Lab bioquimica aminoacidos

1. ¿PODEMOS SEPARAR UNA MEZCLA DE AMINOACIDOS POR CROMATOGRAFIA DE REPARTO?
Objetivo: Se llevará a cabo la separación de mezclas de aminoácidos mediante
cromatografía en papel. Se revelará la presencia de los mismos en el papel mediante
con ninhidrina y se identificarán en la cromatografía por comparación con la posición
correspondientes patrones preparados al efecto.
La cromatografía es un método físico para separar e identificar compuestos. Se basa en que cualquier sustancia, al ser
disuelta en dos disolventes distintos no miscibles, se reparte entre ambos con arreglo a su solubilidad. La relación entre
las solubilidades de dicha sustancia en cada uno de los disolventes se denomina Coeficiente de Reparto.
Si uno de los disolventes se mantiene fijo (Fase Estacionaria) se puede hacer desplazar el otro disolvente (Fase Móvil)
sobre el primero. Las sustancias a cromatografiarse verán sometidas a una distribución entre las fases estacionaria y
móvil de modo que las más solubles en la fase móvil avanzarán más que las que sean retenidas por la fase estacionaria.
De acuerdo con el mecanismo que produce la separación, se puede hablar de distintos tipos de cromatografía:
Uno de ellos es la cromatografía en papel que se utiliza para la separación de cantidades mínimas de soluto y también
como un criterio de pureza. Se basa en la diferente velocidad con que se mueve cada uno de los solutos a través de una
fase estacionaria que es el agua retenida sobre un soporte sólido e inerte (celulosa), arrastrado por un disolvente en
movimiento. Una vez realizada la cromatografía, la posición de los componentes se determina mediante una técnica
que permita “visualizarlos”. Es común revelar la cromatografía mediante reacciones que originen productos coloreados,
como la ninhidrina.
La ninhidrina que reacciona con aminoácidos que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formación de amoníaco
y anhídrido carbónico, con reducción del reactivo (la ninhidrina) a hidrindantina. La hidrindantina reacciona a su vez con
amoníaco y otra molécula de ninhidrina para dar un compuesto de adición doble que presenta una coloración azul-púrpura,
con la excepción de la prolina que da una coloración amarillenta, debido a que su grupo amino está sustituido.
Los objetivos principales de esta práctica fueron llevar a cabo la separación de aminoácidos por medio de las
cromatoplacas utilizadas siendo así la fase móvil el eluyente que fue una mezcla de solventes y la fase móvil, el
aminoácido utilizado en cada placa. Se utilizaron para esto 11 aminoácidos y una proteína que fue la caseína para
compararlos con ella sin embargo no se observó un factor de rendimiento igual al de la caseína, no por que no tuviera
esta ninguno de los aminoácidos que se utilizaron sino que para que se pudieran comparar sus aminoácidos e hubiera
tenido que hidrolizar primero esta proteína para comparar sus residuos con los aminoácidos utilizado
Los aminoácidos suben sobre el papel cromatográfico de manera distinta, esto se debe a su composición química
estructural.
Si se emplea un solvente polar, aquellos aminoácidos polares-con o sin carga- tendrán una interacción mayor que los
otros aminoácidos, en cambio, si se usa un solvente apolar, los apolares recorrerán una distancia mayor, en ambos
casos, los neutros recorrerá una distancia intermedia, debido a su naturaleza neutra.
Después de realizar una cromatografía, en ocasiones, se necesita un revelador que nos indique la posición final a la
cual llegaron los analitos, un ejemplo de revelador para aminoácidos, es la Ninhidrina, ya que reacciona con el grupo
amino de los A.A. dando una coloración azul-púrpura, a excepción de la prolina, ya que esta tiene su radical NH3
sustituido, por lo que toma una coloración amarilla
AMINOÁCIDOS
Son compuestos orgánicos formados por Carbono, Nitrógeno, Oxígeno e Hidrógeno; (algunos poseen Azufre).
Los aminoácidos reciben este nombre porque presentan los grupos funcionales Amino (NH3+) y carboxilo
(COO-); algunos autores los definen como derivados aminados de ácidos carboxílicos.
CROMATOGRAFIA:
La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de mezclas complejas, la cual tiene
aplicación en todas las ramas de la ciencia. Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención
selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y
determinar las cantidades de dichos componentes. Diferencias sutiles en el coeficiente de partición de los
compuestos da como resultado una retención diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separación
efectiva en función de los tiempos de retención de cada componente de la mezcla.
La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen mutuamente:
•Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que puedan ser usados posteriormente
(etapa final de muchas síntesis).
•Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica). En este caso, las cantidades de
material empleadas son pequeñas.
LEUCINA
La leucina interactúa con los aminoácidos isoleucina y valina para promover la cicatrización del tejido muscular, la piel y los huesos y se
recomienda para quienes se recuperan de la cirugía. Este aminoácido reduce los niveles de azúcar en la sangre y ayuda a aumentar la
producción de la hormona del crecimiento.
LISINA
Funciones de este aminoácido son garantizar la absorción adecuada de calcio y mantiene un equilibrio adecuado de nitrógeno en los
adultos. Además, la lisina ayuda a formar colágeno que constituye el cartílago y tejido conectivo. La Lisina también ayuda a la producción
de anticuerpos que tienen la capacidad para luchar contra el herpes labial y los brotes de herpes y reduce los niveles elevados de
triglicéridos en suero.
PROLINA
Funciones de este aminoácido son mejorar la textura de la piel, ayudando a la producción de colágeno y reducir la pérdida de colágeno a
través del proceso de envejecimiento. Además, la Prolina ayuda en la cicatrización del cartílago y el fortalecimiento de las articulaciones,
los tendones y los músculos del corazón. La Prolina trabaja con la vitamina C para ayudar a mantener sanos los tejidos conectivos.
LA NINHIDRINA
La ninhidrina es un poderoso agente reactivo común para visualizar (Castro, J. 1990) las bandas
de separación de aminoácidos por cromatografía o electroforesis, también es utilizada con
fines cuantitativos para la determinación de aminoácidos Reacciona con todos los aminoácidos
alfa cuyo pH se encuentra entre 4 y 8, dando una coloración que varía de azul a violeta intenso.
Este producto colorido (llamado púrpura de Ruhemann) se estabiliza por resonancia, la
coloración producida por la ninhidrina es independiente de la coloración original del
aminoácido.
Consultando el libro “Laboratory Experiments for Introduction to
General, Organic and Biochemistry” de Frederick Bettelheim, se encontró la
siguiente tabla para los valores de Rf para cada aminoácido utilizando como
solvente una mezcla de butanol/acido acético/agua en proporción 12/3/5.
Aunque el eluyente no sea en la misma proporción que en la práctica, la fase
estacionaria y la móvil son la misma, así que se pueden esperar resultados
parecidos, al menos en cuanto al orden de menor a mayor factor de retención
Valores Rf reportados en
proporción 12/3/5
Ninhidrina
Observaciones:
Se concluye que la sustancia 2 en la mezcla corresponde a la prolina
porque ambas presentan la coloración amarilla ante el revelador de
aminoácidos. La sustancia 1 en la mezcla es más probable que se trate
de la lisina, y la sustancia 3 que se trate de la leucina, porque existe
mayor relación entre los valores.
Hubo algunos errores que provocaron la diferencia en los factores de
retención entre los primeros 3 aminoácidos y los que formaban la
mezcla, principalmente que hubo movimiento no intencional del frasco
donde se estaba llevando a cabo la separación de solutos por
cromatografía.
Promedio de los valores obtenidos de Rf por cada aminoácido
Fórmula: C9H6O4
M.=178,15
CAS [485-47-2]
Número CE (EINECS): 207-618-1
INDICACIONES DE PELIGRO: Nocivo
FRASES R: 22-36/37/38 Nocivo por ingestión. Irrita los ojos, la piel y las vías respiratorias.
ALMACENAMIENTO: Recipientes bien cerrados. Ambiente seco. Temperatura ambiente
No se descartan otras características peligrosas. Observar las precauciones habituales en el
manejo de productos químicos.
Butanol
Fórmula: CH3(CH2)3OH
M.=74,12
CAS [71-36-3]
Número CE (EINECS): 200-751-6
Número de índice CE: 603-004-00-6
INDICACIONES DE PELIGRO: Nocivo
FRASES R: 10-22-37/38-41-67 Inflamable. Nocivo por ingestión. Irrita las vías respiratorias y la
piel. Riesgo de lesiones oculares graves. La inhalación de vapores puede provocar somnolencia y
vértigo.
FRASES S: 7/9-13-26-37/39-46 Manténgase el recipiente bien cerrado y en lugar bien ventilado.
Manténgase lejos de alimentos, bebidas y piensos. En caso de contacto con los ojos, lávense
inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico. Úsense guantes adecuados y
protección para los ojos-la cara. En caso de ingestión, acuda inmediatamente al médico y
muéstrele la etiqueta o el envase.
NÚMERO DE ÍNDICE CE: 603-004-00-6
Material:
-Cámara
cromatografía
-Papel para
cromatografía (16cm
de largo X 18cm de
ancho)
-Estufa 90ºC
-Capilares
Reactivos:
-Aminoácidos en
solución 0.05 M
-Solvente: n-Butanol:
Ácido acético glacial:
Agua (4:1:5)
-Revelador: Solución
de Ninhidrina
-Hidróxido de Amonio
concentrado
Hidróxido de amonio
DISCUSIÓN:
Amino acid Rf value Amino
acid
Rf value
alanine 0.38 leucine 0.73
arginine 0.20 lysine 0.14
asparagine 0.5 methionin
e
0.55
aspartic acid 0.24 phenylala
nine
0.68
cysteine 0.4 proline
not a true
amino
acid -
shows up
as yellow
0.43
glutamine 0.13 serine 0.27
glutamic acid 0.30 threonine 0.35
glycine 0.26 tryptopha
n
0.66
histidine 0.11 tyrosine 0.45
isoleucine 0.72 valine 0.61
Aminoácido Valor promedio Rf en la
práctica
Leucina 0.589 0.738
Prolina 0.389 0.43
Lisina 0.291 0.14
Mediciones:
Aminoácido Distancia
recorrida por
el compuesto
(x)
Distancia
recorrida por
el eluyente (y)
Factor de
retención
Rf=x/y
Fórmula: NH4OH
Masa molecular: 35.1
Nº CAS 1336-21-6
Nº RTECS BQ9625000
Nº ICSC 0215
Nº NU 2672
Nº CE 007-001-01-2
ESTADO FISICO; ASPECTO: Disolución incolora, muy volátil, de olor acre.
PELIGROS QUIMICOS: Reacciona con muchos metales y sus sales dando lugar a la formación de
compuestos explosivos. Ataca a muchos metales formando gas inflamable de hidrógeno. La
disolución en agua es una base fuerte y reacciona violentamente con ácidos.
LIMITES DE EXPOSICION: TLV no establecido. MAK no establecido.
VIAS DE EXPOSICION: La sustancia se puede absorber por inhalación del vapor o aerosol y por
ingestión.
RIESGO DE INHALACION: Por evaporación de esta sustancia a 20°C se puede alcanzar muy
rápidamente una concentración nociva en el aire.
EFECTOS DE EXPOSICION DE CORTA DURACION: La sustancia es corrosiva para los ojos, la piel y
el tracto respiratorio. Corrosiva por ingestión. La inhalación de altas concentraciones del vapor
puede originar edema laringeal, inflamación del tracto respiratorio y neumonía. Los efectos
pueden aparecer de forma no inmediata.
EFECTOS DE EXPOSICION PROLONGADA O REPETIDA: Los pulmones pueden resultar afectados
por la exposición prolongada o repetida al vapor o aerosol.
Color
Leucina
3.7cm 7cm 0.529 Morado
Prolina
2cm 6cm 0.333 Amarillo
Lisina
2cm 7.4cm 0.27 Morado
Mezcla.
Sustancia 1
2.3cm 7.4cm 0.311 Morado
Mezcla.
Sustancia 2
3.3cm 7.4cm 0.446 Amarillo
Mezcla.
Sustancia 3
4.8cm 7.4cm 0.649 Morado
Rf (Leucina)= 3.7cm/7cm=0.529
Rf (Prolina) =2cm/6cm=0.333
Rf (Lisina) =2cm/7.4cm=0.27
Rf (Sustancia 1) =2.3cm/7.4cm=0.311
Rf (Sustancia 2) =3.3cm/7.4cm=0.446
Rf (Sustancia 3) =4.8cm/7.4cm=0.649
푅푓 (퐿푒푢푐푖푛푎 ) + 푅푓 (푆푢푠푡푎푛푐푖푎 3)
2
=
0.529 + 0.649
2
=0.589
푅푓 (푃푟표푙푖푛푎 ) + 푅푓 (푆푢푠푡푎푛푐푖푎 2)
2
=
0.333 + 0.446
2
=0.389
푅푓 (퐿푖푠푖푛푎 ) + 푅푓 (푆푢푠푡푎푛푐푖푎 1)
2
=
0.27 + 0.311
2
=0.291
1º Paso:
Sobre una placa de papel cromatográfico de 20 x 20 cm se trazo con un lápiz una recta paralela
a uno de los bordes y a una distancia de éste de 2 cm. Sobre esta línea se pone 4 puntos
equidistantes entre sí y sobre los bordes (3.5, 7.5, 11.5, y 15.5).
NOTA: No hay que tocar la parte del papel cromatografico de la placa con las manos, ya que la contaminaremos con
aminoácidos procedentes de nuestras manos. No utilizar nunca bolígrafo ni rotulador. No horadar la placa cuando la marqués.
2º Paso:
Agregamos aproximadamente 20ml de el solvente (n-Butanol: Acido acético glacial: Agua) en la
cámara y tapamos para saturar.
3º Paso:
En cada punto (identificamos con el nombre de cada uno de los aminoácidos) se aplicaron tres
gotas de la solución de aminoácidos y solución problema (un aminoácido en cada punto y en el
último la solución problema). Se utiliza un capilar para aplicar la muestra gota a gota (hacerlo con
mucho cuidado). Procurando secar en cada aplicación.
4º Paso:
Pasamos el papel cromatográfico sobre el bocal de la botella de hidróxido de amonio
concentrado para neutralizar (una vez secadas las muestras)
5º Paso:
Se añadió al tanque cromatográfico eluyente hasta una altura aproximada de 1 cm y sin que
éste alcance la zona de aplicación de las muestras. Se mete la placa en el tanque, se tapa y se
deja desarrollar la cromatografía hasta que el
elulyente alcance el borde superior, sin llegar a sobrepasarlo (45min aproximadamente).
NOTA: Se opera en la campana extractora de gases, ya que el eluyente es tóxico y no mover la cámara.
6º Paso:
Terminada la cromatografía se saca la placa, se marca la distancia recorrida por el eluyente, se
seca dentro de la campana de gases con la ayuda de un secador de aire y se rocía con un
pulverizador que contiene la solución reveladora (en la campana de gases). La placa se secará
haciéndole llegar aire caliente con el secador.
NOTA: Esta operación debe de hacerse en la campana extractora de gases.
7º Paso:
Se indican los valores de distancia recorrida por cada uno de los aminoácidos en una tabla y se
calculan los correspondientes valores de Rf. Se indica la composición de la solución problema,
justificando la conclusión a la que se ha llegado.
¿En qué orden migran los aminoácidos de diferentes grupos?
En una cromatografía, migran primeramente aquellos aminoácidos apolares, ya que los
solventes comúnmente usados son menos polares que el agua, lo que hace que los
aminoácidos polares (con o sin carga) sean retenidos en la fase estacionaria
¿Es a ninhidrina es un revelador selectivo, porque?
Sí, porque reacciona con el grupo amino o amoniaco de un compuesto, dando una tonalidad
entre azul y purpura, llamado purpura de Ruhemann
¿Cómo se calcula el Rf?
푅푓 =
퐷푖푠푡푎푛푐푖푎 푟푒푐표푟푟푖푑푎 푝표푟 푒푙 푒푙 푎푛푎푙푖푡표
푑푖푠푡푎푛푐푖푎 푟푒푐표푟푟푖푑푎 푝표푟 푒푙 푒푙푢푦푒푛푡푒
CUESTIONARIO:
Ácido acético
Acido etanoico
Fórmula: CH3COOH
Masa molecular: 60.1
Nº CAS 64-19-7
Nº RTECS AF1340000
Nº ICSC 0363
Nº NU 2789
Nº CE 607-002-00-6(>90%)
ESTADO FISICO; ASPECTO: Líquido incoloro, con olor acre.
PELIGROS QUIMICOS: La sustancia es moderadamente ácida. Reacciona violentamente con
oxidantes tales como trióxido de cromo y permanganato potásico. Reacciona violentamente con
bases fuertes. Ataca muchos metales formando gas combustible (Hidrógeno).
LIMITES DE EXPOSICION: TLV: 10 ppm; 25 mg/m3 (como TWA); 15 ppm; 37 mg/m3 (como STEL)
(ACGIH 1990-1991)
VIAS DE EXPOSICION: La sustancia se puede absorber por inhalación del vapor y por ingestión.
RIESGO DE INHALACION: En la evaporación de esta sustancia a 20°C se puede alcanzar bastante
rápidamente una concentración nociva en el aire.
EFECTOS DE EXPOSICION DE CORTA DURACION: Corrosivo. La sustancia es muy corrosiva para los
ojos, la piel y el tracto respiratorio. La inhalación del vapor puede originar edema pulmonar
(véanse Notas). Corrosivo por ingestión.
EFECTOS DE EXPOSICION PROLONGADA O REPETIDA: El contacto prolongado o repetido con la
piel puede producir dermatitis.
Observamos que aunque los valores no son los mismos, el orden de menor a
mayor son iguales. Hubo errores cometidos en la práctica, como el movimiento
no intencional del frasco donde se llevaba a cabo la cromatografía, por lo que los
resultados difieren de los reales.
Conclusión
Si es posible, porque gracias a los diferentes
factores de reparto que tiene cada aminoácido
ante el eluyente es que muestran diferentes
velocidades de desplazamiento ante la fase móvil.
Por estas diferentes velocidades es que el
desplazamiento final es diferente en cada caso y
entonces quedan separados cada uno de los
aminoácidos.
Esta es nuestra cromatografía de reparto
en papel