1. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
(Primera Parte: en columna)
Dentro de la clasificación general de los métodos cromatográficos, este tipo de procedimiento
trata el caso en el que la dase móvil es un líquido. Por otra parte recordemos que según sea
la fase fija: liquida sobre un soporte sólido inerte, o un sólido activo, estaremos ante una
cromatografía de partición o de absorción, respectivamente. De acuerdo a los elementos
usados se consideran tres grupos: en columna; papel y capa fina.
El presente capitulo concretará su enfoque en el caso de “Cromatografía de líquidos en
columna según los mecanismos de partición y/o absorción, por baja o alta performance”.
A tal fin se consideran los siguientes tres aspectos:
1) Aparatos; 2) Fase estacionaria y 3) Fase móvil para baja performance.
1) Aparatos:
Se usan columnas de diversos materiales: vidrio, cuarzo, plástico, celofán o metálicas. En
lo referente a formas y dimensiones; se representan de distintas secciones: cuadradas,
circulares, cilíndricas y elípticas. Comprobándose que la más apropiada es la de sección
circular. El tamaño depende de la cantidad de soporte que se use, pero debe ser la relación
longitud/ diámetro bastante mayor que uno.
Le Rosen comprobó que la velocidad del flujo del solvente a través de la columna es
independiente del diámetro (columnas conteniendo hidróxido de calcio y con diámetros de
17,43 y 70 mm e igual longitud, dieron la misma velocidad de flujo).
En cuanto a funcionamiento presenta las siguientes alternativas:
Ascendente
Vertical: con flujo descendente
En forma horizontal
Inclinada
La aceleración de la gravedad
Por acción de presión aplicada en la parte de entrada
Succión a la salida
Es importante la forma de rellenado:
Las columnas pueden empacarse húmedas o secas. El
método “húmedo” es mejor por el solo hecho de asegurar así el equilibrio entre las fases
estacionaria y móvil. A tal fin se introduce como una papilla con el eluyente. Previamente se
elimina el aire y se agrega un poco de disolvente puro. Luego de instalada la pasta en la
columna, se elimina el exceso de disolvente.
El empaque en “seco” consiste en colocar, como en el caso anterior, un elemento de
sustentación del relleno(por ejemplo lana, vidrio); se toma el tubo con una mano y se
introduce una pequeña cantidad de material (soporte o absorbente según sea partición o
absorción el mecanismo, el material es empujado hasta el otro extremo hasta quedar apoyado
en el elemento de sustentación, así se prosigue el rellenado con pequeños incrementos en la
sustancia en cuestión cuidando que la presión ejercida sea solo la necesaria para dar firmeza

2. en la columna, por fin se estabiliza el relleno con una cobertura con un disco de papel de filtro
o de lana de vidrio. Es conveniente que se invierta en cierto tiempo y cuidado en la
empaquetadura ya que de lo contrario se producirán “anillos de presión” cuando pase la fase
móvil. Este efecto se debe a que cuando se introduce una gran cantidad de material de una
vez, la presión que se aplica en la parte superior no se transmite en forma efectiva a la
porción inferior. Este efecto está representado en la figura 1.
Concluimos pues que el avance regular de la fase móvil está garantido si se observa el
procedimiento descrito en la forma más rigurosa posible.
2) Fase estacionaria:
Ella depende del mecanismo de separación:
Partición o adsorción. En el primer caso, se inmoviliza el líquido en un soporte inerte. Las
fases caracterizan según dos clases: hidrofílicas y fase reversa. El soporte preferentemente
debe ser inerte y es por ello que se han utilizado con más frecuencia: ácido silícico, tierras
diatomeas, celulosa en polvo, vidrio en polvo y goma de celulosa.
Como fase fija se usan líquidos de diversos tiempos cuyas polaridades varían desde la
correspondiente al agua (muy elevada) hasta hidrocarburos parafínicos.
En el caso de adsorción, el relleno debe ser activo y en general
cualquier solido poroso que no sea muy soluble en la fase móvil es apropiado. Entre ellos
encontramos las alúminas preparadas por deshidratación del hidróxido, por hidrólisis o
neutralización de sales. Las ventajas de este material son: gran capacidad, blanca, insoluble y
químicamente inerte, barata, fácilmente obtenible y muy versátil.
Los rellenos a usar, previamente deben ser sometidos a diversos
tratamientos: activados, desactivados y estandarizados.
Activación:
Esta operación se lleva a cabo de las siguientes formas:
a) Por remoción de sustancias que bloquean los lugares activos de la superficie.
b) Por mejora del área superficial, la porosidad o grupos funcionales.
En el primer caso se puede recurrir a a-1) activación por calentamiento; a-2) por lavado con
solventes inertes y a-3) por uso de reactivos químicos. La segunda alternativa (b) se logra por
calentamiento.
a-1) Activación por calentamiento: tienen por fin el de eliminar el agua presente en forma
parcial. Se debe evitar el sobrecalentamiento ya que éste puede tener un efecto
contraproducente.
a-2) Activación por lavado con solventes inertes: se realiza por lavado con solvente caliente
en la misma columna cromatográfica o por proceso “batch”.
a-3) activación por reactivos químicos: para ello se produce el lavado con ácidos, bases u
oxidantes, lográndose la remoción de las sustancias que bloquean los lugares activos del
material. Esta operación debe llevarse a cabo cuidadosamente ante el riesgo de provocar
cambios indeseables en el comportamiento del adsorbente.
Desactivación:

3. Es requerida en algunos casos la desactivación para lograr isotermas menos
curvada y para eliminar alguna propiedad no deseada del relleno o en el caso extremo,
cuando se requiere que el mecanismo sea de partición, lograr la inercia total del material..
Estandarización:
A los fines de poder lograr cierta reproducibilidad en las medidas que
conducen a la identificación y evaluación cuantitativa de los componentes de una muestra, es
imprescindible que el adsorbente a usar sea estandarizado. Esto se lleva a cabo evaluando la
capacidad del mismo frente a un grupo de sustancias o bien en base a la selectividad de
pares de sustancias. (No tiene sentido los términos de capacidad o selectividad cuando no se
los refiere a “algo”).
La capacidad de un adsorbente se puede medir mediante adsorción en batch:
una cantidad pesada de adsorbente se coloca como lecho y la solución test pasa al mismo. La
cantidad adsorbida se evalúa mediante el cambio en la concentración de la solución.
Otro método de estandarización es el de Brokmann: la alúmina se activa
(deshidrata) por calentamiento y posteriormente es desactivada con grados controlados de
exposición en aire. Otra forma es mediante el pasaje de una solución de rojo sudan en éter de
petróleo en una columna: el ancho de banda está en relación inversa al grado de actividad de
la alúmina.
Se establecen, para un adsorbente dado, cinco grados de actividad según el contenido de
agua adsorbida: I. . . . . . 0% de H2o
II. . . . . 3% “ “
III. . . . 6% “ “
IV. . . . 10% “ “
V. . . . . 15% “ “
Esta escala fue sugerida por Brokmann mediante la desactivación progresiva de la alúmina al
agregar agua: para una actividad deseada se coloca una cantidad conocida de alúmina
activada a grado I en un frasco con una cantidad apropiada de agua, se cierra el frasco y se
agita la mezcla por muchas horas. La actividad según el método se mide por la habilidad de
separar mezclas de seis colorantes:
Metoxiazobenceno (A) Amarillo Sudán (B)
Rojo Sudán (C) Aminoazobenceno (D)
Hidroxiazobenceno (E) Azobenceno (F)
Definió la actividad de la alúmina de tal forma que en condiciones estándar los dos más
débilmente adsorbidos sean recogidos y separados por la alúmina más activa (Gº I) mientras
que los más fuertemente adsorbidos se separaban por la última de menor actividad:
Tamaño de las partículas de Relleno:
Este aspecto ejerce una influencia importante en la
calidad de las separaciones. Tswett observó que adsorbentes de gran granulometría dan

4. cromatogramas borrosos mientras que los adsorbentes pulverulentos dan mejores resultados.
Sin embargo es difícil establecer una prescripción absoluta acerca de cual es el mejor tamaño
de partícula. Existe una interrelación entre el “diámetro” de partícula y el diámetro de la
columna. Además se incluye como factor, la facilidad de manipulación y relleno, en general es
más fácil empacar columnas homogéneamente con partículas de regular tamaño que con
pequeñas.
Velocidad de adsorción:
Se probó que en un comienzo se produce una adsorción rápida(al
menos de veinte segundos se adsorben las 2/3 partes), disminuye luego la velocidad de
adsorción requiriéndose unos cuantos minutos (20 aproximadamente) para completarse el
proceso. Esto explica el porque de los escalones en el análisis frontal. Por otra parte, la
velocidad de desorcion es del mismo orden que la de adsorción.
Velocidad de flujo:
En lo referente a la velocidad de flujo de la fase móvil, al contrario a lo que
ocurre en cromatografía de gases (recuérdese que al graficar “altura efectiva de plato” vs
velocidad de flujo, se puede calcular la velocidad optima que hace mínima la “ATEP”), en todo
momento a mayor velocidad de flujo mayor “altura de plato”.
Cuando la velocidad de flujo decrece por un periodo y luego retorna a su
valor original (por cambio de la presión) se observa la ruptura en la curva de concentración del
efluente, es decir que resulta perjudicial interrumpir una experiencia y continuarla después.
Uniformidad de la empaquetadura:
Se comprobó que las irregularidades a través de la
columna
son normalmente grandes comparadas con la difusión o la falta de agudeza de la banda. Se
introduce el % de distorsión (longitud del frente/ distancia media que se ha movido el frente) o
bien:
Los mejores resultados fueron en el caso en el que tal porcentaje evalió aproximadamente
cinco.
3) Fase móvil:
Se deben distinguir los siguientes términos:
Solventes, desarrollantes, eluyente y desplazantes.
Solventes: son en general más o menos inertes hacia el adsorbente o los adsortivos. Se usan
como portadores de la mezcla que se debe separar.
Eluyente: remueve los adsortivos de los adsorbentes.
Desalazantes: aquellos eluyentes con fuerza eluctante alta
Desarrollantes: eluyentes con fuerza eluctante baja.

5. Estas series se deben usar con cautela ya que pueden presentarse irregularidades que
pueden ser explicadas teóricamente.
Formas de elección de las fases:
La figura brinda una interesante orientación para la elección
de las faces conocida la naturaleza de la mezcla a separar: se señala con e vértice del
triangulo equilátero giratorio el grado de polaridad de la mezcla y los restantes vértices
indicaran el grado de actividad de la fase estacionaria y polaridad de la móvil.
• 1 pentano 10 Cloroformo
• 2 Éter de petróleo 11 Dietileter
• 3 N- hexano 12 Acetato de etilo
• 4 N- heptano 13 Piridina
• 5 Ciclohexano 14 Acetona
• 6 Tetracloruro de carbono 15 n-propanol
• 7 Tricloroetileno 16 etanol
• 8 Benceno 17 metanol
• 9 Dicloroetano 18 agua

6. Desarrollo cromatográficos
Anteriormente, cuando se introdujeron generalidades de la
cromatografía, se describieron los desarrollos frontal, por desplazamiento y por elución. Ahora
es oportuno agregar dos tipos más: Elución Fraccionada y elución gradual.
Elución Fraccionada:
En este desarrollo, se utilizan distintos disolventes, siendo cada uno
más enérgico que el anterior. Este procedimiento permite abreviar la elución de las sustancias
fuertemente adsorbidas.
Elución gradual:
Si las isotermas no son lineales, dijimos que se presentan cromatogramas
distorsionados: frente difuso o colas. En el ultimo caso, se logra disminuir la magnitud de las
colas mezclando con el eluyente que se usa en la columna, otro más enérgico a
concentración gradualmente mayor. Así se establece un gradiente de concentración a lo largo
de la columna que hace que la parte posterior de cualquier banda o zona cromatográfica se
encuentre siempre en contacto con una solución eluyente más enérgica que la parte frente.
Cromatografía liquida de alta velocidad
La dificultad principal que la presenta la cromatografía liquida tradicional es la lentitud. Si los
gránulos son lo suficientemente pequeños para dar una buena separación, la velocidad
decrece a unas gotas por minuto.
La cromatografía de gases, presenta el inconveniente de las elevadas temperaturas de trabajo
que pueden destruir la muestra, así también, limita la posibilidad de elección de las fases fija y
móvil.
Es así que surge en forma muy reciente la cromatografía liquida de alta velocidad
(performance) que compite muy ventajosamente en muchos casos con la cromatografía de

7. gases. Para efectuar las separaciones con rapidez, el eluyente se hace pasar a través de la
columna a velocidades lineales de flujo que pueden ser hasta 100 veces la de la
cromatografía tradicional.
Es de hacer notar que la eficiencia (expresada en “ATPE”) es mayor cuanto menor sea la
velocidad.
Esto esta representado en la figura 4 Implica que al aumentar la velocidad, para compensar
esta disminución de eficiencia, se deberán aumentar la longitud de la columna, disminuir el
diámetro y mejorar el empaque.
Además, al trabajar en condiciones de alta presión, los materiales de construcción de
las columnas serán más resistentes.
Esquemáticamente, los componentes de un cromatógrafo de líquidos de alta velocidad e
indican en el diagrama de la figura 5.-
A veces se suelen sustituir el depósito y la bomba, por un depósito de presión. La
cromatografía de líquidos es especialmente aconsejable para separar proteínas y nucleósitos,
que no pueden soportar temperaturas elevadas para volatilizarlos.
La figura 6 ofrece un mayor detalle de los componentes de un “CLAP” o HPLC
deposito
Bomba Inyec
tor
Columna
Detector
Registrador
Colector de
fracciones
Medidor de
flujo

8. Los depósitos Ay B están provistos de cámaras desgasificadoras que eliminan el aire disuelto.
Los líquidos se mezclan (o se toman solo uno de ellos) al colocar adecuadamente la válvula
mezcladora o manejar las presiones con las dos válvulas.
Esta válvula puede programarse con un motor de velocidades de modo que las proporciones
de los dos disolventes puedan cambiarse durante el proceso de una separación
cromatográfica si así se desea. Luego el líquido mezclado se bombea a alta presión al
cromatografo situado en una cámara a temperatura controlada. El liquido pasa primero a
través del tubo, que lo pone a la temperatura de trabajo y después por la pre columna cargada
con el mismo soporte sólido y la misma fase liquida estacionaria de la columna principal, para
asegurar que la fase móvil esta saturada de la fase fija, evitando así cualquier eliminación de
la columna analítica. La muestra se introduce entre la precolumna y la columna principal, por
medio de una jeringa. El efluente de la columna pasa por un lado del detector diferencial hacia
un colector de fracciones o bien se desecha. El material de referencia para el detector, consta
de una fracción del disolvente tomada de la corriente principal un poco antes de la inyección
de la muestra por medio de una válvula divisoria de flujo.
Bombas:
La bomba que fuerza el líquido a pasar por la columna a una velocidad satisfactoria,
más comúnmente es impulsada por un motor. Dado que los detectores usados por lo general
son sensibles al flujo, la bomba de liberar al líquido a una velocidad constante, sin
pulsaciones. Una forma consiste en introducir dos cilindros y pistones programados de tal
modo que uno se llene rápidamente mientras el otro se vacía en forma lenta; después, este
último lleva a cabo la función de llenado mientras su compañero se vacía, y así cíclicamente.
Debe producir presiones estables hasta 6000 psi.
Mantener el flujo libre de pulsaciones
Generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min)
Control y reproducibilidad del flujo de solvente
Componentes de la bomba resistentes a la corrosión Las bombas que se usan en HPLC se
pueden clasificar según su funcionamiento y diseño en:
Mecánicas

9. Recíprocantes
Desplazamiento contínuo
Neumáticas
Columnas:
Tienen un diámetro interno de 1 a 6 mm, una longitud de 30 a 100 cm y son de
acero inoxidable o de vidrio. Las columnas cortas son recetas y las mas largas enrolladas
(long 600 cm). Las columnas frecuentemente operan a temperatura ambiente. La velocidad de
una difusión puede que aumentar de un poco al incrementar la temperatura, por lo que se
suele usar una camisa de calentamiento, sin embargo en “CLAP” el control de la temperatura
no es tan significativo como en CG
Gradiente de elución:
El equivalente de la programación de temperaturas usada en CG es
gradiente de elución o programación del disolvente. Esto causa un cambio en los coeficientes
de partición de los componentes y puede conducir a una mejor resolución. Se cambia
gradualmente la composición durante el proceso de separación por medio de la válvula
mezcladora programada.
Existen dos métodos de programación de Solvente en HPLC:
Isocrático
Gradiente de Elución. Es un término que se utiliza para describir el proceso mediante el cual
se cambia la composición de la fase móvil. Pueden efectuarse de dos maneras:
A baja presión
A alta presión
Permite obtener la mejor resolución de los componentes de la muestra en el menor tiempo
posible.
Cuando se desarrolla un análisis usando el método de gradiente se debe tener presente dos
objetivos:
Asegurar alta precisión y exactitud.
Determinar la composición inicial y final del solvente
Para obtener buenos resultados con el método de gradiente debemos seguir 4 pasos
fundamentales:
a) Ajustar el tiempo del gradiente
b) Determinar la forma del gradiente (lineal, concava o convexa)
c) Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resolución
d) Regresar a las condiciones iniciales la columna.
Sistemas de Inyección de muestra
Estos sistemas han variados durante la historia del sistema de HPLC, en un principio de
utilizaba la inyección de la muestra con jeringas de alta presión cuales ya están de desuso.
Hoy se utiliza el sistema de válvulas inyectoras
Detectores:
Se usan mas formas de detección en la de “CLAP” HPLC que en la CG ya que
hay absorción de radiación ultravioleta o visible. Constan de celdas para la muestra y la
referencia en forma cilíndricas en un bloque de acero inoxidables o de teflón. Para ultravioleta,
normalmente la longitud de onda de trabajo es de 254 nm ya que la mayoría de los
compuestos orgánicos absorben a esa longitud de onda. También se suelen hacer medidas
simultáneas a 254 y 280 nm. Lógicamente, para una longitud más general se preferirá un
espectrofotómetro que selecciones continuamente las longitudes de onda.
La figura 7 da un esquema simplificado de los componentes de un detector fotométrico.

10. Detectores de índices de refracción:
Basados en la medida de las diferencias de los índices de la refracción hasta de una parte en
106
, lo que corresponde a unas cuantas partes por millón de un soluto orgánico en agua. Este
método no es específico. La ventaja es que pueden remplazarse disolventes cuyas
propiedades físicas interfieren con otras formas de detección.
La desventaja es que no puede usarse con gradientes de elución ya que el cambio de índice
debido a la programación, transforma cualquier señal producida por los componentes eluidos.
La disposición de estos detectores consiste en el desplazamiento angular de un haz de luz
que pasa a través de dos prismas llenos de líquido. Si los dos líquidos son idénticos, el
desplazamiento será nulo, pero a un cambio de una cuantas partes por millón, producirá una
diferencia detectable en el ángulo del rayo.
Cromatografía por filtracion molecular

11. La filtración molecular (permeacion sobre gel, exclusión molecular o tamizado molecular)
fracciona y separa las moléculas según su tamaño. La técnica es simple y rápida y se aplica
tanto en determinaciones analíticas como con fines preparativos, siendo especialmente útil
para la separación de sustancias de origen biológico.
El mecanismo de la filtración molecular consiste en que las sustancias cuyo tamaño molecular
es superior al de los mayores poros de “tamiz molecular” (limite de exclusión) no pueden
penetrar al mismo, por los que pasan en el liquido a través del lecho, emergiendo en el primer
orden de la columna. Las moléculas de menor tamaño, por el contrario, penetran en el
anterior de las partículas de este y por lo tanto son retenidas a mayor o menor tiempo, en la
función de sus formas y tamaños. Las moléculas que emergen de la columna siguen por lo
tanto un origen decreciente respecto a los tamaños moleculares.
Geles:
Red tridimensional formada por ligaduras cruzadas en cadenas largas de polímeros.
Los geles poseen grupos polares capaces de admitir agua, en consecuencia se
produce expansión de la estructura.
El grado de ligaduras cruzadas dará el límite de exclusión. Es decir el tamaño critico de
partículas que no pueden penetrar al interior de los intersticios del gel. Las moléculas que
superan en tamaño crítico pisaran por la columna sin retardación.
Existen tres tipos fundamentales de sustratos usados para realizar la filtración
molecular y que abarcan todas las moléculas desde el peso molecular de 150.000.000 hasta
gases inorgánicos livianos.
1. Geles; 2. Vidrio molido; 3. Materiales cristalinos en polvo.
1. Geles: los geles más comunes son 1-a) Extracto de agar; 1-b) polímetros acrílicos.
1.a) Geles de agar: están compuestos de dos partes: gel iónico; gel no iónico. El no ionico
cumple mejor la función de filtro molecular y elimina los efectos masivos cuando se usa el
agar entero donde el componente iónico produce efectos de intercambio ionico, adsorción y
varias reacciones e interacciones químicas.
El gel de agar más corriente usado es la forma no iónica y puede realizar una separación
molecular desde 10.000 hasta 150.000.000 de peso molecular. Para calibración se utilizan
virus y proteínas.
Este gel se presenta en por lo menos seis porosidades diferentes correspondiente a los
siguientes limites de exclusión: 5x106
; 1,5x106
; 5x106
; 15x106
; 50x106
y 150x106
. Estos geles
se expenden ya preparados según la selectividad deseada y en fracciones de volumen. Una
vez secados estos geles, es prácticamente imposible la reconstrucción.
Estos geles de agar son estables entre pH 4 y 10. Como precaución se debe evitar la
congelación que cambia de forma irreversible sus propiedades y temperaturas superiores a
los 30ª C para evitar ablandamientos. Como en los demás tipos de cromatografías, el grado
de división del sustrato incide en la nitidez de la separación. Para lograr máxima nitidez es
conveniente, no solo usar partículas finas, sino además procurar uniformidad de tamaño.asi
mismo es importante el control de la velocidad del flujo (15ml/h.cm2
) y las dimensiones de la
columna ya que inciden de igual manera que en los otros mecanismos cromatográficos.
1-b) Polímero acrílicos: se utilizan para la filtración molecular en una escala de PM que abarca
desde los 200 a los 400.000 y se producen por la copolimerizacion de la acrilamida con N,N-
metileno-bis-acrilamida. Este polímetro es insoluble en agua y en solventes orgánicos
comunes y se lo puede utilizar en el rango de pH entre 2 y 11.
La selectividad se hace variar en función de las proporciones de los dos componentes de
polímetro en forma al estireno-divinil benceno (estudiados en intercambio iónico)
Estos geles se los expenden en forma seca y ante de preparar la columna es necesario
dejarlos en agua algunas horas para que los geles de poro fino y días para geles mas abiertos
de porosidad.
Para partículas aproximadamente esféricas, volumen de líquidos entre las mismas, en una
columna, corresponde al 40% del volumen total de la resina con el líquido en la columna. Este
valor puede variar entre 35 y 45% según el grado de comprensión, el tamaño de las partículas
y la uniformidad del empaquetado:
Según la figura 8:

12. Vol. de partículas: Vol. 8 esferas 8(π d3
/6)
Vol. total de partículas+ liq.= vol cubo 8 d3
Vol de liq. Intersticial : 8 d3 -
8(π d3
/6) = 22.88 d3
/6
Vol Total 8 d3
-----------------100%
Vol. liq. 22.88 d3
/6------------ 48%
Cuidados: durante el uso y almacenaje de las resinas y geles de toda clase, es necesario
tomar medidas para prevenir la descomposición de las mismas por microorganismos,
especialmente durante las temporadas de calor.
Debido que la mayoría de las resinas y geles no pueden ser desecadas, después de
preparadas, debe recurrirse la refrigeración o al agregado de algunas sustancias para prevenir
el crecimiento microbiológico, las que no deben interferir con el sustrato, los eluctantes o las
muestras. Para el uso general se recomienda la azida (N3 Na) sçodica en una concentración
del 0,02% para conservar las resinas y geles. A veces se nota una alta de nitidez en las
separaciones cromatograficas, especialmente inexplicable para el caso de columna de
diámetros menores de un centímetro. Esto puede ser causado por el escurrimiento de
solvente por las paredes de la columna lo que significa que este no pasa por el sustrato y sale
tal cual con el eluctante. Para subsanar esta situación se puede cubrir la pared interior de la
columna con una sustancia repelente al agua como el dimetil di cloro ailano.
2.Vidrio molido:
El uso de vidrio en polvo es muy útil debido a que se puede hacer con poros
de tamaño muy controlado entre 20 mµ y 250 mµ. Se fabrica este vidrio silicatado, rígido, no
comprimible y con una red tridimensional de poros interconectados y de cinco tamaños
distintos:20;50;100;150 y 250 mµ. Las propiedades del vidrio confieren al mismo muchas
características útiles para su utilización en cromatografía. La estructura rígida permite
velocidades de flujo muy alto y las columnas pueden usarse prácticamente en cualquier
posición.
Otra ventaja es la de poder esterilizar este material de autoclave y destruir la contaminación
orgánica con acido nítrico caliente.
El vidrio poroso es muy útil para separar los virus entre si y de moléculas orgánicas, de menor
peso molecular.
Se usa el vidrio para separar el tolueno del metiliciclohexano y benceno de ciclo hexano.
Además se puede eliminar el agua de acido acético y propionico. Como otros materiales de
vidrio, estos funcionan como intercambiadores débiles de cationes, donde los iones hidrogeno
sirven de grupos activos.
3. Materiales cristalinos en polvo:
Son verdaderos coladores moleculares que permiten la
separación de moléculas chicas con alto grado de selectividad. Los más conocidos son las
zeolitas.
Descripción: figuras 9 y 10 son las representaciones de la denominada “jaula sodalita” que es
el tipo más representativo de zeolita.

13. Fig 9
Los tamices moleculares (en sentido original) son aluminosilicatos metálicos cristalinicos con
una estructura tridimensional de una red interconectada de tetraedros de sílice y alúmina. Los
tetraedro están formados por cuatro átomos de oxigeno rodeando simétricamente a un átomo
de silicio o de aluminio. Cada átomo de silicio tiene cuatro cargas positivas mientras que el
aluminio tiene tres. Esto significa una descomposición eléctrica que hace esta estructura ávida
de cationes para separar tal equilibrio. Es por ello que en estas estructuras existen cationes
sodio, potasio, calcio, esto e hacen de balanceadora de cargas: estas circunstancias le
confieren a las zeolitas propiedades de intercambio iónico y además posibilitan la construcción
de una cantidad de tamices moleculares muy selectivos.
La selectividad esta basada en la relación Si/Al y del tamaño de los cationes compensadores
existentes. En particular, la jaula sodalita esta constituida por octaedros con centros de Al y
tetraedros con centros de Si o Al. Estas estructuras están orientadas en forma cúbica con una
red de variedades de diámetros aproximadamente de 11,5 Å y accesibles por aberturas en
las seis caras , Estas aberturas están rodeadas por ocho de oxígenos. Uno mas cationes
intercambiables bloquean la entrada a los intersticios. En la forma sódica, este anillo de iones
Oxígeno, provee una abertura de 4,2 Å de diámetro.
La formula bruta de la jaula sodalita es: Na12 ((Al02)12)(SiO2)12) xH2O donde X representa el
numero de moléculas de agua que participa en el cristal. El agua de hidratación que llena la
cavidades durante la formación del cristal, esta ligeramente ligada y puede ser quitada con un
moderado
calentamiento que afecte la estructura del cristal. La forma sódica del tamiz molecular tiene
aberturas de aproximadamente entre 4 Å de diámetro; la potásica, 3 Å ;la cálcica 5 Å
.según el tratamiento de quitar el agua, con o sin reemplazo con gas u otro liquido,
intercambiando el sodio por otros cationes y/o modificando la estructura cristalina, se puede
lograr una variación de porosidad entre 3 y 11,5 Å .
A ciertas temperaturas se nota la adsorción de moléculas con diámetros críticos
más grandes que las aberturas efectivas de las zeolitas. Este comportamiento se
debe a una combinación de la elasticidad de la molécula absorbida y a la
vibración de la estructura del cristal como a la movilidad del catión bloqueador
(fig.11).

14. Sin embargo las dimensiones de los poros y de las moléculas son una buena guía orientadora
cuando uno quiere elegir un tamiz para una separación específica.-
Las zeolitas constituyen un sistema de adsorción en donde la cantidad del material adsorbido
aumenta rápidamente a medida que aumente su concentración en la fase fluida, llegando al
equilibrio, un aumento de concentración no produce ningún cambio en la cantidad de material
de adsorbido por el tamiz molecular.
Las técnicas cromatográfica son similares a las ya vistas anteriormente.
Aplicaciones:
1- se las usa para la eliminación de sales de soluciones donde hay
macromoléculas.
2- Para la concentración de soluciones diluidas de macromoléculas utilizando la
naturaleza higroscópica de los geles secos: se puede adsorber 20 veces su peso de agua.
3- Para fraccionar moléculas de diferentes pesos moleculares (proteínas,
péptidos, ácidos nucleicos, polisacáridos, enzimas y hormonas)
4- Para eliminar la humedad del aire
5- Se la usa para la determinación de pesos moleculares, ya que el volumen de
elución es proporcional al logaritmo del peso molecular. De tal manera, si podemos dibujar
una curva de calibración de proteínas de peso molecular conocido, podrá conocerse el peso
molecular de proteínas de una muestra problema (esto es de gran valor en enzimología).
En cromatografía de filtración molecular, son validos los desarrollos teóricos ya vistos, desde
que se puede definir una constante de distribución Kd entre 2 fases: Disolvente interior-
Disolvente exterior de poro. Kd es función del p.M. de la sustancia y del tipo de gel que se
use. Para moléculas de gran tamaño que no pueden penetrar en los poros Kd=0 y para
moléculas e iones de pequeño tamaño con acceso totalmente libre a los mismos, Kd=1. Entre
esos limites Kd varia en proporción al peso molecular.
Molécula Diam Crit Molécula Diam. Crit.
He 2,0 Etanol 4,4
H2 2,4 Metanol 4,4
O2 2,8 Propano 4,9
CO2 2,8 1-3Butadieno 5,2
N2 3,0 Butano 5,6
H2O 3,2 ciclohexano 6,1
NH3 3,6 Benceno 6,7
CH4 4 Tolueno 6,7
C2H6 4,4 CCl4 6,9

15. El volumen de elución Ve de una sustancia depende del volumen exterior Vo y del producto
Kd. Vi, donde Vi es el volumen de disolvente en el interior de los gránulos del gel:
Ve=Vo+Vi.Kd
Si dos sustancias poseen coeficiente de distribución Kd´y Kd´´ en un determinado tipo de gel,
su volumen de elución difieren en el llamado volumen de separación Vs que viene dado por la
ecuación
Vs= (Kd´-Kd´´).Vi
Para conseguir la separación completa de dichas dos sustancias, el volumen de la muestra
debe ser inferior al Vs.
La concentración de la solución problema no desempeña ningún papel de importancia en la
filtración por geles, excepto en el caso que haga aumentar la viscosidad de la solución. A
viscosidades elevadas, la
difusión se reduce de tal modo que queda impedido el intercambio entre las fases móvil y
estacionaria. Dado que el proceso de distribución se realiza con una velocidad finita, los picos
de elución resultan más agudos y definidos si se trabaja con geles de partículas pequeñas y a
velocidades de flujo también pequeñas.

16. CROMATOGRAFIA EN UNA Y DOS DIMENSIONES
Originalmente usada por los antiguos romanos para probar colorantes y pigmentos. Cuando
se coloca una solución con varios pigmentos sobre un trozo de papel o tela, se pueden
producir anillos concéntricos con los distintos colorantes. Sin embargo esta técnica no fue
desarrollada mas allá de una simple prueba.
En 1944, Martin desarrollo la técnica de la cromatografía en papel de filtro, en donde la
humedad en el papel hace de fase estacionaria.
Esta técnica en pocos años se difundió extraordinariamente debido a todas las ventajas que
ella presenta. Llegando a un punto donde se ha logrado separar una parte de la componente
de una célula sobre una sola fibra. Posteriormente, Stahl introdujo mejoras a esta técnica con
la cromatografía de capa delgada (TLC). Esta última es mas versátil ya que permite utilizar
literalmente cualquier sustrato fijado sobre una placa de vidrio en una película o capa delgada.
La colocación de muestras, desarrollo y revelación, es prácticamente el mismo tipo de
operación que el de cromatografía en papel. Ambas técnicas, además de su simplicidad,
presentan dos ventajas sobresalientes sobre las técnicas de columna:
1º_ Se pueden analizar muestras de una gama (ug) o aun menos, según las
posibilidades practicas de la detección.
2º_ Es más fácil y en muchos casos ventajoso utilizar las propiedades eluctivas de
dos o mas solventes para separar los componentes de una muestra y además se pueden
procesar en forma simultánea varias muestras.
Fundamentos de la Cromatografía Plana .
Las bases teóricas de la cromatografía a columna
son validas para la cromatografía plana. La diferencia es principalmente geométrica y no
funcional en el sentido de la separación.
Los mecanismos de partición y de plato teórico son mas fáciles de visualizar en una columna
que en una hoja de papel.
Lo esencial es que tanto en cromatografía plana como en la de columna, el proceso es
debido a equilibrios continuos y sucesivos a medida que pasa la muestra con el eluctante
sobre el sustrato.
En cromatografía de columna, vimos que la nitidez de la separación es función del volumen o
tiempo de retención de las distintas fracciones separadas.

17. En cromatografía plana el grado de separación se
expresa en función del movimiento de cada
componente desde el lugar de siembra, relativo al
movimiento del frente del solvente a partir del mismo
punto de siembra.
Surge así el concepto de Rf (relate to front)
Rfa=a/ r ; rfb =b/ r ; etc.
La medida de los Rf representa dificultades ya que a
causa de la difusión, los componentes se
manifiestan como muchas no puntuales.
Es así que cuando se informan lo distintos Rf, se debe
aclarar la forma de mediad. Si la mancha es
simétrica; se considera el centro de la misma.
Otra forma es, considerar el punto de la marcha de más
concentración (mas intensa coloración). Si los
problemas difusionales son notables, se desdobla el Rf
en un Rf de cabeza que considera el borde superior (si es
cromatografía ascendente)
Y un Rf de cola que considera el borde inferior de la
mancha (si es ascendente).
Al igual que en cromatografía de la columna, en donde los volúmenes o tiempo de retención si
bien pueden orientar a los fines de identificación dependen de las características de las fases
en contacto y otras condiciones que resultan difíciles de reproducir, por lo que se introducen
los volúmenes o tiempos de retención relativos a una referencia, que si se mantienen
constantes a una temperatura y en una fase estacionaria dad, cuales quiera que sean las
demás condiciones operatorias; en cromatografía plana los Rf no dan seguridad a los fines de
la determinación cualitativa, por lo que se introduce el Rx, que es la relación entre los Rf de la
sustancia a determinar y de una referencia: Rx= RFa/RFx= a/ x (lo que avanza “a” con respecto
a lo que avanza la referencia “x”).
Cromatografía de papel:
Se usa un papel de celulosa purificado y de características
uniformes, de calidad semejante a la del papel de filtro.
La celulosa es un polímetro con varios miles de glucosas unidos a través de puentes
de oxigeno. Teóricamente deberían existir tres grupos OH por glucosa, pero una buena parte
de estos han sido oxidados durante la elaboración del producto a grupos aldehído, cetona o
COOH. Además el papel contiene trazas de impurezas incluyendo cationes inorgánicos que
funcionan como cationes intercambiables, sales absorbibles o materia mineral que queda en
el papel durante el proceso de fabricación.
La celulosa tiene gran afinidad por el agua y otros solventes polares y los retiene con
gran tenacidad. Estos solventes penetran en las fibras y producen hinchamiento en el papel
cambiando sus dimensiones. El papel puede adsorber mas del 20 % de su peso en agua, sin
parecer húmedo. De la cantidad de agua adsorbida sobre las fibras dependen los distintos Rf
y otros efectos diversos sobre la misma partida de papel.
Así el papel con poco o nada de agua separa cromatograficamente por adsorción
diferencial los distintos componentes, pero con un máximo de agua adsorbida, la separación
es por partición.
Se puede mejorar la selectividad y calidad de la separación cromatografía e en el
papel, impregnando las fibras del mismo con diversas sustancias como azúcar impalpable,
alúmina, MgO, silica gel, etc.

18. Procedimientos experimentales:
La diferencia mas grande entre la cromatografía en columna
y la plana que esta ultima debe transcurrir en un recipiente cerrado casi herméticamente, con
una atmosfera saturada con los vapores en equilibrio con el solvente usado con eluctante.
Esta consideración es necesaria para que el eluctante no se seque sobre el papel o placa
durante el desarrollo de cromatogramas.
Las dimensiones del recipiente pueden variar desde las de un tubo de ensayo hasta
una vitrina. La temperatura no es un factor muy crítico dentro de los valores normales. En
algunos casos es conveniente trabajar a bajas temperaturas, en otras, a temperatura
relativamente alta para favorecer la separación o prevenir la descomposición de algún
componente de la muestra.
Los pasos a seguir son los siguientes:
Se coloca una gotita carca del borde del papel que se sumerge en el solvente eluctante (0,5
cm por arriba del nivel del solvente eluctante). El volumen del liquido con la muestra debe ser
mínimo para que sea mas nítida la separación y neutralizar la tendencia de difusión de la
muestra durante el desarrollo, la que tiende a aumentar la superficie de las manchas que se
forman durante la separación.
Los elementos que se requieren son: un soporte para papel
Un recipiente para solvente
Una cámara cerrada.
Con respecto al sentido de la circulación podemos distinguir una cromatografía ascendente y
con una descendente.
En la primera la siembra de la muestra es en
la parte inferior. En la segunda en la parte superior.
El eluctante sube o baja por capilaridad y lleva los
distintos componentes con velocidades variables
que dependen de la naturaleza de componente
especifico y del eluctante. Si es necesario
determinar los Rf de las distintas fracciones aisladas
en el cromatogramas, se coloca una marca con un
lápiz en la orilla del papel a la altura de la mancha
muestra antes de empezar el desarrollo del
cartograma. Cuando el frente llega casi hasta el
borde superior del papel, se saca del recipiente o
cámara y se seca rápidamente con calor suave a la
estufa, indicando antes con lápiz la altura alcanzada
por el liquido. Al secar el papel se ubican las
manchas formadas y se coloca una marca con lápiz
en el mismo borde del papel a la altura de las distintas manchas.
Es conveniente colocar junto a la mancha de muestra, otra mancha patrón que
contenga los componentes que podrían estar presentes en la muestra.
De esta manera la identificación se puede realizar independiente de posibles variaciones de
Rf porque se trabaja en idénticas condiciones.
Para realizar un cromatogramas en dos dimensiones, se coloca la muestra cerca de una
esquina de un papel cuadrado y se desarrolla con el primer solvente, se seca y se realiza el
segundo cromatogramas dando vuelta el papel 90º y usando otro solvente.

19. Cromatografía radial:
Puede ser circular o elíptica. En el primer caso, se siembra en el centro
de un pepe circular apropiado (Wathman Nº1). Se agrega el eluctante con una mecha
alimentada por capilaridad. Los distintos componentes de la muestra se desarrollan en
círculos concéntricos.
La cámara hermética es eliminada, colocando el papel entre dos hojas de vidrio. El
vidrio superior debe tener un agujero en el centro para proveer el eluctante con una mecha.
Para los mejores resultados con esta técnica es necesario tener en cuenta la afinidad entre el
eluctante y el vidrio. Si hay mucha atracción entre el vidrio y un liquido, este escurre sobre la
superficie del vidrio y arrastra la muestra no cromatografía. Este efecto se acentúa con los
solventes polares y se puede eliminar cubriendo con una película de “agua repelente” como
ser la parafina.
Las ventajas de la cromatografía circular son:
1º) Rapidez (no mas de 2 horas)
2º)Separaciones nítidas. Esta técnica tiene mayor resolutivo porque al distribuirse en anillos
hay una disminución del ancho del anillo a medida que aumenta el radio.
3º) Revelador simultáneos. El papel puede cortarse en sectores y revelar cada uno de ellos
con un revelado diferente.
4ª) Por esta técnica se pueden procesar distintas muestras, sembrando en un circulo
concéntrico próximo al centro. O sembrar la muestra y una serie de sustancias de rederencia.
Cromatografía elíptica:

20. Caso particular de la cromatografía circular. El solvente asciende hacia
el disco de papel por un trozo del mismo papel que ha sido
cortado ex profeso en forma radial.
El frente del solvente avanza en forma elíptica.
Desventaja los radios varia en las distintas direcciones.
Cromatografía acelerada:
Consiste en aumentar la velocidad de recorrida del solvente sobre el
papel por efectos de aplicación de una fuerza centrifuga.
Se cortan tiras de papel y se colocan en forma
radial en un plato de centrifuga con los puntos de
siembra hacia el centro. Estas tiras son prensadas
débilmente con un disco de vidrio que se fija al plato de la
centrifuga.
Por desbordamiento:
Caso particular de la cromatografía descendente. Se la aplica para el
caso en que los componentes a separar tengan Rf muy próximos. La diferencia es que el
solvente cuando llega al extremo de la tira de papel se lo deja fluir libremente.
Es por ello que es imposible el calculo de Rf y entonces de define el Rx
Deteccion de las manchas desarrolladas en el cromatogramas:
Si las manchas separadas no tienen un calor inherente, se pueden tratar con reactivos
que producen un contraste entre la mancha y el resto del papel (coloreando selectivamente el
papel) o que producen visibilidad de la mancha por calor del producto de la reacción.
Técnicas mas comunes para la detección:
1º) – exposición de las manchas a los vapores de iodo elemental. Revelado poco selectivo,
visto que casi todos los componentes orgánicos reaccionan con iodo para formar un
compuesto con un color que puede variar desde amarillo claro hasta un color violeta o azul.
2º) – colores producidos por la oxidación o reducción de la mancha por los correspondientes
reactivos: HNO3,K2MnO4, AgNO3, quinhidrona, hidracina, amoniaco, glucosa, agua oxigenada,
bromo, etc. En distintas condiciones de temperatura, pH, solventes, etc.
4º) –absorción de la luz ultravioleta o infrarroja

21. 5º) –Reacción del componente aislado con reactivos específicos que producen una sustancia
coloreada. Por ejemplo la ninhidrina reacciona con los aminoácidos produciendo varios tonos
e intensidades de azul y violeta:
6º) –acompañar la muestra con algunos de sus componentes sintetizados con átomos
radioactivos en la molécula en lugar de los correspondientes átomos normales.
7º) –autobiografía: colocar al cromatogramas en medio solido sembrado con microorganismos
cuyo aumento o descenso en la velocidad de crecimiento indique la identidad y concentración
de sustancias tales como antibióticos, vitaminas, hormonas, etc.
En cromatografía de capa fina, un reactivo de aplicación general (incluido en el caso
3º) es el permanganato potásico acido sulfúrico que oxida hasta la vaselina y la reacción
puede servir para la comprobación de toda clase de hidrocarburo.
Valoración cualitativa:
Anteriormente dijimos que una forma de identificación es mediante la
medida de los Rf o mejor aun de los Rx
El hecho de que dos manchas den iguales valores de Rf, no da seguridad sobre si
ambas corresponden al mismo soluto. Por ello se recurre a la “espectogramatografía” que
consiste en la media de los Rf de un soluto dado unos distintos solventes (por lo general 10 o
15 solventes). Posteriormente se grafica Rf vs Nº de solvente.
Esta grafia si es característica del soluto incógnita.
Cuando se trabaja en técnica bidimensional,
no es posible determinar un valor de Rf. En este caso
se hace un uso de plantillas de referencia, es decir
una mezcla de los solutos que presumiblemente
están presentes en la muestra. Se efectúa una
cromatografía bidimensional, se revelan las manchas
y se coloca el cromatogramas sobre un papel
transparente y luego la solución problema se corre
sobre un papel del mismo tipo y en iguales
condiciones de trabajo, se revela y se coloca la
plantilla sobre el cromatogramas. La coincidencia de manchas corresponderá a un soluto
dado.
Cuando se sospecha cuales son los componentes de la muestra problema, se pueden
sembrar junto a la mancha correspondiente, los posibles componentes. Al final del desarrollo y
revelado, igual coloración y posición implica la existencia de ese soluto en la muestra
problema.
Valoracion cuantitativa:

22. Un método consiste en hacer correr en forma simultanea con el soluto
a valorar una serie de soluciones que contengan cantidades crecientes y conocidas del mismo
soluto, seleccionada de tal forma que la concentración incógnita se encuentra comprendida
dentro de los valores extremos de la escala. Una semejanza en el tamaño de la mancha
corresponderá a cantidades equivalentes del soluto.
La apreciación puede ser visual, como un alto grado de erros (15%) o bien
apoyándose en la relación que existe entre la
superficie de la mancha y el logaritmo de la
concentración. Sedemustra que la relacios es
lineal por lo que si se grafica superficie vs log C,
se obtiene unas series de rectas tal que para
las mismas operativas cada una de ellas
corresponde a un soluto distinto, o bien para un
mismo soluto, cada recta representa una
condición operativa diferente.
Otra técnica cuantitativa es la elución de la
sustancia. Se corta la zona del papel donde
esta retirada la sustancia y mediante el uso de un reactivo apropiado (disolvente) o calcinando
el papel, se extrae el componente, llevándolo a solución y haciendo uso de un reactivo se
provoca una reacción de calor y así se puede averiguar la cantidad de soluto original midiendo
la absorbencia de la solución.
Densitometria:
Para ello se hace uso de un densitómetro que es un equipo que tiene una
fuente de radiación, un sistema de filtros coloreados (para aislar una banda del espectro). Una
ranura generalmente fija, un sistema fotosensible que se usa como un detector y un sistema
de engranajes que permite el arrastre de la tira de papel haciéndola pasar a una velocidad
constante sobre la ranura, la tira es transparentada y las manchas son reveladoras. El
densitómetro esta acoplado a un sistema de registro automático que grafica distancia
recorrida por la tira de papel vs una cierta señal de desbalance del detector. La curva es
aproximadamente a una gausiana y el área esta relacionada con la cantidad de soluto en la
marcha.
Cromatografía en capa delgada (T.L.C)
Los fundamentos teóricos de la TLC son los vistos para papel y columna.
La diferencia son operativas. La TLC presenta ventajas frente a la cromatografía de papel
como se mencionan el la tabla adjunta. Consiste en impregnar una placa de vidrio, plástico o
aluminio con un con un adsorbente apropiado espesor adecuado (250 micrones por lo
general). Luego de un tratamiento a la capa así formada, de secado y activación, se siembra
la muestra con una micro pipeta, micro capilar o jeringa a 1,5 cm del borde inferior de la placa.
Se evapora el disolvente portador de los solutos a separar y se ubica la placa en una cámara
cerrada la cual se llevara a cabo la cromatografía correspondiente gracias a un solvente
(eluyente) presente en el fondo de la cámara, hasta una altura de 0,5 cm aproximadamente, y
que satura la atmosfera de la misma. El eluyente asciende por la capa superando la mancha
de origen.asi los diversos solutos se desplazas a velocidades características. Gracias a
mecanismos de adsorción, partición, filtración molecular e intercambio iónico. Una vez que el
frente del solvente alcanza un nivel apropiado, se saca la placa de la cámara, se seca, se

23. revelan los componentes de la/s muestras por procedimientos ya descriptos en cromatografía
de papel. Determinados sus RFy/o Rx, luego se evalúa cuantitativamente por procedimientos
ya vistos en cromatografía de papel u otros que luego se indicaran. Si es necesario se
“documenta” el cromatogramas.
Sustratos usados:
Se usan los correspondientes al tema a tratar de acuerdo al diagrama
“circulo-triangulo”. Los mas apropiados figuran el la tabla adjunta (“adsorbentes para TLC”):
silicagel, alúmina, poliamida, celulosa microcristalina, florisil, cleulosa nativa. Se observa que
junto al adsorbente figura la letra G, o bien H, F y en algunos casos el numero 254 (esta
codificación corresponde a los productos Merck). G indica la presencia de yeso en
aproximadamente un 10% que tiene como misión la de aglutinar. H indica la no existencia de
yeso ni aglutinantes orgánicos. De esta manera, al exponer la placa a la acción de la luz UV
aparecen como manchas opacas en un fondo fluorescentes el aquellos solutos que adsorben
la luz U.V. por supuesto habrá que especificar la longitud de onda: 254 y/o 366. En caso de
usar luz U.V se aconseja proteger la vista de tales radiaciones nocivas. De tal manera que si
el adsorbente aconsejado es sílicagel GF 254 + 366 significa que se usa sílicagel con yeso y
reactivo de fluorescencia en las longitudes de onda 254 y 366 nm.
El aglutinante también funciona como sustrato cromatográficos y es importante esto cuando
se lo usa con sustancias de poica polaridad como celulosa en polvo o tierras diatomeas. Si o
efecto del aglutinante resultare nocivo se puede recurrir a uno menos polar o bien reducir la
concentración del mismo.
Preparación de las placas:
Existen diversos caminos que se clasifican en: Inmersión,
asperjado, extensión y vertido.
Inmersión: se agita enérgicamente durante 3 minutos una mezcla de 35 g de silicagel G y 100
ml de cloroformo en un matraz de erlenmeyer cerrado. Se sumergen dos placas
desengrasadas y superpuestas en la suspensión, luego se sacan lentamente. Después de
escurrir, se separan y se evapora el disolvente.
Luego se pasa vapor por agua sobre las capas para que fragüe el yeso.
Asperjado: se puede llevar a cabo recubrimiento con el uso de spray comerciales pero la
uniformidas de la placa depende de la habilidad del operador
Vertido: requiere más tiempo, trabajo y es menos económico que el procedimiento por
extensión. Se vierte rápidamente la suspensión en su totalidad y se reparte lo mas uniforme
posible, inclinando ligueramente la mono. Luego se seca en posición horizontal.
Extensión: es el medio más conveniente y en
consecuencia más explotado. El equipo básico
diseñado por Stahl es el más usado. Mediante el
mismo se pueden lograr películas de 0,25 mm de
espesor. Las placas miden aproximadamente 5 x
20 cm, 10 x 20 cm, 20 x 20 cm; en algunos casos
es importante controlar perfectamente el espesor
de la placa de vidrio.

26. El equipo posee tres partes.
Un cilindro metálico rotable, un bloque metálico dentro del cual se coloca el cilindro una tapa
que abre o cierra el cilindro. El aplicador vacio se mueve a lo ancho de la placa de izquierda a
derecha para asegurar que esta bien alineada la placa. El cilindro presenta una abertura
longitudinal que inicialmente esta la parte superior y a través de la cual se lo llena con el
sustrato en suspensión. Mediante un brazo, se rota un cilindro 180º de tal forma que la
abertura quede hacia abajo. El bloque metálico previamente ha sido regulado para fijar el
espesor de la copa, mediante una perilla y una escala. Se mueve lentamente el aplicador y a
velocidad constante. También existen aplicaciones que varían constantemente el espesor.
(Dando un gradiente de espesor).
El equipo Shandon, es semejante al ya descripto. Posee una plataforma que permite lograr
una superficie totalmente plana de las placas de vidrio, aun cuando estas no posean el mismo
espesor. Esta plataforma en la parte superior tiene una chapa metálica que es presionada por
una bolsa de goma mediante cilindros indispensables. El implicador es simplemente una
“caja” metálica abierta en las caras superior e inferior. Una de las caras laterales mayores es
móvil y regulable mediante tornillos, de tal manera que insertando una planchuela de espesor
conocido en la parte inferior de la caja la cara lateral móvil apoye sobre la misma.