerasa (TPI1) ( Implicada en la glucolisis )
Las proteínas que marcaron downregulation fueron:
- Proteína de unión 1 (Pcbp1)
- Ubiquitina-conjugación (Ube2N) ( dirige el reciclaje de proteínas )
Pero estas ultimas no fueron estadísticamente significativas.

18. En esta grafica se comprueba que la serotransferrina (Tf) y triosa fosfato isomerasa
(TPI1) tuvieron un upregulation significativo (P ≤ 0,05), mientras que la proteína de
unión 1 (Pcbp1) y la ubiquitina-conjugación (Ube2N) tuvieron un downregulation
pero no muy significativo.

19. Inmunohistoquímica
La inmunohistoquímica (IHQ) es un estudio histopatológico utilizado para
demostrar la presencia o no de un determinado antígeno (Ag) en una muestra de
tejido.
Este estudio nos permite identificar con exactitud los tipos celulares presentes en
una muestra, ya que existen multitud de Ag diferentes que son característicos de
distintas líneas de diferenciación y funcionalismo celular.
La IHQ se basa en la utilización de anticuerpos (Ac) específicos frente al Ag cuya
presencia se quiere probar, y los cuales, los Ac, han sido previamente marcado.
Los genes que expresaron upregulation fueron:
-Tf : El cual esta localizado en el corazón, los arcos branquiales y somitas
de los embriones tratados con alcohol.
-Tpi1 : Se incrementó de manera difusa.

20. Análisis de Ingenuity Pathways
Las nueve proteínas identificadas por LC-MS/MS (cromatografía
líquida acoplada a la espectrometría de masas) se presentaron a la API para
evaluar los cambios biológicos causados por la exposición al alcohol.
El mayor reporte de cambios en ciclos se dio en : el ciclo celular, muerte celular,
la expresión de genes y el desarrollo del aparato reproductor.
El mayor reporte de cambios en las funciones biológicas se dio en: el ciclo
celular, señalización celular, la función celular, el mantenimiento de la
hematopoyesis, y el tráfico de células inmunes.
El mayor reporte de cambio en las vías principales se dio en: la endocitosis
medida por clatrina y clathrin endocitosis mediada por la señalización y la vía
proteasomal ( Encargada de degradar proteínas innecesarias por proteólisis)

21. DISCUSSION

22. I agree
Author What does he/she said Yes No
Y. Liu The effects on protein regulation may parallel the growth x
delay and developmental abnormalities including brain,
neural tube, eye, heart, blood cells, and embryonic
vascularization.
Y. Peng, B. M. Altura, The transcription factor NF- κB (Tumor necrosis Fractor) x
M. J. Druse, P. protects cells against DNA damage-induced cell death
Mandrekar and may play a role in the immune response. Alcohol
differentially regulates NF-κB activity in various tissues
Ethanol activates NF-κB in cerebral vascular muscle cells,
in contrast, ethanol diminishes NF-κB target gene
expression in fetal rhombencephalic neurons via a 5-
HT(1A) (serotonin) mediated pathway [42]. Ethanol also
interferes with inflammatory cytokine production by
downregulating NF-κB in monocytes, resulting in impaired
immunity

23. I agree
Author What does he/she said Yes No
D. R. Armant and D. Ethanol can induce release of intracellular calcium that x
E. Saunders. stimulates the cell cycle and the expression of Myc
proteins associated with cell proliferation. Increased
proliferation is advantageous during reimplantation, but
ethanol interference with terminal differentiation during
organogenesis may underlie alcohol teratogenicity
J. R. Connor, T. D. Tran Tf transports iron from tissue sites of absorption to sites of x
et al. storage or utilization and has a role in stimulating cell
proliferation . Because iron is an essential cofactor in
neurotransmitter synthesis and myelination, maternal iron
status is an important modulator of fetal alcohol-induced
neurobehavioral damage

24. CONCLUSIONS
 As alcohol affects the embryos of mice, can also affect human embryos, causing
damage to the genome.
 Alcohol is a major cause of methylation of DNA and proteins responsible for the cell
cycle regulation, one of the leading causes of mutation.
 The different tests that were performed for proteins, were essential to compare
embryos exposed to ethanol and the controls, to so identify the alterations.
 In embryo culture is very important to take good care to pregnant mice, both at the
time to care it, and at the time of removal off the embryo, so that it can make a good
testing.

25. Natalia Zapata Zuluaga

26. Steven Olaya Ramírez