1. Universidad de Puerto Rico en Arecibo, Departamento de Biología 1
Comparación de la concentración y perfil de proteínas
totales en saliva de mujeres de distintas edades.
Jaileen M. Arce Román, Mariela González González, Christelle Curbelo Rodriguez, Jomara
González Figueroa, Iliana Estremera Vélez, María T. Medina Berrios, Lourdes R. Torres
Villanueva, María Colón Morales, Sasha C. Rivera Vega, Axel J. Dorta Rivera.*
RESUMEN ABSTRACT
El propósito de esta investigación fue el The purpose of this investigation was to
poder comparar las concentraciones y el perfil de las compare the concentrations and the profile of
proteínas presentes en la saliva de mujeres de proteins present in the saliva of women of different
diferentes edades. Existen varias proteínas presentes ages. There are several proteins in the saliva, these
en la saliva, estas nos ayudan en procesos digestivos help us in the digestive processes and exert an
y ejercen una acción antimicrobiana que nos ayuda a antimicrobial action which helps us to fight against
combatir algunas enfermedades. En este estudio se some diseases. In this study we analyzed four saliva
tomaron cuatro muestras de saliva de mujeres de samples from women of 17, 19, 49 and 50 years old.
17,19, 49 y 50 años de edad. Con cada una de ellas se With each one of these samples, were made two tests,
realizaron dos pruebas, el análisis de Bradford, para the Bradford assay to determine protein concentration
determinar la concentración de proteínas y la técnica and the electrophoresis in SDS-PAGE, to get the
de electroforesis en SDS-PAGE, para poder obtener possible profiles of the proteins. As a result of this
los posibles perfiles de las proteínas presentes. Como study, we observed that young women have higher
resultado de este estudio, pudimos observar que las concentrations of protein than adults, while adult
mujeres jóvenes poseen mayor concentración de women have more protein than younger.
proteínas que las adultas, mientras que las mujeres de
mayor de edad poseen más proteínas que las jóvenes.
Palabras clave: proteínas, saliva de mujeres, concentración y perfil de proteínas.
Key words: proteins, women’s saliva, concentration and proteins profile.
INTRODUCCIÓN parótidas y está encargada de desdoblar el
almidón y transformarlo en hidratos de
La saliva es un líquido claro producida carbono solubles.5 Otras de las proteínas
por glándulas salivales las 24 horas del día. encontradas en saliva lo son la muramidasa o
También es un determinante importante para lisozima que atacan el acido murámico de
la salud oral, además tiene cierta función en algunas bacterias, también se encuentra la
digestión, lubricación y formación de capas lipasa lingual la cual su función es importante
que ayudan a la protección de los dientes y para la digestión de la leche y esto es de
superficies orales.5 La unidad básica de las importancia para los recién nacidos.5
glándulas salivares es el salivón, formado por Encontramos también la lactoferrina, esta
ácinos, entre otros conductos.5 Los ácinos proteína liga al hierro y así priva de este
están formados por células serosas y mucosas, elemento a microorganismos dependientes de
responsables de la segregación de proteínas.5 éste.5 Además, encontramos la Inmunoenzima
La saliva humana tiene una gran α-amilasa la cual inicia la digestión de los
variedad de proteínas que participan en la
digestión, la lucha contra las enfermedades y
otras funciones. Entre las proteínas más *Estudiantes de segundo año, Universidad de Puerto
abundantes de la saliva se encuentra la Rico en Arecibo, Bachillerato en Ciencias con
concentración en Microbiología.
amilasa, que es producida por las glándulas

2. Universidad de Puerto Rico en Arecibo, Departamento de Biología 2
hidratos de carbono5, también se encuentran permite esto, por eso es uno de los más
las inmunoglobulinas A que son las proteínas preferidos ya que su técnica es simple, rápida
que más proporcionan protección contra y más sensible que otros análisis.
microorganismos cariogénicos.1 Además de Para el conteo de proteínas en saliva,
las ya mencionadas, se encuentran utilizamos el método de SDS-PAGE.
muchísimas otras proteínas importantes en la SDS-PAGE es una abreviatura para la
saliva, las cuales poseen diferentes funciones, electroforesis del gel de poliacrilamida del
entre estas se encuentran la albúmina, sulfato dodecyl de sodio (SDS).6 Es una
cistatina, estaterina, histatina, peroxidasa, técnica de gran alcance para separar mezclas
proteínas ricas en prolina (PRPs), entre otras. de proteínas. Las proteínas se exponen al
Los científicos buscan desde hace detergente iónico SDS antes y durante la
tiempo maneras de utilizar estas proteínas electroforesis del gel, debido a que esta
como “huellas digitales” moleculares para desnaturaliza las proteínas, haciendo las
desarrollar pruebas de diagnóstico rápido que proteínas disociarse en sus subunidades, y
proporcionen una nueva alternativa, diferente todos los encadenamientos del polipéptido
a las pruebas de sangre.7 Otros estudios han son forzados en conformaciones extendidas
revelado que las proteínas encontradas en con la carga similar. Por otra parte, el peso
saliva difieren con la edad, esto debido a que molecular de una proteína se puede
a mayor edad, las personas están más determinar por la comparación a una escala de
propensas a la adquisición de enfermedades y la proteína o a la escala del peso molecular
estas, a su vez, afectan las glándulas salivales, que se ejecuten en el mismo gel.6
las cuales secretan proteínas. Ejemplo de estas Esta investigación se ha realizado con el
enfermedades lo son las autoinmune como propósito de comparar e identificar las
también los medicamentos que se consumen distintas concentraciones y perfiles de
para que actúen contra dichas enfermedades.10 proteínas, encontradas en la saliva de mujeres
Para lograr la identificación de las jóvenes y adultas.
proteínas en la saliva y para obtener la
concentración de éstas, se requiere la MÉTODOS
utilización de métodos y análisis que sean
útiles y apropiados para la investigación. Para llevar a cabo este estudio se
Entre los métodos de identificación de seleccionaron cuatro personas entre las edades
proteínas se encuentran: la reacción de milion, de 17 y 50 años. A cada persona se le dijo que
la reacción de biuret, Hopkins-Cole, no comieran ni tomaran nada por un periodo
electroforesis en SDS-PAGE, entre otros. de dos horas antes de recolectar la saliva.
Entre los análisis de concentración de
proteínas podemos mencionar: el análisis de La curva estándar
Bradford, el de Biuret, Lowry, BCA, entre Para obtener una curva estándar se
otros. determina la concentración de la proteína por
En este experimento, para lograr el análisis de Bradford. Se preparan cuatro
obtener la concentración de las proteínas tubos de calibración y un tubo blanco de la
utilizamos el análisis de Bradford. Este es un siguiente forma: primero se realiza el tubo
procedimiento simple para la determinación blanco que contiene 100µL de 0.15 PBS y
de la concentración de proteínas en 1mL del reactivo Bradford. Luego se procede
soluciones. En una valoración de la a realizar el tubo 1 con 5µL de 0.5 mg/ml
concentración de proteínas, es esencial la BSA (albúmina sérica de bovino), 95µL de
rapidez y exactitud, y el análisis de Bradford 0.15 PBS y 1mL de Bradford. El tubo 2 se

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prepara con 10µL de 0.5mg/ml BSA, 90µL de Concentración de proteínas en la saliva
0.15 PBS y un 1mL de Bradford. El tubo 3 se Para saber la cantidad de proteínas en
realiza con 15µL de 0.5mg/ml BSA, 85µL de la saliva, en esta investigación se utilizó el
0.15 PBS y 1mL de Bradford. Por último el método de Bradford. En dicho método se une
tubo 4 se prepara de la siguiente manera: un colorante hidrofóbico que es el azul
20µL de 0.5mg/ml BSA, 80µL de 0.15 PBS y Coomasie a las proteínas. Las proteínas al
1mL de Bradford. Todos los reactivos se unirse al colorante azul forman un complejo
transfieren con las micropipetas proteína-colorante. Para realizar el método de
correspondientes. Después de preparar los Bradford se centrifuga 500µL de saliva en una
tubos se llevan al vortex para que los microcentrífuga a 13,000 rpm por un periodo
reactivos se homogenicen, se dejan reposar de 10 minutos. Luego, ya la saliva
por un periodo de 2 minutos a temperatura centrifugada se pasa a realizar el método
ambiente. Luego se toma un tubo especial Bradford. También se prepara un tubo blanco
para el espectrofotómetro, para medir la (proceso explicado anteriormente para la
absorbancia de la concentración de proteínas curva estándar). Se llevan los microtubos al
a 595nm. En la tabla 1 se muestran los vortex y se dejan reposar por 2 minutos.
resultados obtenidos de la absorbancia y en la Luego se transfiere un 1mL de cada solución
gráfica 1 se muestra la curva de calibración. al tubo especial para el espectrofotómetro y se
mide la absorbancia a 595nm. Con la curva
estándar y la absorbancia de las muestras se
Tabla 1. Datos obtenidos para la realización calcula la concentración de proteínas.
de la curva de calibración
Tubo A 595 nm Concentración Antes de realizar la electroforesis en
de proteínas SDS PAGE, se necesita determinar la
cantidad de muestra a utilizarse para 30µg,
Blanco 0 0
esto se determina dividiendo 30µg entre la
1 0.0988 2.5 cantidad de concentración de proteínas
2 0.2379 5.0 obtenidas (Tabla 2). Finalmente, con estos
3 0.3706 7.5 resultados se procede a realizar la
electroforesis en SDS-PAGE.
4 0.5019 10.0
.
Gráfica 1. Curva de calibración Tabla 2. Cantidad de muestra a utilizarse para
30µg.
Absorbancia
Muestra Cantidad de muestra a
utilizarse µg
1 30/7.7 = 3.89 = 4
2 30/3.4 = 8.82 = 9
3 30/5.6 = 5.36 = 5
4 30/3.1 = 9.68 = 10

4. Universidad de Puerto Rico en Arecibo, Departamento de Biología 4
Electroforesis en SDS-PAGE La solución fue vertida suavemente sobre el
SDS-PAGE es el acrónimo en inglés gel de corrida ya polimerizada y se colocó un
de sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel peine lento y cuidadosamente para evitar que
electrophoresis (electroforesis en gel de se crearan burbujas y afectaran el gel. Luego
poliacrilamida con dodecilsulfato sódico).4 Es de que el gel de apilamiento estuviese
una técnica para separar moléculas biológicas polimerizado completamente, se colocó el
en dependencia fundamentalmente de su soporte para ensamblaje en el tanque de
carga bajo la influencia de un campo electroforesis con suficiente buffer de corrida
eléctrico. de manera que se quedaran sumergidos los
Para llevar a cabo el proceso de electrodos. Se quitó cuidadosamente el peine
electroforesis en SDS-PAGE, se comenzó por para no romper el gel y dejar los pocillos
el ensamblaje del equipo del sistema de libres. Se sembraron 16μl de muestra, las
electroforesis vertical. Los cristales previa- cuales fueron preparadas tal y como se
mente limpios, fueron colocados según las muestra en la tabla 4, en diferentes pocillos
instrucciones de la casa comercial. Con el utilizando un “tip” de pipeta de punta larga
equipo ya montado, se empezó a preparar el descartable. Seguido de eso se sometieron las
gel de corrida, para un gel de poliacrilamida muestras a electroforesis aplicando corriente
al 12%. Luego de tener la solución de (200 V).
acrilamida, se vertió cuidadosamente con una La determinación adecuada de corrida
pipeta por el espacio entre los cristales es muy importante, pues corridas muy cortas,
dejando aproximadamente 1.5cm de distancia impiden que las muestras avancen el espacio
para la solución del gel de apilamiento y necesario para su correcta separación. Se
seguido se añadió cuidadosamente 200μl de observó la corrida por 40 minutos
SDS al 1% para evitar la polimerización aproximadamente. Después de esperar, se
irregular del gel. Se esperó hasta observar que quitaron los vidrios cuidadosamente para no
la solución sobrante se polimerizara romper el gel, se despegó el gel y se sumergió
completamente para luego comenzar la en un envase con una solución de azul
preparación del gel de apilamiento. Se Coomassie para teñirlo. Se esperó varios
preparó 4ml de gel de apilamiento al 4% minutos en lo que adquiría el color esperado y
según lo indica la tabla 3. luego se devolvió el azul Coomassie a su
Para poder observar la diferencia entre envase y se vertió una solución descolorante
los dos geles, se le añadió azul bromofenol al (100 ml de metanol, 100ml de ácido acético
0.003% a la solución del gel de apilamiento. glacial y 800ml de agua destilada), para
desteñirlas, ya en esta solución el gel puede
Tabla 3. Cantidades de reactivos para quedarse para almacenarse.
chorrear gel de poliacrilamida al 12%.9
Gel de Gel de Tabla 4. Preparación de las muestras
corrida apilamiento Muestra µg
ddH2O 3.2ml 6.1ml 1 Muestra: 4 + Buffer: 2
Buffer 2.5ml 1.5ml + Agua : 10
(pH 8.8) (pH 6.8) 2 Muestra: 9 + Buffer: 2
SDS 10% 100 μl 100 μl + Agua : 5
Acrilamida 4.2ml 1.3ml 3 Muestra: 5 + Buffer: 2
TEMED 5 μl 10 μl + Agua : 9
APS 10% 50 μl 50 μl 4 Muestra: 10 +
Buffer: 2 + Agua : 4

5. Universidad de Puerto Rico en Arecibo, Departamento de Biología 5
RESULTADOS cuales proteínas se encuentran en la saliva y
cuál es el peso molecular de cada una de ellas.
Después de haber realizado cada Los resultados de dicha investigación están
prueba, pudimos obtener los siguientes presentes en la tabla 6.
resultados: Luego de haber obtenido los datos de
la tabla 6, se pudo determinar cuáles eran
Análisis de Bradford aproximadamente los pesos moleculares de la
Según el análisis de Bradford, proteínas utilizando el marcador (Broad
pudimos observar que la absorbancia y la Range Protein Molecular Weight Markers)
concentración de proteínas por muestra fueron como referencia y a la vez pudimos
variadas. En la muestra #1, se obtuvo una determinar el perfil de cada una de las
absorbancia de 0.3758nm, en la muestra #2 de proteínas presentes en las muestras. La tabla
0.1457nm, en la #3 de 0.2665nm y en la #4 7 y tabla 8 muestran los resultados obtenidos.
de 0.1314nm. Luego de obtener la absor-
bancia, pudimos determinar la concentración
de proteínas en µg/µl. Para la concentración
de proteínas era muestra #1 se obtuvo que la
de aproximadamente 7.7 µg/µl, en la muestra
#2 era de 3.4 µg/µl, muestra #3 de 5.6 µg/µl y
muestra #4 de 3.1 µg/µl. En la tabla 5 se
pueden observar más detallados los resultados
de este análisis.
Tabla 5. Resultados análisis de Bradford.
Muestra Absorbancia Concentración
595nm de Proteínas
μg/μL
1 0.3758 nm 7.7 μg/μL
(17 años)
2 0.1457 nm 3.4 μg/μL
(19 años)
3 0.2665 nm 5.6 μg/μL
(49 años)
4 0.1314 nm 3.1 μg/μL
(50 años)
SDS-PAGE
Al realizarse la técnica de Figura 1. Gel con bandas de proteínas.
electroforesis en SDS-PAGE, se obtuvo la gel
con las diferentes bandas de proteínas, la
figura 1 muestra dichos resultados. Para
poder obtener los resultados de esta técnica,
primeramente se hizo una investigación de

6. Universidad de Puerto Rico en Arecibo, Departamento de Biología 6
Tabla 6. Proteínas más comunes de la saliva Tabla 7. Peso molecular aproximado de las
y su peso molecular. bandas de proteínas, presentes en las distintas
muestras de salivas.
Posibles proteínas Peso molecular
(kDa) muestra muestra muestra muestra muestra
M #1 #2 #3 #4
Amilasa 45 (marker)
Albúmina 35
Cistatina 13 225 240 125 240 225
Estaterina 6 150 125 85 225 130
Histatina 8 3 100 85 52 190 90
75 52 50 125 52
Inmunoglobulina A 15
50 50 45 52 50
Inmunoenzima α- 50 Peso
amilasa Molecular 35 45 35 50 45
Lactoferrina 8 80 en
kilodaltons
25 15 10 45 35
Lisozima 8 14 15 10 8 35 32
Mucinas 100-250 10 5 5 32 14
Muramidasa 13.900 14 10
Peroxidasa 8 30 10 5
Proteínas ricas en 5
prolina 37
(PRPs)
Tabla 8. Posibles proteínas presentes en las muestras de saliva.
Muestra Muestra Muestra Muestra
#1 #2 #3 #4
mucina mucinas mucinas mucinas
lactoferina lactoferina inmunoenzima lactoferina
α-amilasa
inmunoenzima inmunoenzima amilasa inmunoenzima
α-amilasa α-amilasa α-amilasa
amilasa amilasa albumina amilasa
inmunoglobulina A albúmina peroxidasa albúmina
muramidasa muramidasa lisozima peroxidasa
estaterina estaterina muramidasa lisozima
Proteínas lisozima cistatina muramidasa
estaterina cistatina
histatina estaterina
proteínas ricas en histatina
prolina(PRPs)
inmunoglobulina A proteínas ricas en
prolina(PRPs)
inmunoglobulina A

7. Universidad de Puerto Rico en Arecibo, Departamento de Biología 7
DISCUSIÓN experimento aunque difiere con el nuestro, en
que se compara la saliva de mujeres con la de
En los últimos años se ha demostrado los hombres, se asemeja en que en relación a
como la saliva ha tomado un papel muy la concentración de proteínas, nuestras
importante en la investigación. Actualmente muestras en el análisis de Bradford, al igual
gracias a nuevas técnicas, es posible utilizar la que la de ellos, expresaron que las mujeres
saliva no solo para diagnósticos, sino también jóvenes poseen mayor concentración de
en el monitoreo de drogas y contaminantes proteínas.
ambientales.3 Gracias a estos hallazgos los expertos
En el presente experimento realizado, aseguran, que esto ayudará a facilitar el
si comparamos nuestros resultados con los de diagnóstico y tratamiento de enfermedades
otros estudios relacionados con la saliva, que afectan a la mujer en el envejecimiento.2,3
podemos observar que encontramos algunas
semejanzas. Comparando los resultados CONCLUSIÓN
obtenidos en nuestras muestras con el artículo
publicado por la revista Journal of Proteome  En nuestra investigación, según los
Research, titulado: “Quantitative Analysis of resultados, se comprobó que la saliva
Age Specific Variation in the Abundance of de mujeres jóvenes posee mayor
Human Female Parotid Salivary Proteins”, concentración de proteínas que las de
realizado por John Yates y su grupo del mayor edad.
Scripps Research Institute, podemos ver que  Las mujeres de mayor edad contienen
los resultados que nosotros obtuvimos son una cantidad mayor de proteínas,
semejantes a los de ellos.2 Estos científicos comparada con la de las jóvenes.
analizaron las proteínas de la saliva en  Estos resultados pueden ayudar en la
mujeres de 20 a 30 años y 55 a 65 años de investigación de nuevos métodos para
edad. En estas muestras identificaron que el avance de diagnósticos y
entre los dos grupos de edad había una tratamientos de enfermedades
diferencia de 293 proteínas, siendo las comunes en las mujeres de edad
mujeres de más edad las que llevaban casi el avanzada.
doble de proteínas relacionadas a la
inmunidad que las mujeres jóvenes. En
relación con la cantidad y el perfil de las AGRADECIMIENTOS
proteínas, podemos ver que nuestros
resultados fueron similares a los reportados A la Universidad de Puerto Rico en
por el Sr. Yates, ya que en las muestras de Arecibo y al Departamento de Biología, por
mujeres de 49 y 50 años, gracias a la habernos proporcionado el laboratorio de
electroforesis en SDS-PAGE, pudimos ver Microbiología y los materiales necesarios para
que éstas contenían mas bandas de proteínas llevar a cabo nuestra investigación y
que las muestras de mujeres jóvenes. especialmente a la Profesor Marilisa Amador
En lo que respecta a la concentración Beauchamp, por habernos instruido con sus
de proteínas, podemos ver que en el artículo conocimientos y por dirigirnos en todo
científico titulado “Flujo y concentración de momento durante la realización de dicha
proteínas en saliva total humana”, sus investigación.
autores, en sus resultados nos muestran que
las mujeres jóvenes presentaron la mayor
concentración de proteínas.3 Este

8. Universidad de Puerto Rico en Arecibo, Departamento de Biología 8
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