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1. Síntesis y Separación por HPLC de tetrahidropirazolo[1,5-a]
quinazolinas y tetrahidropirazolo[5,1-b]quinazolinas
Renesteban Forero Franco
Trabajo de grado presentado como requisito
parcial para optar al título de químico
Asesor: Dr. Jaime Antonio Portilla Salinas
Palabras Clave:
5-aminopirazoles, Quinazolinas, ciclocondensación bicomponente, Cromatografía
de Placa Delgada, HPLC analítico, HPLC semipreparativo.
Universidad de los Andes
Facultad de Ciencias
Departamento de Química
Bogotá – Colombia, Junio de 2012

2. TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN 1
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo General 1
2.2. Objetivos Específicos 1
3. ANTECEDENTES
3.1. Pirazoles y sus derivados 2
3.2. Aminopirazoles 2
3.3. Pirazoloquinazolinas 3
3.4. Síntesis Inducida por microondas 3
3.5. Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) 3
4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 5
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1. Síntesis de las Pirazoloquinazolinas 6
5.2. Separación de la mezcla regioisomérica 11(a-f)/12(a-f) 7
5.2.1. Separación fase Analítica 7
5.2.2. Separación fase Semipreparativa 9
5.2.2.1. Optimización de las condiciones de separación 11
5.2.2.2. Caracterización de los regioisómeros 11
6. CONCLUSIONES 14
7. SECCION EXPERIMENTAL 14
7.1. Instrumentos y Condiciones 14
7.2. Disolventes 15
7.3. Reactivos y Precursores
7.3.1. Reactivos y Precursores Comerciales 15

3. 7.3.2. Precursores Sintetizados 15
7.3.2.1. Síntesis de los Acrilonitrilos (Procedimiento General) 15
7.3.2.2. Síntesis de los 5-aminopirazoles (Procedimiento General) 15
7.4. Síntesis de tetrahidropirazolo[1,5-a]quinazolinas y
tetrahidropirazolo[5,1-b]quinazolinas 15
8. BIBLIOGRAFÍA 16

4. LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Radicales empleados en los 5-aminopirazoles 5
Tabla 2. Resultados de puntos de fusión y rendimiento para la mezcla 11(a-f)/12(a-f). 6
Tabla 3. Resultados de Rf’s para la mezcla 11(a-f)/12(a-f). 7
Tabla 4. Relaciones de área de separación respecto de la total. 11
Tablas 5 y 6. Determinación del volumen y concentración de inyectado óptimos. 12

5. LISTA DE ESQUEMAS
Esquema 1. Síntesis general de pirazoles 2
Esquema 2. Síntesis de 5-aminopirazoles 2
Esquema 3. Síntesis general de pirazoloquinazolinas 3
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Tautomería de NH-aminopirazol 3
Figura 2. Polaridades de la fase móvil y estacionaria 4
Figura 3. Triángulo de velocidad, carga y eficiencia para la escogencia de un método en HPLC 5
Figura 4. Región de importancia del espectro RMN 1H para la mezcla 11f/12f 6
Figura 5. Cromatogramas de la mezcla 11c/12c. 8
Figura 6. Comportamiento del separado respecto al flujo de disolvente de la mezcla 11c/12c 9
Figura 7. Resultados de la mezcla THF/ACN/H2O 1:2:3 con la columna semipreparativa 10
Figura 7.1. Identificación de los regioisómeros por espectroscopía UV en la fase analítica. 11
Figura 8. Espectro RMN 1H de la primera cola (regioisómero supuesto como el lineal) 12
Figura 9. Espectro RMN 1H de la segunda cola (regioisómero supuesto como el angular). 12
Figura 10. Diagrama de cruce entre cromatogramas de los dos. 13

6. LISTA DE ABREVIATURAS
HPLC (High performance liquid Chromatography) Cromatografía liquida de alta eficacia.
CCD Cromatografía de capa delgada.
CC Cromatografía de columna.
MW Microondas.
EtOH Etanol.
AcONa Acetato de Sodio.
ACN Acetonitrilo
THF Tetrahidrofurano
MetOH Metanol
DCM Diclorometano
H2O Agua
RMN Resonancia Magnética Nuclear (Espectroscopía).
RMN 1H Resonancia Magnética Nuclear Protónica (Espectroscopía).

7. AGRADECIMIENTOS
A Dios primeramente quien me dotó de inteligencia y sabiduría, no
solo en la realización de este proyecto sino de toda mi carrera. A mi
papá quien me apoyó de una forma incondicional en todos los
aspectos. A mis hermanos y a mis amigos…

8. RESUMEN
En los últimos años, la síntesis de pirazoloquinazolinas ha venido tomando un papel importante en
diversas áreas del conocimiento. Sus aplicaciones más importantes se encuentran en el campo de
la química medicinal como inhibidores de enzimas vitales en el proceso de multiplicación celular.
En este trabajo se pretende realizar la síntesis y separación de una serie química de la mezcla
regioisomérica de tetrahidropirazolo[1,5-a]quinazolinas y tetrahidropirazolo[5,1-b]quinazolinas. El
proceso de síntesis se llevó a cabo por inducción con microondas y el estudio de la separación, de
los regioisómeros formados, por HPLC analítico y semipreparativo. Los productos de la
cromatografía semipreparativa fueron analizados por RMN 1H y determinado el grado de
separación obtenido sobre la mezcla regioisomérica.
ABSTRACT
In the last years, the synthesis of pyrazolequinazolynes has being taking an important role in many
areas of knowledge. Their most important applications are in the field of medicinal chemistry
acting like inhibitors of vital enzymes in the cellular multiplication process. The primary objective
of this work is to performance the synthesis and separation of a regioisomeric mixture of
tetrahydropyrazole[1,5-a]quinazolynes y tetrahydropyrazole[5,1-b]quinazolynes. The synthesis
step was carry out by microwave induction using 5-aminopyrazoles and β-cyclic diketones, and the
study of separation of the mixture formed, by analytical and semipreparative HPLC. The products
of the semipreparative chromatography were analyzed by 1H RMN and determined the separation
grade obtained of the regioisomeric mixture.

9. 1. INTRODUCCION
En años recientes, el interés por el estudio de compuestos heteronucleares nitrogenados ha
crecido enormemente. Las aplicaciones que presentan este tipo de moléculas trascienden la
mayoría de las líneas de investigación en química orgánica e inorgánica. Dentro de las más
comunes se encuentran el de servir como pesticidas, agentes antibacteriales, antimicrobiales,
antipiréticos, anticancerígenos, etc. Dado el amplio espectro de posibilidades que ofrecen este
tipo de compuestos, cada vez son más los grupos de investigación que dedican sus esfuerzos en
encontrar nuevas formas de síntesis y aplicaciones.
Dentro de esta generalidad de compuestos se destacan los pirazoles, que dada su capacidad
anfótera son empleados en síntesis de heterociclos fusionados de forma rápida y sencilla. Algunos
pirazoles fusionados tales como las pirazoloquinazolinas han presentado gran atención en el
campo médico y especialmente en el área del cáncer, ya que se comportan como inhibidores de
enzimas, como la aurora kinasa, responsable del correcto funcionamiento de los centrosomas en
el proceso de multiplicación celular.2
En este trabajo se presenta la síntesis y estudio de la separación del par regioisomérico
pirazoloquinazolínico (reportado en la literatura), que se obtiene a partir de 5-aminopirazoles y 2-
acetilciclohexanona. El desarrollo del proyecto se llevará acabo utilizando radiación microondas
para inducir las reacciones y técnicas cromatográficas tales como HPLC y CCD. La caracterización
de los productos purificados por HPLC se llevó a cabo por RMN 1H, gracias a una señal particular
que presenta este tipo de estructura.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo General
Sintetizar la mezcla regioisomérica tetrahidropirazolo[1,5-a]quinazolinas y tetrahidropirazolo[5,1-
b]quinazolinas. Y empleando cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) bajo condiciones
semipreparativas, intentar llevar a cabo la separación de la mezcla correspondiente.
2.2. Objetivos Específicos
• Realizar la ciclocondensación bicomponente entre 5-amino-1H-pirazoles y 2-
acetilciclohexanona, con el fin de formar la mezcla regioisomérica de pirazoloquinazolinas.
• Hacer el seguimiento de las reacciones para comprobar la obtención de las moléculas
pretendidas empleando CCD y RMN.
• Estudiar la interacción entre las pirazoloquinazolinas con los diferentes tipos de disolvente
para determinar la mezcla de separación ideal por HPLC analítico.
• Ajustar las condiciones de la separación por HPLC analítico a condiciones semipreparativas
e intentar optimizar estas condiciones para una serie completa.
1

10. 3. ANTECEDENTES
3.1. Pirazoles y Sus derivados
Los pirazoles son moléculas que pertenecen a la serie diazólica. Se caracterizan por poseer una
estructura anular de 5 miembros compuesta por 3 átomos de carbono y 2 átomos de nitrógeno en
posiciones adyacentes.1 Dentro de sus aplicaciones más frecuentes están el de servir como grupos
funcionales en los pesticidas.2 En la medicina, los pirazoles se han destacado por presentar
propiedades analgésicas, antinflamatorias3, antibacteriales4, y anticancerígenas5 entre otros.
Existen varios métodos de síntesis de derivados de pirazoles, pero principalmente son preparados
a partir de una reacción de cicloadición 1,3-dipolar entre diazometano con un dipolarófilo
acetilénico;6 o mediante compuestos 1,3-dicarbonílicos con derivados de hidracina (Esquema 1).7
H
N
+ -
H2C N N + H CN N
1 2
3 CN
O H
1 N 1
R O + H2N NH2 R
N
R 5
R 6
4
Esquema 1. Síntesis general de pirazoles
3.2. Aminopirazoles
Los 5-aminopirazoles representan un importante conjunto de moléculas que ha atraído un
especial interés debido a su largo historial de aplicaciones en la industria farmacéutica y
agroquímica8. Su principal método de síntesis es por la interacción de hidracina con acrilonitrilos
β-sustituidos por un grupo de fácil desplazamiento X (Esquema 2).
X
R Reflujo, EtOH R NH2
+ H2N NH2
7 CN
N N
8 H 9
X= Cl, NH 2, OH
R= CH 3, C 6H5, 4-CH 3C6H4, 4-OCH 3C6H4, 4-ClC 6H4,4-BrC6H4, 4-O 2NC6H4
Esquema 2. Síntesis de 5-aminopirazoles
Los aminopirazoles 9 se comportan como sistemas 1,3 binucleófilos de gran reactividad en
reacciones de ciclocondensación con variedad de bielectrófilos (Figura 1). Estas aminas son muy
utilizadas en la síntesis de otros heterociclos fusionados, tales como las pirazoloquinazolinas que
son pirazolopirimidinas fusionadas a un anillo bencénico.
2

11. R NH2 R NH2
N N N N
H 9
H
Figura 1. Tautomería de NH-aminopirazol
3.3. Pirazoloquinazolinas
El estudio de las pirazoloquinazolinas es bastante útil en química medicinal, ya que este tipo de
estructura tiene potencial aplicación en tratamientos contra el cáncer.2 El método predilecto de
síntesis de pirazoloquinazolinas se basa en el empleo de 5-aminopirazoles con β-dicetonas cíclicas
de 6 eslabones, como el trabajo reportado por Portilla y colaboradores (Esquema 3).10
R Hr R Hr
O O
R R N
N
CH 3
N N N
N +
10
HN N
NH2 NH2 CH3
N N MW H3C
9 H
11 12
Esquema 3. Síntesis general de pirazoloquinazolinas
Según el esquema anterior, por la propiedad tautomérica de los 5-aminopirazoles existe la
posibilidad de formar la mezcla de pirazolo[1,5-a]quinazolinas 11 y pirazolo[5,1-b]quinazolinas 12.
Según los reportes en la literatura,10 la mezcla de regioisómeros 11 y 12 fue imposible de separar
por métodos cromatográficos ordinarios, tales como CCD y CC, por lo que el uso de la técnica de
purificación por HPLC sería útil si se logra estandarizar un método adecuado para ello.
3.4. Síntesis Inducida por Microondas
La síntesis química inducida por microondas es una poderosa herramienta que, aplicada a un
amplio rango de reacciones químicas, ha permitido llevar a cabo importantes contribuciones tales
como: disminuir tiempos de reacción, obtener altos rendimientos, evitar la obtención de
productos colaterales y reducir procesos de purificación. Así mismo, la aplicación de esta forma de
energía dentro de los procesos químicos constituye una interesante oportunidad para desarrollar
transformaciones novedosas y concretar reacciones que no tienen lugar bajo condiciones
convencionales.11
3.5. Cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC)
La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes
de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil. En la cromatografía
líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase
estacionaria. La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo en una columna generalmente de
vidrio, la cual está rellena con la fase estacionaria. Luego de poner la muestra en la parte superior,
se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de gravedad. Con el objeto de
3

12. aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de la fase estacionaria se
fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo trajo la necesidad de utilizar altas presiones
para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de
alta eficacia (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas
presiones requeridas.12
La elución depende de varios aspectos como son la polaridad de la fase estacionaria, el tamaño de
exclusión, etc. Cuando existe una fase estacionaria apolar y el disolvente es polar, quedarán
retenidas las moléculas apolares que se encuentren en la muestra a separar, mientras que las
polares eluirán de la columna y viceversa. De esta forma, la separación se da dependiendo del
grado de polaridad de las moléculas de la disolución en cuestión. A continuación se presenta un
diagrama de polaridades de los disolventes y de la fase estacionaria13
Figura 2. Polaridades de la fase móvil y estacionaria
Existen dos formas generales de separación por HPLC, preparativa y analítica. La primera se basa
en emplear cantidades muy pequeñas del analito (del orden de µg) con el objetivo de realizar
análisis espectroscópicos únicamente; se logra una muy buena separación pero prácticamente no
se recupera nada del producto. Contrario a esta, la forma preparativa emplea grandes cantidades
de analito (orden 1g) con la ventaja de que se pueden recuperar los productos, aunque su
separación no sea tan buena como la analítica.
Dado que la cromatografía preparativa consume una gran cantidad tanto de muestra como de
eluente, no es muy usual seguir esta vía como primera opción en una metodología experimental.
Para realizar una optimización del método usualmente se hacía una separación analítica y luego se
escalaba a una preparativa. Para solucionar estos inconvenientes, se desarrolló la técnica de HPLC
semipreparativo que sirve de puente entre estas dos formas de separación. Esta técnica presenta
ventajas respecto de sus predecesoras en el sentido que busca tener un alto rendimiento en la
separación y al mismo tiempo un buen grado de pureza en los compuestos separados. De esta
forma, el HPLC semipreparativo emplea valores intermedios tanto de la cantidad de analito que se
usa (del orden de los mg) como del tamaño de la columna para la separación. A continuación se
expone un gráfico que muestra la relación entre las tres técnicas de HPLC.9
4

13. Figura 3. Triangulo de velocidad, carga y eficiencia para la escogencia de un método en HPLC
4. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
De acuerdo a la literatura citada, se plantea la problemática a solucionar. La primera parte
consiste en la síntesis de la mezcla regioisomérica tetrahidropirazolo[1,5-a]quinazolinas 11 y tetra-
hidropirazolo[5,1-b]quinazolinas 12 empleando 5-aminopirazoles 9 y 2-acetilciclohexanona 10 por
medio de una reacción inducida por radicación microondas (ver Esquema 3). La segunda parte
consistió en la separación de la mezcla regioisomérica por HPLC analítico y semipreparativo.
Se obtuvo por este método la mezcla regioisomérica 11 y 12 siguiendo el procedimiento descrito
en la literatura,14 y la formación de los productos corroborada por CCD y RMN 1H. La variación de
los sustituyentes R en la serie de regioisómeros formados es (ver además Esquema 3):
11 o 12(a-f) R
a CH3
b 4-BrC6H4
c 4-CH3C6H4
d 4-OCH3C6H4
e C6H5
f 4-ClC6H4
Tabla 1. Radicales empleados en los 5-aminopirazoles
Dada la inevitabilidad de la formación de la mezcla regioisomérica en el producto final, se
evaluaron diferentes métodos de cromatografía y por último se estudió la separación por HPLC
analítico y semipreparativo. Esto con el objetivo de aislar las pirazoloquinazolinas obtenidas y
realizar así un análisis espectroscópico de las moléculas separadas (con RMN 1H), y con ello
determinar si la mezcla se logró separar con los métodos estudiados.
5

14. 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1. Síntesis de las pirazoloquinazolinas
A continuación se presenta la tabla de propiedades físicas encontradas para cada una de las
pirazoloquinazolinas sintetizadas:
11 + 12(a-g) P.f. (°C) Rend.(%)
11,12 a 195-205 97
11,12 b 166-179 75
11,12 c 185-189 97
11,12 d 160-195 91
11,12 e 141-147 83
11,12 f 199-202 89
Tabla 2. Resultados de puntos de fusión y rendimiento para la mezcla 11(a-f)/12(a-f).
Todas las reacciones se llevaron acabo en cantidades equimolares de 10 y 9(a-f) e inducidas por
microondas durante 7-10 minutos y fueron seguidas por CCD (los puntos de fusión fueron
comprobados en la literatura14). La mezcla regioisomérica 11c/12c se tomó como referencia para
el desarrollo del análisis espectroscópico por RMN 1H (todos los demás compuestos dieron señales
muy similares):
7
4 7
8 8 .
. 2 0 6
7 . 6 8
72 .
. 6
4 7
9 0 2
. 7 3 2
7 . .
8
. 7 70
6 7 2
.
9
. 7
7
2.00 2.19 1.04
8.2 8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5
ppm
1
Figura 4. Región de importancia del espectro RMN H para la mezcla 11f/12f
Como es posible observar, el área de todas las señales esta duplicada debido a la presencia de la
mezcla de las dos pirazoloquinazolinas. Lo característico de este espectro de RMN 1H es el H
pirazólico (Hr ver Esquema 3), que no solo sirve para demostrar la formación de los isómeros 11 y
12, sino que por medio del valor de la intensidad de la señal en el espectro es posible tener una
cuantización a simple vista de la mezcla regioisomérica. La posición de la señal para los dos
isómeros se encuentra, para todos los productos, en aproximadamente 6-7 ppm y según los
resultados, fue imposible determinar a qué tipo de isómero (11 o 12) corresponden las señales
que se desdoblan, ya que se requiere tener mayor cantidad de muestra para llevar a cabo la
caracterización completa de los dos isómeros que en principio se lograron separar por HPLC
semipreparativo.
6

15. 5.2. Separación de la mezcla regioisomérica 11(a-f)/12(a-f)
5.2.1. Separación fase Analítica
Dada la condición de mezcla regioisomérica del producto obtenido, corroborado esto por
espectroscopía RMN, se procedió a estudiar la posibilidad de separación primeramente por
métodos convencionales. Así, se comenzó observando el comportamiento empleando la técnica
de cromatografía en placa delgada resultando la siguiente tabla de Rf’s (Tabla 3).
DCM/Ciclohexano
Producto 1:1 3:1 6:1 DCM
11,12 a 0,00 0,00 0,00 21,35
11,12 b 12,74 15,14 14,60 100,00
11,12 c 9,15 11,35 11,41 97,73
11,12 d 5,08 4,32 4,76 93,89
11,12 e 7,27 10,81 14,38 96,59
11,12 f 12,66 14,59 14,49 95,89
Tabla 3. Resultados de Rf’s para la mezcla 11(a-f)/12(a-f).
Como es posible observar, a pesar de que se emplearon varias mezclas de disolventes con
diferentes polaridades, y una placa considerablemente larga (20 cm), no se registró una
separación virtual del producto; aun así, para que los resultados fueran definitivos en cuanto a su
conclusión, se permitió que la placa corriera varias veces (para las ultimas mezclas de disolventes)
dejándola incluso 12 – 15 horas para determinar si lograba haber separación (Los disolventes en la
placa normal se demoraban de 1 – 2 horas en recorrer la longitud total). Finalmente, después de
todos los ensayos realizados, se pudo inferir que por este método es imposible la separación de
los regioisómeros en cuestión.
Dado que la técnica CCD es un indicio a pequeña escala de lo que sucede al emplear cromatografía
de columna, y a que en la bibliografía ya había un reporte de que era imposible la separación de
los regioisómeros por este método14, no se desarrolló como tal este montaje.
Una vez probadas las técnicas convencionales que se tenían a disposición en el laboratorio, se
procedió sin más dilaciones con la separación por HPLC. Para tal fin, se empleó primeramente una
columna C18, tamaño de partícula 5µ, de 150mm de largo y 4.6mm de diámetro interno, marca
Econosphere, característica para efectuar la separación analítica del compuesto que, permite en
últimas, determinar la viabilidad del procedimiento por esta técnica.
A continuación se presentan los cromatogramas para las diferentes mezclas de disolventes
realizadas en la fase analítica (todos los compuestos fueron disueltos en ACN con una
concentración de 0.33 mg/mL y el volumen de inyección fue de: 20µl) (Figura 5).
7

16. a. b. c.
d. e. f.
g.
Figura 5. Cromatogramas de la mezcla 11c/12c.
En general, los comportamientos frente a cada mezcla de disolventes fue mas o menos parecida,
sin embargo, para algunos productos, la separación era mucho mejor con determinadas
combinaciones (como la ACN/H2O 2:1, en tiempo total de retención y tiempo de separación entre
picos) aunque en otras no se registraba nada (caso de la THF/H2O 2:1 y ACN/MetOH 1:1).
Se observó también el comportamiento de la separación respecto al flujo de disolvente, dando de
forma general un ensanchamiento en las curvas y una mejor separación (cuando la hubo), para
todos los productos (figura 6).
8

17. Figura 6. Comportamiento de la cromatografía respecto al flujo de disolvente de la mezcla 11c/12c
En la fase analítica se pudo observar de forma particular que los cromatogramas de todos los
productos, en los que se apreciaba separación, presentaban una gaussiana de área mayor y una de
menor en proporción de ~1:0.83 respectivamente. Para todo tipo de fase estacionaria se deduce
que la molécula más soluble eluirá primero mientras que la otra será retenida en la superficie de la
fase estacionara. De esta forma, es posible establecer a priori la correspondencia en el
cromatograma con los regioisómeros 11/12 (Esquema 3). Uno de los regioisómeros es angular, lo
que impediría una menor solvatación respecto de la lineal por parte de las moléculas de
disolvente que es relativamente polar, en términos prácticos esto hace que el lineal sea más
soluble y eluya primero que el angular, dado que la fase estacionaria es apolar. Esta deducción fue
establecida de acuerdo a resultados de estructuras análogas ya reportadas,15 donde en las señales
de los espectros se observa algo muy similar a lo que sucede en los cromatogramas.
5.2.2. Separación fase semipreparativa
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la fase analítica, las mezclas que mejor separaron
para todos los productos fueron las binarias ACN/H2O (2:1), ACN/H2O (1:1), y la ternaria
THF/ACN/H2O (1:2:3) (ver figura 5). Para la fase semipreparativa se empleó una columna C18, de
tamaño de partícula 10µ, de 100mm de largo y 10mm de diámetro interno, marca Econosphere.
Se comenzó evaluando el comportamiento de las mezclas binarias sin observarse separación
alguna. Se procedió entonces a probar con la mezcla ternaria THF/ACN/H2O (1:2:3) resultando una
separación apenas perceptible en la mezcla regioisomérica. Las pruebas se realizaron con la
mezcla 11c/12c por presentar gran similitud en comportamiento con las demás mezclas según los
resultados de la fase analítica (Figura 7).
9

18. Figura 7. Resultados de la mezcla THF/ACN/H2O 1:2:3 con la columna semipreparativa.
Como se observa la separación no se efectúa de manera marcada como en el caso analítico. Esto
se atribuye a dos razones principales: la primera es al hecho de que la columna empleada para la
fase semipreparativa es marcadamente diferente de la analítica, tanto en dimensiones (diámetro
interno y altura) como en tamaño de partícula; lo que para efectos prácticos se traduce como una
disminución del área de contacto total entre el sustrato y la fase estacionaria. Y la segunda, radica
en el hecho de que es muy probable que, dada las características propias de la columna, una de las
moléculas (probablemente la lineal que como fue teorizado eluiría más rápido) se retenga en toda
la fase estacionaria, modifique su superficie, y haga que la segunda no se adhiera del todo a esta
fase sino que se mantenga en forma de mezcla con el primer regioisómero, hasta que la primera
eluya completamente. Esto último es muy común en columnas semipreparativas con tamaño de
partícula elevado, y una de las razones principales de que la separación se vea como un efecto de
“overwhelming” en el cromatograma (sobrecarga evidenciada por una expansión horizontal del
pico gaussiano).
La forma de determinar el grado de separación se hizo por espectroscopía UV-Vis (detector
Shimadzu SPD M20A), observando el valor de los máximos y mínimos representativos para las dos
gaussianas que fueron registrados al realizar la fase analítica (puesto que allí se obtuvo una
separación cuasi completa). Estos valores se tomaron como referencia para conocer las regiones
de las colas hasta donde se encontraba una molécula individual. (Figura 7.1 ver siguiente página)
Se evaluaron otras mezclas ternarias variando la proporción de los disolventes para determinar la
de mejor separación. Se probaron las mezclas: THF/ACN/H2O 1:2:3, 1:2:4, 1:2:5, 1:3:2 y
THF/Met/H2O 1:2:3 y 1:4:3 con resultados diversos, aunque las que mejor separaron fueron las
que contenían ACN y H2O, con una mayor proporción de esta última (probablemente porque la
muestra es mas soluble en ACN que en MetOH, y el H2O, al ser muy polar, permite una mejor
retención en la fase estacionaria que es apolar).
10

19. Figura 7.1. Identificación de los regioisómeros por espectroscopía UV en la fase analítica.
5.2.2.1. Optimización de las condiciones de separación
Con el objetivo de optimizar la separación de los regioisómeros, con las tres mezclas de
THF/ACN/H2O que presentaron mejor separación, se evaluó la mejor analizando la relación de
área separada sobre la total (la primera se refiere al área bajo la curva durante el intervalo de
tiempo en el que se encontraba una molécula individual según el UV), obteniéndose los siguientes
resultados:
THF/ACN/H2O %area
1:2;3 9,3
1:2;4 9,7
1:2:5 3,4
Tabla 4. Relaciones de área de separación respecto de la total.
De acuerdo a los resultados anteriores se escogió la mezcla THF/ACN/H 2O 1:2:4 por ser la de
mayor relación de área, y porque además, genera una comparativa disminución de disolvente
orgánico aminorando los costos de la separación. La segunda parte de la optimización tuvo que
ver con el volumen de inyección y con la concentración de inyectado. Para ello se tuvieron en
cuenta primero diferentes volúmenes de inyección, y una vez determinado el mejor (a partir de la
mayor relación de área), se compararon diferentes concentraciones para conocer la más óptima.
Los resultados obtenidos se presentan en las siguientes tablas:
11

20. [] (mg/mL) 1,43 Vinj (mL) 1
Vinj (mL) %area mg/corrida [] (mg/mL) mg/corrida
5 0,4 0,028 1,43 0,144
2 3,6 0,103 1,71 0,160
1,5 4,2 0,089 2,14 0,170
1 10,1 0,144 3,1 0,139
0,3 10,7 0,046
Tablas 5 y 6. Determinación del volumen y concentración de inyectado óptimos.
5.2.2.2. Caracterización de los regioisómeros
Una vez obtenidos el volumen y la concentración apropiada de inyección, se procedió a recolectar
las fracciones para aislar los regioisómeros que, según el espectro Uv-Vis, se encontraban en las
dos colas de la gaussiana (se tomaron 105 fracciones para recolectar aproximadamente 17 mg de
muestra que coincide con la sensibilidad del equipo RMN que se usó para la caracterización). Al
tener suficiente cantidad de muestra, se realizó un espectro de RMN 1H para caracterizar los
productos obtenidos en la separación, y se analizó el grado de separación de los mismos de la
mezcla regioisomérica (figura 8 y 9).
H-Ar
H-Ar CH-Pirazol
5
8
. 0 0
7 3
. 8
.
Chloroform-d 6
7
6
5 2
.
9
. 7
7
1
2
.
7
2.00 2.38 0.99
8.5 8.4 8.3 8.2 8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3 6.2
ppm
1
Figura 8. Espectro RMN H de la primera cola (regioisómero supuesto como el lineal)
Chloroform-d
6
2
.
7
1 0
8
. 8
.
7 8 6
1
.
0 7
9
.
7
2.00 2.74 1.11
8.2 8.1 8.0 7.9 7.8 7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 7.0 6.9 6.8 6.7 6.6 6.5 6.4 6.3
ppm
1
Figura 9. Espectro RMN H de la segunda cola (regioisómero supuesto como el angular).
12

21. Como es posible observar, existe un aumento en la relación de intensidades de señal que
corresponde al hidrógeno del pirazol del que se supone como el regioisómero lineal (figura 8), y al
supuesto como angular (figura 9) (ver último párrafo parte 5.2.1). Esto permite inferir que si hubo
separación de la mezcla aunque no fue del todo completa, o al menos para la extracción de la
primera cola, porque según lo que ilustra el espectro de la figura 9 aunque existe una señal
predominante, aún se observa una pequeña al lado de esta que corresponderá al hidrógeno
pirazólico de la otra molécula.
La razón de esto último se encuentra en el hecho de que se recogían fracciones en el límite entre
molécula individual y mezcla, según lo que el UV-Vis registraba. El problema en este punto radica
en que, a pesar que el espectrómetro no detecta la señal de la otra molécula en el límite (por ser
de absorción muy parecida y porque lo que toma es un promedio de las longitudes de onda de
absorción), ya existe una pequeña fracción del otro regioisómero, pero esta cantidad no alcanza a
ser lo suficiente para que el promedio ponderado de las absorbancias produzca un cambio en el
registro del detector (que solo mostraba el resultado en números enteros). Este principio queda
bien ejemplificado en la siguiente figura:
Figura 10. Diagrama de cruce entre cromatogramas de los dos.
Por último, se puede concluir que sí hubo separación de la mezcla regioisomérica por HPLC y
aunque los resultados fueron mejores para el caso analítico, se pudieron aislar en parte las
pirazoloquinazolinas por HPLC semipreparativo, algo que no se pudo hacer con los métodos
convencionales de separación; aunque se recomienda, para mejorar la separación, emplear una
columna con mejor resolución y con menor tamaño de partícula.
Solo queda por decir que, como una forma de continuación a este proyecto, se podría llegar a
determinar algún tipo de actividad biológica sobre las pirazoloquinazolinas separadas en un
eventual trabajo de investigación futuro, dada su amplia aplicación en el campo de los
tratamientos anticancerígenos como inhibidores de la aurora kinasa.2
13

22. 6. CONCLUSIONES
• La serie de pirazoloquinazolinas objetivo fue sintetizada y se observó la formación de la mezcla
regioisomérica (corroborada por RMN 1H). Se compararon sus puntos de fusión con los de la
literatura.
• La mezcla regioisomérica para toda la serie química sintetizada demostró ser imposible separar
por los métodos de cromatografía convencional (CCD y columna) debido a la gran similitud que
existía en las características físicas de las dos moléculas regioisoméricas.
• Al emplear la técnica de HPLC analítico se logró una cuasi separación de los regioisómeros,
evidenciado esto por la formación de dos gaussianas muy bien definidas en proporción 1:0.83,
lo que permitió que se lograran distinguir los isómeros por espectroscopía UV-VIs. No obstante,
la alta definición en la separación no sucedió al emplear el método semipreparativo, debido a
que existían diferencias significativas en cuanto a las características propias de las columnas
empleadas para cada método.
• A pesar de los resultados poco eficientes de la columna semipreparativa, se logró optimizar al
máximo la separación con la discriminación de mezcla de disolventes, volumen de inyección y
concentración del inyectado. Esto permitió que se pudieran aislar fracciones de cada molécula
identificadas por su espectro UV y que se lograran caracterizar parcialmente por RMN 1H.
• Al analizar el espectro RMN 1H de las moléculas separadas, se logró evidenciar la separación de
las moléculas por el cambio en la intensidad de las señales del espectro. Sin embargo la
separación no fue del todo completa para una de ellas, debido a la sensibilidad en el detector
de UV-Vis que no permitía distinguir con claridad la ponderación de los isómeros en el límite
entre molécula individual y mezcla.
• De acuerdo a los resultados obtenidos en general, se pudo establecer que emplear HPLC es el
método idóneo para separar estos regioisómeros, sin embargo se recomienda emplear una
columna semipreparativa con mejores especificaciones en cuanto a dimensiones (≥ 150 mm) y
tamaño de partícula (≤ 5 µm) para obtener mejores resultados.
7. SECCION EXPERIMENTAL
7.1. Instrumentos y Condiciones
Todas las reacciones inducidas por microondas se llevaron a cabo en un horno microondas para
síntesis marca: CEMDiscover Modelo 908005. Los puntos de fusión fueron tomados en un
fusiómetro Fischer Scientific. La separación cromatográfica por HPLC se realizó en un equipo
Shimadzu modelo LC-6AD con arreglo de diodos Modelo SPD-M20A. Los espectros de RMN 1H
fueron tomados en un RMN Eft spectrometer de Anasazi Instruments, Inc. de 90MHz empleando
TMS como estándar interno y DMSO-d6 o CDCl3 como disolventes.
14

23. 7.2. Disolventes
En todos los casos de síntesis los disolventes fueron utilizados grado analítico y HPLC cuando fue el
caso de los experimentos por HPLC: Etanol, Hexano, Dioxano, Acetato de Etilo, Agua, THF, Metanol
y Acetonitrilo. Los cuatro últimos disolventes se utilizaron grado HPLC
7.3. Reactivos y Precursores.
7.3.1. Reactivos y precursores comerciales.
HCl, ácido acético glaciar, Bromo, Cianuro de Potasio, acetofenona, p-bromoacetofenona, p-
metilacetofenona, p-metoxiacetofenona, p-cloroacetofenona, 2 acetilciclohexanona.
7.3.2. Precursores Sintetizados
7.3.2.1. Síntesis de los Acrilonitrilos (procedimiento general)
Para la síntesis de la serie de acrilonitrilos como precursores de los 5-aminopirazoles, es necesario
realizar una sustitución nucleofílica sobre el carbono α de la respectiva acetofenona. Para ello es
necesario que la misma tenga en esa posición un buen grupo saliente para que se realice la
sustitución, Ej. El bromo. Para generar el respectico bromuro de aroilo se realizó el siguiente
procedimiento:
En un balón de fondo plano se añadió la acetofenona con ácido acético glaciar en proporción 1:2
m/v. Luego, bajo agitación constante, se añadieron cantidades equimolares de Br2 por espacio de
30 minutos. Al terminar la adición, se enfrió la mezcla en baño de hielo manteniendo la agitación
durante 1 hora, se filtró el producto y se lavó con ETOH hasta quedar incoloro.
Para la síntesis de los acrilonitrilos 7(a-f) se tomaron cantidades equimolares del respectivo
bromuro de aroilo con KCN y se disolvieron en etanol, en un balón conectado a sistema de reflujo.
La solución se calentó a reflujo durante 2 horas y luego se colocó en un baño de hielo durante 15
minutos. El precipitado se filtró y los cristales precipitados se colectaron por filtración.
7.3.2.2. Síntesis de los 5-aminopirazoles 9(a-f) (procedimiento general)
En un balón fueron añadidos hidrato de hidracina y el respectivo acrilonitrilo 7(a-f) en proporción
molar de 3:1, con etanol en sistema de reflujo con agitación constante. La mezcla fue calentada en
reflujo con agitación constante durante 4h y luego se le adiciono agua en proporción 2.5:1 v/v
respecto del etanol añadido. El precipitado se filtró, y se recristalizó en etanol.
7.4. Síntesis de tetrahidropirazolo[1,5-a]quinazolinas y tetrahidropirazolo[5,1-b]quinazolinas
En un tubo de microondas fueron añadidas cantidades equimolares del 5-amino pirazol 9(a-f)
(1mmol) con 2 acetil ciclohexanona 10. La reacción fue llevada a cabo por inducción en MW, y el
producto fue triturado y lavado con abundante etanol, el sólido recuperado se filtró y se
recristalizó de etanol.
15

24. 8. BIBLIOGRAFÍA
1 Eicher, T.; Hauptmann, S. The Chemistry of Heterocycles: Structure, Reactions, Syntheses, and
Applications. 2nd ed. 2003, Wiley-VCH.
2 Talele, T. T.; McLaughlin, M. L. J Mol Graph Model. 2008, 26, 1213-1222.
3 Pathak, R.; Bahel, S. J. Indian Chem Soc. 1980, 57, 1108-1109.
4 Daidone, G.; Raffa, D.; Musiu, C.; Milia, C. Eur. J. Mrd. Chem. 1998, 33, 375-378.
5 a) Mortlock, A. A.; Foote, K.M.; Heron, N. M.; Jung, F. H.; Pasquet, G.; Lohmann, J. J.; Warin, N.;
Renaud, F.; De Savi, C; Roberts, N. J.; Johnson, T. J Med Chem. 2007, 50(9), 2213-24. b) Foote, K.
M.; Mortlock, A. A.; Heron, N. M.; Jung, F. H.; Hill, G. B.; Pasquet, G.; Brady, M. C.; Green, S.;
Heaton, S. P.; Kearney, S.; Keen, N. J.; Odedra, R.; Wedge, S. R.; Wilkinson, R. W. Bioorg Med
Chem Lett. 2008 18(6), 1904-9.
6 Oppolzer, W. Angew. Chem. Int. Edn. Engl. 1977, 16, 10-12.
7 Wiley, R. H.; Hexner, P.E. Org Synth. 1963, 4, 351-353.
8 a) Elguero, J. In Comprehensive Heterocyclic Chemistry; Katritzky, A. R.; Rees, C. W., Eds.;
Pergamon Press: Oxford, 1984; Vol. 5, pp 167-03. b) Elguero, J. In Comprehensive Heterocyclic
Chemistry II; Katritzky, A. R.; Rees, C. W.; Scriven, E. F. V., Eds.; Pergamon Press: Oxford, 1996;
Vol. 3, pp 1-75.
9 Marvin C. McMaster. HPLC A Practical User´s Guide Second Edition. Wiley 2007, p. 137-139
10 Portilla, J. A. Sintesis y Caracterización de Nuevos 5-Aminopirazoles y su reacción en condiciones
libre de disolvente con cicloalcanonas 1,3 bielectrofilicas y analogos. Santiago de Cali. (2007) p.
33.
11 Hayes B. L. Microwave Synthesis. Chemistry at the Speed of Light. CEM Publishing:
Matthews, NC, 2002.
12 Hung, L. B.; Parcher, J. F.; Shores, J. C.; Ward, E. H. J. Am. Chem. Soc. 1988, 110(11), 1090.
13 Tinoco, Sauer.; Wang & Puglisi. Physical Chemistry, Prentice Hall 2002 p. 134.
14 Portilla, J. A., Sintesis y Caracterización de Nuevos 5-Aminopirazoles y su reacción en
condiciones libre de disolvente con cicloalcanonas 1,3 bielectrofilicas y analogos. Santiago de
Cali. (2007) p. 107-108.
15 Portilla, J.; Quiroga, J.; Cobo, J.; Glidewell, C. Acta Cryst. 2005, C61, 398-403.
16