efecto antioxidante

1. DETERMINACION DEL POTENCIAL ANTIOXIDANTE DEL EXTRACTO Y
METABOLITOS SECUNDARIOS AISLADOS PERTENECIENTES AL LIQUEN
COLOMBIANO RIMELIA CETRATA
JEISSON ANDRES PABON ORTIZ
20022150056
NINA MARIA SANCHEZ RAMIREZ
20012150070
MARIA DEL PILAR SILVA MARTINEZ
20022150069
Trabajo de grado para optar al titulo de Licenciatura en Química.
Línea Evaluación Biológica y Fisicoquímica de Metabolitos Secundarios de
Líquenes Colombianos
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA EDUCACION
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
DEPARTAMENTO DE QUIMICA FARMACEUTICA
BOGOTA, D.C. 2007

2. DETERMINACION DEL POTENCIAL ANTIOXIDANTE DEL EXTRACTO Y
METABOLITOS SECUNDARIOS AISLADOS PERTENECIENTES AL LIQUEN
COLOMBIANO RIMELIA CETRATA
JEISSON ANDRES PABON ORTIZ
20022150056
NINA MARIA SANCHEZ RAMIREZ
20012150070
MARIA DEL PILAR SILVA MARTINEZ
20022150069
Trabajo de grado para optar al titulo de Licenciatura en Química.
Línea Evaluación Biológica y Fisicoquímica de Metabolitos Secundarios de
Líquenes Colombianos
DIRIGIDO POR:
DR. JOSE LEOPOLDO ROJAS ARAQUE
Investigador Principal
DRA. NORMA ANGELICA VALENCIA ISLAS
Co- Investigadora
LIC. MARISOL RAMOS
Docente Titular Universidad Distrital Francisco José de Caldas
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA EDUCACION
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
DEPARTAMENTO DE QUIMICA FARMACEUTICA
BOGOTA, D.C. 2007

3. Nota de Aceptación
________________________
________________________
________________________
__________________________
Firma del Presidente del Jurado
__________________________
Firma del Jurado
__________________________
Firma del Jurado

4. Dedicatoria

5. “Si resultara cierto que alimentar a los extraños es inherente a la naturaleza toda,
como
Algo que tiene carácter de ley general, muchos enigmas quedarían entonces
resueltos”
Goethe 1827, in Kropotkin, El apoyo mutuo: un factor de evolución.

6. AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan agradecimientos a:
Marisol Ramos, Licenciada en Química, Facultad de Ciencias de la Educación,
Universidad Distrital Francisco José de Caldas, Docente Titular, por su constante apoyo
y motivación al trabajo.
DRA. Norma Angélica Valencia Islas, Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias,
Universidad Nacional de Colombia, Co- investigadora del proyecto, por sus valiosos e
importantes aportes y orientaciones.
DR. José Leopoldo Rojas Araque, Departamento de Química, facultad de Ciencias,
Universidad Nacional de Colombia, Investigador Principal del proyecto, por sus valiosas
sugerencias.

7. CONTENIDO
Pág.
1. INDICE DE TABLAS 0
2. INDICE DE FIGURAS 0
3. INDICE DE ANEXOS 0
4. RESUMEN 0
5. CAPITULO I 0
5.1. JUSTIFICACIÓN 0
5.2. INTRODUCCION 0
5.3. ESTUDIOS PREVIOS 0
5.3.1. Del Género 0
5.3.2. Del Método 0
5.4 PROBLEMA 0
5.5. HIPOTESIS 0
5.6. OBJETIVO GENERAL 0
5.7. OBJETIVOS ESPECIFICOS 0
6. CAPITULO II 0
6.1. LIQUENES 0
6.2. CONSTITUYENTES DE LOS LIQUENES 0
6.2.1. Fotobionte o componente algal (ficobionte) 0
6.2.2. Micobionte u hongo liquenizado 0
6.2.3. Relaciones entre los simbiontes 0
6.2.3.1. Relación fisiológica 0
6.2.4. Morfología y anatomía del talo 0
6.3. ASPECTOS ECOLOGICOS 0
6.3.1. Sustratos liquénicos 0
6.3.2. Resistencia a condiciones extremas 0
6.3.3. Sustancias de los líquenes 0
6.3.4. Uso de los líquenes 0
6.3.5. Habitats de los líquenes 0
6.4. QUIMIOTAXONOMIA 0
6.4.1. Química de los líquenes 0
6.4.2. Test de coloración 0
6.4.3. Cristalización 0
6.4.4. Técnicas cromatográficas 0
6.4.4.1. Cromatografía en capa fina 0
6.4.4.2. Cromatografía en columna 0
6.4.5. Técnicas espectroscópicas 0

8. 6.4.5.1. Espectroscopía infrarrojo 0
6.4.5.2. Espectroscopía RMN 0
6.4.5.3. Espectroscopía ultravioleta 0
6.5. TECNICAS DE COLECCIÓN Y ESTUDIO 0
6.5.1. Materiales 0
6.5.2. Datos de campo 0
6.5.3. Colecta 0
6.5.4. Estudio del material en el laboratorio 0
7. CAPITULO III 0
7.1. METODOLOGIA 0
7.1.1. Colecta y Selección del Liquen 0
7.1.2. Método de Extracción 0
7.1.3. Elución del extracto primario crudo en 0
cromatografía en columna (CC)
7.1.4. Aislamiento de compuestos por polaridad 0
7.1.5. Test de coloración 0
7.1.6. Clasificación y separación de compuestos 0
en cromatografía en placa.
7.1.7. Purificación de compuestos (CC y CP) 0
7.1.8. Elucidación estructural de compuestos 0
(RMN, IR, UV, MP, EM).
7.1.9. Ensayo de actividad antioxidante (CP) 0
compuestos impuros.
7.1.10. Prueba de actividad antioxidante 0
(método DPPHo
) de extracto.
8. CAPITULO IV 0
8.1. RESULTADOS 0
8.2. ANALISIS DE RESULTADOS 0
8.3. CONCLUSIONES 0
9. CAPITULO V 0
9.1. RECURSOS 0
9.1.1. HUMANOS 0
9.1.2. FISICOS 0
9.1.2.1. Materiales 0

9. 9.1.2.2. Equipos 0
9.1.2.3. Reactivos 0
9.1.3. FINANCIEROS 0
9.2. CRONOGRAMA 0
9.3. COMPONENTE PEDAGOGICO 0
9.4. BIBLIOGRAFIA 0

10. 1. INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Algas participantes en la simbiosis primaria de líquenes.
Tabla 2. Fases de formación de un talo.
Tabla 3. Distribución de líquenes según sustrato.
Tabla 4. Test De Coloración.
Tabla. Materiales
Tabla. Equipos
Tabla. Tiempo De Los Líquenes 1y 2 En El Sistema Soxhlet
Tabla. Masa Inicial Del Liquen Rimelia Cetrata
Tabla. Ubicación De La Especie Parmotrema
Tabla. Tiempo De Los Líquenes En El Método Soxhlet
Tabla. Test De Coloración. Para El LQ Rimelia Cetrata Y LQ 2
Tabla. Test De Coloración. Para Las Fracciones Del El LQ Rimelia
Tabla. Sistemas Para El Barrido De Las Cromatografías
Tabla. Elusión Del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata
Tabla . Clave De La Elusión Del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo De La
Rimelia Cetrata
Tabla . Punto De Fusión De Algunas De Las Claves Que Se Encuentran Puras De La
Rimelia Cetrata
Tabla . Masas Del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata
Tabla . De Las Masas Del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo De La Rimelia
Cetrata

11. Tabla . Cromatografía En Columna De La Fracción D A Partir Del Extracto Crudo De La
Rimelia Cetrata
Tabla . Clave De La CC De La Fracción D A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia
Cetrata
Tabla . Masas De La Fracción D De La Rimelia Cetrata
Tabla . CC De La Fracción E A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata
Tabla . Clave De La CC De La Fracción E A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia
Cetrata
Tabla . CC De La Fracción CDd A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata
Tabla .Clave De La CC De La Fracción CDd A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia
Cetrata
Tabla . Masas De Las Fracciones A partir De CDd De La Rimelia Cetrata
Tabla . CC De La Fracción Ed A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata
Tabla . Clave De La CC De La Fracción Ed A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia
Cetrata
Tabla . Masas De Las Fracciones Ed De La Rimelia Cetrata
Preparativa De La Fracción 2cdd Y De La 3cdd
Tabla . Preparativa De La Fracción 2cdd Y De La 3cdd
Tabla . Cromatografía Flash De Mediana Presión De La Fracción E A Partir Del
Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata
Tabla .Clave De La cromatografía Flash De Mediana Presión De La Fracción E A Partir
Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata
Tabla . Masas Del Fraccionamiento Primario Del Ed De La Rimelia Cetrata
Tabla . Cromatografía Flash De Mediana Presión De La Fracción E,
Tabla . Clave De La Cromatografía Flash De Mediana Presión De La Fracción E
Tabla . Masas Del Fraccionamiento Primario Del E De La Rimelia Cetrata
Tabla . Valores Espectrofotometricos De [DPPH°] & Absorbancia
Tabla . Valores Espectrofotometricos De [AcAsc] & Absorbancia

12. 2. INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructuras de metabolitos secundarios aislados de líquenes.
Figura 2. Cromatografía en columna.
Figura 3. Cromatografía en placa bidimensional.
Figura 4. Esquema de la metodología empleada.
Figura 5. Método soxhlet.

13. 3. INDICE DE ANEXOS
Anexo . Sistema Soxlher
Anexo . Preparación De La Sílice Gel Impregnada Con Ácido Oxálico Al 1%.
Anexo . Cromatografía En Columna
Anexo . Cromatografía Preparativa
Anexo . Recristalizacion
Anexo . Preparación De La Curva De La Curva De Calibración Del Radical [DDPPH]
Diagrama . Cinética Del Ácido Ascórbico & Radical Libre (DDPPH)
Anexo . Cinética De La Muestra Biológica Del Liquen Rimelia Cetrata Con El Radical
Libre (DPPH).
Anexo . Balanza Analítica
Anexo . Balanza de tres brazos
Anexo . Cámara de UV
Anexo . Campana de Extracción
Anexo . Columna Cromatografica
Anexo . Columna Flash de mediana Presión
Anexo . Espectrofotómetro UV
Anexo . Horno de calentamiento
Anexo . Horno Secador
Anexo . Microscopio
Anexo . Punto de Fusión
Anexo . Rotavapor)
Anexo . Soxhlet
nexo . 1,2 DifenilEndiamina
Anexo . Etilo Acetato Para Cromatografía En Fase Liquida
Anexo . Acido Acético (Glacial) 100% Puro
Anexo . Acido L (+) Ascórbico
Anexo . Acido Formico
Anexo . Acido Oxálico Dihidratado
Anexo . Acido Sulfurico
Anexo . Agua Destilada
Anexo . Benceno Para Cromatografía En Fase Liquida
Anexo . Cloruro de Hierro (III)

14. Anexo . Etanol
Anexo . Éter Dietilico Puro
Anexo . Hidróxido De Potasio
Anexo . Hipoclorito De Sodio
Anexo . Metanol
Anexo . n-Hexano Para Cromatografía En Fase Liquida
Anexo . Silicagel Granulado
Anexo . Sulfato De Magnesio
Anexo . Tolueno Para Cromatografía En Fase Liquida
Anexo . Infrarrojo del Compuesto B
Anexo . Infrarrojo del Compuesto C
Anexo . Resonancia Magnética Nuclear del CompuestoB
Anexo . Resonancia Magnética Nuclear del CompuestoC
Anexo . Resonancia Magnética Nuclear del CompuestoD

15. 4. RESUMEN
El principal objetivo de esta investigación es realizar un estudio detallado de una especie
de Liquen de Género Rimelia, desde el punto de vista Fitoquímico y así posteriormente
hacer el estudio Cinético a nivel de Extracto con el Radical Libre 2,2- Difenil-1-
picrilhidracilo DPPH°.
Como consecuencia de la gran diversidad biótica que posee nuestro país y la
incalculable fuente de riquezas se puede llegar a tener aplicaciones muy útiles en la
salud, industria, agricultura, biotecnología, entre otras. Uno de estos recursos que no ha
sido muy estudiado desde la parte Química son los Líquenes pero llama bastante la
atención la capacidad que este posee para sobrevivir en condiciones extremas,
habitando en medio ambientales como en el desierto, en los polos, y mas aún en zonas
donde se presenta un clima tropical
Durante el desarrollo de este trabajo nos propusimos cumplir a cabalidad con los
objetivos planteados, relacionado casi en su totalidad con la parte Química del Liquen
perteneciente al Género Rimelia.
Así pues, en el Capitulo I se hace una descripción de los objetivos propuestos, el
problema de investigación y los estudios previos realizados por otros autores.
En el Capitulo II, se tratan todos los aspectos relacionados con la diversidad y riqueza
en las regiones Naturales de Colombia, aspectos ecológicos, y un gran énfasis con
respecto a la Quimiotaxonomia, técnicas de Colección y Estudio. En el Capitulo III se
expone la metodología utilizada durante el proceso de investigación.
En el Capitulo IV, se muestran los resultados obtenidos y se realiza el análisis en
cuanto a estos y se concluye finalmente.

16. En el Capitulo V se tiene en cuenta el enfoque Pedagógico y Medioambiental como
Futuros Licenciados En Ciencias De La Educación.
Es de gran importancia resaltar que para el estudio Fisicoquímico se hace uso de
Técnicas y Métodos de Separación (cromatografía); en un principio se realizó la
extracción del LQ haciendo uso de la Extracción Continua en Equipos Soxhlet (20°C),
pues es uno de los métodos mas utilizados para obtener constituyentes orgánicos de
tejidos vegetales secos y pulverizados, este procedimiento es ideal para el análisis a
gran escala y como disolvente se utiliza Metanol el cual nos brindará un buen
rendimiento, ya que puede llegar a penetrar rápidamente en los órganos vegetales,
además se tiene en cuenta otras características como la selectividad (poder
disolvente), temperatura de ebullición (estabilidad térmica de los constituyente), poder
de penetración de las paredes celulares, facilidad de recuperar, precio o costo,
seguridad de manipulación, baja reactividad.
Ya con el extracto en bruto se empleo una de las técnicas de separación para los
componentes de una mezcla de solutos, como son las separaciones cromatográficas, la
cual tiene en cuenta las propiedades fisicoquímicas, tales como la polaridad y la carga
iónica de los solutos, el tamaño molecular, el grado de adsorción entre los solutos y las
fases estacionarias, o el reparto entre dos solutos entre las fases líquidas inmiscibles.
En este estudio vamos a utilizar la Cromatografía en columna (CC), la cromatografía en
capa fina (CCF), cromatografía preparativa (CP).
Posteriormente se utilizo Métodos Instrumentales como Infrarrojo (IR), Ultravioleta (UV),
Masas, Resonancia Magnética Nuclear (RMN), espectrofotometría UV, de los
compuestos puros, con el fin de conocer los compuestos hallados. Finalmente se
realizo el Estudio Cinético del Extracto frente al radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidracilo
DPPH°.

17. 5. CAPITULO I
5.1. JUSTIFICACIÓN
En nuestro país existe una amplia biodiversidad de líquenes, los cuales representan un
recurso de gran importancia y atractivo para el mundo. El estudio de estos organismos
ha despertado en la actualidad un gran interés debido a varias propiedades bioactivas
que poseen los metabolitos secundarios que los conforman. Gracias a varios estudios
realizados en Colombia se conoce una amplia gama de las especies que existen de
estos organismos, donde las investigaciones realizadas se han enfocado básicamente
en la clasificación taxonómica contribuyendo en gran medida al conocimiento de la
biodiversidad de líquenes de nuestro país.
Sin embargo en el aspecto químico y biológico los estudios realizados han sido pocos,
ya que aún existe una gran cantidad de especies sin clasificar taxonómicamente dada
la carencia de estudios químicos indispensables para tal fin, la siguiente propuesta
pretende contribuir al conocimiento de la química de los líquenes Colombianos.
Por las razones expuestas y dado el gran potencial que ofrecen los Líquenes como una
fuente de nuevos principios activos y la gran diversidad de Colombia en este recurso
natural, la búsqueda de nuevos y mejores agentes antioxidantes para el tratamiento y
prevención de muchas enfermedades y para el uso en alimentos y cosméticos serán las
problemáticas guías en el proyecto de investigación.
5.2. INTRODUCCIÓN
Los líquenes son organismos simbióticos entre un alga y un hongo, dichos organismos
han sido poco estudiados en nuestro país. Gracias al grupo de investigación en
Estudios Biológicos y Fisicoquímicos de Líquenes Colombianos de la Universidad

18. Nacional de Colombia dirigido por el Dr. José Leopoldo Rojas Araque, junto con el
apoyo del Instituto de Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia se ha podido
incrementar la investigación en este campo.
El estudio de la actividad antioxidante en extractos liquénicos y compuestos aislados
de los mismos ha sido poco explorado en nuestro país, como se menciono con
anterioridad, los estudios realizados por autores como, (K. DIVAKAR, BLANCO, L.
HAWKSWORTH, CRESPO, 2005) en el género Rimelia cetrata se han encaminado al
estudio taxonómico del mismo, sin embargo no se ha realizado un estudio detallado
acerca de la bioactividad de los metabolitos secundarios que se presentan en dicha
especie.
Para ello es de gran importancia realizar inicialmente un estudio fitoquímico donde se
logre aislar e identificar aquellos metabolitos secundarios de mayor actividad que
presenta la especie y de esta manera realizar un estudio fisicoquímico para lograr
contribuir al desarrollo científico de nuestro país.
5.3. ESTUDIOS PREVIOS
5.3.1. Antecedentes del Género Rimelia
En la base de datos consultada, se encontraron tres artículos relacionados con el
género Rimelia cetrata, estos están basados básicamente en el aislamiento e
identificación de glucanos y galactoglucanos con el fin de presentar información acerca
de la taxonomía de este líquen.
En el articulo titulado “Molecular phylogenetic studies on the Parmotrema reticulatum
(syn. Rimelia reticulata) complex, including the confirmation of P. pseudoreticulatum as
a distinct species” (K. DIVAKAR, BLANCO, L. HAWKSWORTH, CRESPO, 2005).

19. Se concluye que la Parmotrema reticulatum (TAYLOR, M.CHOISY), P. clavuliferum y P.
pseudoreticulatum, son organismos simbióticos de una misma familia que provienen de
un grupo morfológicamente similar, por tal motivo es indiscutible su parecido
químicamente (todos estos géneros contienen atranorina, cloroatranorina, ácido
salazinico y consalazinico). Sin embargo algunos autores (Sano & Fletcher 1990; Sano
& DePriest 1999; Kurokawa 1991, 2003), colocan dichos géneros por separado o a
veces en el género Rimelia, en el cual se encuentra el cetrata.
En los artículos titulados “Chemotypes significance of lichenized fungi by structural
characterization of heteropolysaccharides from the genera Parmotrema and Rimelia” y “
Chemotypes significance of lichenized fungi by structural characterization of
heteropolysaccharides from the genera Parmotrema and Rimelia” (ROSECHRER,
GRASSI MELLINGER A, ELIASARO B, GORIN A, IACOMINI, 2005). Se aislaron
Galactoglucanos y glucanos de los hongos liquenizados del género Parmotrema
(austrosinense de Parmotrema, Parmotrema delicatulum, mantiqueirense de
Parmotrema, schindlerii de Parmotrema, y tinctorum de Parmotrema) y de Rimelia (el
cetrata de Rimelia y reticulata de Rimelia) en dichos estudios se concluyo la similitud
de estos dos géneros. La química y análisis de estos compuestos es posible a varios
métodos espectroscópicos y cromatográficos. Gracias a estos análisis la taxonomia de
este tipo de organismos se estructura aún más.
Los estudios mostrados con anterioridad elucidan la problemática taxonómica de estos
géneros (Parmotrema y Rimelia) en cuanto a sus propiedades químicas, por medio del
aislamiento y la aplicación de métodos espectroscópicos y cromatográficos de dichos
compuestos (glucanos y galactoglucanos) se pudo llegar a la conclusión de que estos
géneros no pueden ser separados. Sin embargo se desaprovecha el potencial del sin
número de compuestos que presentan este tipo de hongos liquenizados, por tal razón
es de suma importancia utilizar dichas propiedades con el fin de un desarrollo a futuro
en el campo de la medicina, industria, alimentos, etc.

20. 5.3.2. Antecedentes del Método
Los estudios y trabajos que se han realizado con líquenes tanto en el aislamiento de
compuestos como en lo relacionado con actividad antioxidante han marcado una pauta
en cuanto a la utilización de estos en distintas áreas tanto en la educación como a nivel
científico, de estos citaremos algunos ya que por su interés y hallazgo son relevantes,
de tal forma también se tuvo en cuenta estos para aplicar la metodología de este
estudio.
En el artículo “Use of Free Radical Method to Evaluate Antioxidant Activity” (WILLIAMS,
E. CUVELIER, C. BERSET, 1995) se utiliza el radical DPPH (2,2-Difenil-1-picrilhidracilo)
como técnica para la evaluación de actividad antioxidante, esta prueba se hace para
compuestos fenólicos, los cuales presentan mayor actividad. Se hace un análisis
detallado de los resultados y se discute de acuerdo a la química de las reacciones
establecidas. Este artículo es la base del estudio cinético para determinar actividad
antioxidante en nuestro estudio, y posee constantes establecidas para posibles
compuestos aislados.
El segundo articulo relevante y de gran ayuda en nuestro estudio se titula “Improved
Chromatographic Method for the Purification of Phenolic Constituents of the Lichen
Parmotrema Tinctorum (Nyl.) Hale” (G. K. JAYAPRAKASHA, L. JAGANMOHAN, R. P.
SINGH, K. K. SAKARIAH, 1998) en este trabajo se estandariza el método
cromatografico para el aislamiento de los compuestos liquénicos, establece criterios
comprobados en cuanto a cantidad de reactivos y características de estos y menciona
los diversos sistemas de elución para obtener determinado compuesto. Otro articulo
relacionado con estos estudios cromatográficos en líquenes se titula “A Standardized
Method for the Identification of the Lichen Products” (F. CULBERSON, H.
KRISTINSSON, 1970) Se diferencia del anterior por poseer tablas de RF y test de

21. coloración de compuestos liquénicos. Además muestra otros sistemas de Elución y la
correcta forma de tomar los rf.
En otros estudios relacionados con la actividad antioxidante de importancia han sido:
“Determination of Antioxidative Potencial of Lichen Usnea Ghattensis in Vitro” (B. C.
BEHERA, N. VERMA, A. SONONE, U. MAKHIJA, 2004), “Free Radical Scavenging
Behavior Antioxidant Compounds of Sesame (Sesamum Indicum L.) in DPPHo
System”
(K. P. SUJA, A. JAYALEKSHMY, C, ARUMUGHAN, 2004), “Comparison of Antoxidant
Activity and Phenolic Content of Three Lichens Species”(F. ODABASOGLU, A. ASLAN,
A. CAKIR, H. SULEYMAN, Y. KARAGOZ, M. HALICI, Y. BAYIR, 2004 ) “Determination
of Antioxidant Activity of Lichen Cetraria Islandica(L) Ach ” (I. GÜLÇIN, M. OKTAY, Ö.
KÜFREVIOGLU, A. ASLAN, 2001), algunos nombran el método de tiocianato con el fin
de ensayar actividad antioxidante, sin embargo realizan otros estudios, como
determinación de contenido fenólico y poder reductor.
5.4. PROBLEMA
Aislar los Metabolitos Secundarios de mayor Actividad frente al radical 2,2-Difenil-1-
picrilhidracilo DPPH●
de un LQ Colombiano del género Rimelia y así poder realizar los
ensayos del poder antioxidante a nivel de Extracto.
5.5. HIPOTESIS
• Los metabolitos aislados del líquen de la especie Rimelia presentaran una actividad
antioxidante relevante frente al radical 2,2-Difenil-1-picrilhidracilo DPPH●.

22. • El aislamiento de los metabolitos de la especie Rimelia permitirá la clasificación
taxonómica dentro de la colección de líquenes Colombianos del Instituto de Ciencias
de la Universidad Nacional de Colombia.
5.6. OBJETIVO GENERAL
• Contribuir al conocimiento de la química de los líquenes Colombianos del género
Rimelia de una especie no analizada, con la finalidad de identificar y aislar los
metabolitos secundarios presentes en el organismo y de esta manera determinar el
potencial antioxidante a nivel de Extracto mediante el ensayo del poder antioxidante
y del poder reductor.
5.7. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Realizar un estudio Fitoquímico detallado del LQ perteneciente al Género Rimelia.
• Identificar y caracterizar los metabolitos secundarios aislados presentes en el liquen
estudiado mediante la determinación de sus constantes físicas a partir de técnicas
espectroscópicas.
• Hacer uso del estudio cinético de la reacción del compuesto con el radical libre de
DPPH°
a partir de la constante de velocidad y de los Ec50.

23. 6. CAPITULO II
6.1. LÍQUENES.
Los líquenes u hongos liquenizado son organismos complejos formados por un hongo
y un alga. A estas unidades se llega por un equilibrio dinámico entre estos dos tipos de
organismos, en ellos la parte algal actúa como organismo fotoautótrofo que aporta
hidratos de carbono, mientras que la parte fúngica actúa como heterótrofo aportando
sales y agua. Los líquenes se clasifican de acuerdo con el tipo de hongo (llamado
micobionte) que los componen. El micobionte de la mayoría de los líquenes es un
ascomicete, aunque en algunos líquenes tropicales es un basidiomicete (VALENCIA-
AGUIRRE, 2002; DE BARY, 1879; SCHWENDENER, 1868). El alga que compone un
liquen (llamada ficobionte) suele ser unicelular del tipo de las algas verdes, como
Trebouxia o Coccomyxa, o del tipo de las algas verdeazuladas, como Nostoc o
Scytonema.
6.2. CONSTITUYENTES DE LOS LIQUENES.
6.2.1. Fotobionte O Componente Algal (Ficobionte)
Las algas presentes en los talos liquénicos (aproximadamente cuarenta géneros),
clorofíceas y cianobacterias de tipo unicelular, cenóbico o filamentoso reciben
diferentes denominaciones como: algas simbióticas, algas liquenicas, componente
algal, fotobionte o ficobionte. Las algas simbiontes son de vida libre, pueden subsistir
libremente en la naturaleza en donde se reproducen sexual y asexualmente
comportándose como simbiontes facultativos en la asociación liquénica (VALENCIA-
AGUIRRE, 2002).

24. Los géneros Trebouxia, Trentepholia y Nostoc son los fotobiontes más frecuentes, y de
amplia distribución en las asociaciones liquénicas. Los géneros Trebouxia, Trentepholia
son eucarióticos y pertenecen a algas verdes; Nostoc pertenece al grupo de bacteria
oxígeno –fotosintética (cianobacteria). Cuando un alga se encuentra asociada con un
micobionte no se reproduce sexualmente, lo hace en forma asexual. Las cianobacterias
(algas verde-azules) se multiplican por fisión binaria, heterocistes o akinetos, son de
naturaleza procariota. Las clorofíceas, por su parte se multiplican por división celular
vegetativa o por formación asexual de esporas llamadas aplanoesporas.
El fotobionte en asociación liquénica puede cambiar la intensidad del color, la forma
general, el tamaño, las cubiertas de gelatina y tener cambios fisiológicos. Algas como
Trentepholia y Gloeocapsa son más pigmentadas en vida libre que el liquen. En ciertas
especies de Trebouxia y Nostoc una cubierta gelatinosa esta presente en medio de
cultivo, pero no en el talo (VALENCIA-AGUIRRE, 2002). Aproximadamente el 92% de
las especies poseen ficobiontes verdes, frente a un 8% de cianobacterias.Nostoc,
Scytonema, Stigonema, Gloeocapsa y Calothrix son los cianosimbiontes más comúnes
(BARRENO, 1997).
Los principales grupos de algas participantes en la simbiosis primaria de líquenes son:
CHLOROPHYTA: 90 A 95 % EN REGIONES TROPICALES.
Palmellaceae, Coccomyxaceae, Protococcaceae, Trentepohliaceae, Cladophoraceae, Chlorococcaceae,
Oocystaceae, Botryococcaceae.
CYANOPHYTA: 5 A 10 % EN REGIONES TROPICALES.
Chroococcaceae, Nostocaceae, Scytonemataceae, Rivulariaceae.
XANTHOPHYCEAE Heterococcus en Verrucaria sp.
PHAEOPHYCEAEPetroderma en Verrucaria sp.

25. TABLA.1 ALGAS PARTICIPANTES EN LA SIMBIOSIS PRIMARIA DE LIQUENES. (FERRARO, INSTITUTO DE CIENCIAS BOTANICAS, 2000)
6.2.2. Micobionte U Hongo Liquenizado
Los hongos que entran en la constitución de los líquenes son principalmente
Ascomycotina y sólo unos pocos pertenecen a los Basidiomycotina o Deuteromycotina.
Se han observado también algunas formas más o menos inciertas de liquenización
detectadas de otros grupos fungales (VALENCIA-AGUIRRE, 2002).
La clasificación y denominación de los líquenes se refiere siempre al micobionte, según
lo establecido en el Código Internacional de la Nomenclatura Botánica (CINB). El
hongo determina la naturaleza y forma de la mayoría de los líquenes y produce las
estructuras fructificantes, comparables a las formas de vida libre (BARRENO, 1997;
VALENCIA-AGUIRRE, 2002).
Los hongos de los líquenes casi siempre son simbiontes estrictos y no son capaces de
prosperar en la naturaleza sin el ficobionte apropiado (son simbiontes obligados). La
mayoría de ellos forman colonias compactas y elevadas de diversa formas, color y
tamaño; por el contrario los hongos separados del fotobionte forman un micelo carente
de la organización y la diferenciación celular típica del talo del liquen. La pared del
hongo debe ser flexible para facilitar los contactos con el ficobionte; también participan
en la captación de agua, de nutrientes y en su transporte al citoplasma. El agua de las
células algales está controlada por el hongo a través del apoplasto fangal, por lo tanto
no tienen acceso directo a ella (RICHARDSON, 1999; HONNEGGER, 1998).
Otros grupos particulares de hongos como los Myxomycetes al unirse con algas forman
"mixolíquenes" mientras que la unión de Actinomicetes con algas constituyen
"actinolíquenes", no son muy frecuentes.

26. 6.2.3. RELACIONES ENTRE LOS SIMBIONTES
6.2.3.1. Relación Fisiológica
Es el rol fisiológico que cumple cada uno de los simbiontes en beneficio del consorcio.
El hongo protege al alga contra la desecación y el calor solar produciendo pigmentos en
los tejidos; proporciona al fotobionte gas carbónico de su respiración, retiene agua y
minerales en sus tejidos, los cuales toma a través de sus paredes; extrae minerales del
sustrato, compite por espacio en el mismo; da forma al liquen (en la mayoria de los
casos). Sin embargo, la forma del talo liquénico no es la misma que la del hongo
aislado. Este hecho presupone que el alga también contribuye en alguna porción, al
establecimiento de la forma y estructura del liquen.
El hongo se reproduce sexualmente, aloja al alga de tal forma que tenga el óptimo de
intensidad lumínica y dispone sus hifas para que se pueda alojar adecuadamente. La
mayoría de los líquenes sin fotófilos, pero cuando se presenta iluminación excesiva el
talo se deseca para proteger el aparato fotosintético.
El alga, por su parte, sintetiza un exceso de compuestos orgánicos (especialmente
azúcares simples o monosacáridos), los cuales son utilizados por el micobionte para se
supervivencia, almacenándolos en forma de manitol no disponible para el fotobionte. El
transporte depende de la mediación de algunas sustancias segregadas por el hongo
que facilitan los procesos de difusión, que del contacto entre el micobionte y fotobionte
(VALENCIA-AGUIRRE, 2002).
Cuando el fotobionte es una cianobacteria, suministra sustancias nitrogenadas al
consorcio, ya que tiene la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico; sin embargo, sólo
utiliza una pequeña cantidad del nitrógeno fijado y el resto lo libera en forma de amonio,

27. para ser utilizado por el hongo para la producción de proteínas y aminoácidos. Cuando
el fotobionte es un alga verde, el suministro del nitrógeno del consorcio es de origen
exógeno y a partir de la urea, nitratos o aminoácidos. Las cianobacterias excretan
glucosa (GALUN, 1988 citado por MOORE LANDECKER, 1996; WERNER, 1992),
mientras que las algas verdes secretan poliol; igualmente proporcionan tiamina y
biotina.
Parece ser que tanto el hongo como el alga pueden obtener, en parte, sustancias
carbonatadas del sustrato, lo cual depende de la relación existente entre éste y el
liquen. Otros aportes del componente fúngico al consorcio son la regulación de las
poblaciones del fotobionte y la longevidad de las células fúngicas liquenizadas,
comparadas con la vida libre (VALENCIA-AGUIRRE, 2002; HONEGGER, 1998).
6.2.4. MORFOLOGIA Y ANATOMIA DEL TALO
Los líquenes exhiben una amplia variedad morfológica que se extiende desde los tipos
rudimentarios hasta los altamente diferenciados. Como respuesta a la unión que se
establece entre los simbiontes y el papel predominante que juega el componente
fúngico dentro de la morfogénesis (VALENCIA-AGUIRRE, 2002). La unión de los dos
simbiontes se realiza mediante un proceso complejo de liquenización, que presenta
numerosas fases, las cuales se describen a continuación en el siguiente cuadro
(MARCANO ,1994):
FASE DE PRE-CONTACTO: Estimulación por parte del alga y respuesta tigmotrófica del hongo
FASE DE CONTACTO: Reconocimiento y aglutinación.
FASE DE ENVOLTURA DEL ALGA POR EL MICOBIONTE: Desarrollo de haustorios.
FASE DE INCORPORACIÓN DE AMBOS SIMBIONTES PARA LA FORMACIÓN DE UNA MATRIZ
COMÚN: Integración. Fase soredial.

28. FASE DE FORMACIÓN Y DIFERENCIACIÓN DEL TALO.
TABLA 3. FASES DE FORMACION DE UN TALO. (FERRARO, INSTITUTO DE CIENCIAS BOTANICAS, 2000)
El talo puede presentar una estratificación con zonas bien delimitadas, con un estrato
algal superior y una médula formada por hifas del hongo, éstos son talos heterómeros.
Este es el tipo de arreglo más común en los líquenes. Si las algas se distribuyen entre
las células del hongo sin ninguna orden el talo es homómero. Los talos pueden ser:
1. CRUSTOSOS: con aspecto de costra, muy adheridos al sustrato, pueden ser
continuos o fragmentados en placas o areólas. El 65% de las 15.000 especies de
líquenes conocidos son crustosos.
2. FOLIOSOS: con aspecto de hojas, muy extendidos, son llamativos y es la forma
más común entre los macrolíquenes.
3. FRUTICULOSOS: son talos ramificados, erguidos o pendientes, como arbolitos
pequeños o barbas enmarañadas, muy largas.
4. GELATINOSOS: talos gruesos, quebradizos cuando se encuentran secos y muy
blandos e hinchados en presencia de agua.
5. TALOS COMBINADOS: crustoso (escamoso o microfilino) y fruticuloso (con
apotecios): podecios (Cladonia sp.) o pseudopodecios (Stereocaulon).
6.3. ASPECTOS ECOLOGICOS
6.3.1. Sustratos Liquénicos
Se definen como el soporte sobre el cual crecen líquenes. Los sustratos influyen sobre
su comportamiento de acuerdo con la textura física y la estabilidad, pH, el contenido

29. mineral, la composición química y la capacidad de retención de agua que ofrecen para
su establecimiento.
Dada la capacidad de colonizar una amplia variedad de sustratos, han sido ubicados en
una amplia clasificación y de uso común (VALENCIA-AGUIRRE, 2002). (ver tabla 4).
SUSTRATO TIPO
ROCAS O MINERALES SAXÍCOLAS (rupestres o rupículas)
* Epilíticos ( encima del sustrato)
*Endolíticos (dentro del sustrato)
*Calcícolas ( en rocas caliza)
*Magnícolas (en serpentina)
*Ferrugíneos ( en magnetita)
*Calcófilos (en calcopirita)
CORTEZA DE ÁRBOLES CORTÍCOLAS Ó CORTICICOLAS
*Epifleódico (encima de la corteza)
*Endofleódicos (dentro de la corteza)
SUELO TERRÍCOLAS
MADERA LIGNÍCOLAS
BRIOFITAS MUSCÍCOLAS
HOJAS EPIFILOS
*Folícolas
TABLA 4. DISTRIBUCION DE LIQUENES SEGÚN SUSTRATO. (VALENCIA, AGUIRRE, 2002)
La distribución de los líquenes en un área tiene mucho que ver con el grado de
especificidad que muestra por el sustrato. Las especies que colonizan sustratos
indiferenciados tienden a tener una amplia distribución por la mayor oferta de sustratos,
mientras que los que prefieren los específicos poseen un radio de distribución más
limitado. Por esto se observa que la distribución geográfica de un liquen esta en
relación directa con la especificidad que muestra el sustrato (BRODO, 1973).
6.3.2. Resistencia a condiciones extremas

30. La mayoría de los líquenes son tolerantes a iluminaciones extremas, períodos de frío
intenso o desecación casi completa, condiciones que son frecuentes en su medio
natural. Su capacidad adaptativa es la mayor y la más completa de todos los vegetales
en regiones inhóspitas, donde otro tipo de plantas no se desarrollan. Pueden soportar
durante el día temperaturas de 60°C y en la noche por debajo de 0°C. Estos rasgos de
tolerancia varían de acuerdo con el grado de adaptación a los diferentes hábitats
ecológicos (AHMADJIAN, 1966).
6.3.3. Sustancias de los líquenes
Los líquenes producen, por su actividad metabólica, varios tipos de compuestos
orgánicos, principalmente aromáticos. Entre ellos se incluyen ácidos alifáticos,
depsidonas, depsonas, ésteres bencílicos, dibenzofuranos, ácidos úsnicos, xantonas,
antraquinonas, terpenoides y derivados del ácido pulvínico. Estas sustancias juegan un
papel biológico, comenzando por aceptar que la simbiosis se relaciona con la
producción de todas estas sustancias (VALENCIA-AGUIRRE, 2002). De entre todas
estas sustancias, son los dépsidos (para y meta), las depsidonas y los ácidos úsnicos
hacia los que los liquenólogos han dirigido principalmente su atención, por tratarse de
compuestos que solo se han encontrado en los líquenes, con la salvedad de algunos
pocos que han sido descritos también en hongos no liquenizados, como el ácido
lecanórico (paradépsido), presente en Pyricularia. No obstante, se ha comprobado que
cuando estas sustancias se presentan en hongos no liquenizados lo hacen siempre en
muy bajas concentraciones. (MANRIQUE REOL, E. 1989.)
Las sustancias químicas presentes en los líquenes se localizan como componentes de
las membranas celulares en el contenido celular o en forma extracelular, como masas
amorfas o cristales, coloras o incoloras. Son insolubles en agua y solubles en solventes
orgánicos, la mayoría de sabor amargo. Las sustancias producidas por los líquenes

31. tienen un interés desde el punto de vista de su acción antibiótica. Estas sustancias son
activas contra una gran variedad de microorganismos, preferencialmente contra
bacterias gram-positivas y hongos.
6.3.4. Uso de los líquenes
El uso de los líquenes por parte del hombre ha sido muy variado y conocido desde
tiempos muy antiguos, con propósitos alimenticios, curativos y económicos. Las
propiedades potenciales o reales de estos organismos han permitido su utilización en
medicina en forma de extractos o cocimientos desde las antiguas cultura china y
egipcia. Existen numerosos ejemplos. Cetraria islandica, por ejemplo, es utilizada en la
medicina homeopática hoy en día para curar diferentes enfermedades, entre ellas la
tuberculosis; se sabe que su alto contenido de polisacáridos sirve para la fabricación de
harinas de fácil digestibilidad. Usnea longissima ha sido utilizada como expectorante y
para curar las úlceras al aplicarse localmente (FILHO-TOLEDO, 1976). Se sabe de la
existencia de una enorme cantidad de compuestos bioáctivos sin explorar y que pueden
estar en disposición de la industria farmacéutica para utilizar a gran escala médica y
comercial (VALENCIA-AGUIRRE, 2002).
Desde el siglo XVI los líquenes se han utilizado como materia prima en la industria de
cosméticos y perfumes. A varios ácidos liquénicos como el ácido úsnico se le ha
encontrado propiedades antibióticas, por lo que las especies Usnea se han considerado
activas en el tratamiento de enfermedades. Un buen número de líquenes son utilizados
hoy en día como base para la fabricación de cremas, shampoo, desodorantes y
pastillas. Sin embargo en vía opuesta también los productos de los líquenes son
responsables de enfermedades por contacto como dermatitis y eczemas, y otros
problemas de piel caracterizados por hinchazón y enrojecimiento. Especies del género

32. Cladonia se comercializan en grandes cantidades y además es aprovechada en gran
medida en la industria del perfume.
La amplia gama de actividades biológicas que se les ha atribuido a los líquenes ha
despertado el interés por la investigación de estos organismos, confirmando que
muchos de los metabolitos que producen son “agentes biodinámicas” con propiedades
antibiótica, antiviral, antitumoral, analgésica, antipirética, antiinflamatoria, antioxidante,
antiproliferativa, alelopática e inhibidora de enzimas.
Acorde a las recientes investigaciones de las actividades biológicas de las sustancias
de los líquenes se pueden dividir en:
• Actividad Antibiótica: Despidas (INGOLFSDOTTIR, 1985), depsidonas y acido
úsnico son activos contra microorganismos Gram-positivos, drogas
comercializadas en Europa de compuestos como el benzydimetil son distribuidas
como USNO contra ulceras, otitis y mastitis.
• Actividad Antitumoral y Antimutagénica: El ácido úsnico, (+)-
protoliquenesterinico presentan una actividad antitumoral y antimutagénica
considerable.
• Actividad inhibición enzimatica: Las siguientes sustancias de los líquenes
presentan una actividad de inhibición: ácido lecanorico, ácido úsnico y extractos
de la Vulpicida Juniperinus, Hypogymnia Physodes y Letharia Vulpina.
• Actividad contra el Síndrome de Inmunodeficiencia Humana (VIH): Sustancias
químicas derivadas del extracto de la Umbilicaria esculenta inhiben el efecto
citopatológico del VIH in Vitro (Hirabayashi, 1998).

33. • Actividad Antialergica: Numerosas sustancias de los líquenes presentan esta
actividad ellas se encuentran: la atranorina, parietrina, ácido úsnico y ácido
protoliquenesterinico.
6.3.5. Habitats de los líquenes
Los líquenes se encuentran en todos los ecosistemas y regiones de vida colombianas;
son componentes muy conspicuos de la flora. La mayor expresión la exhiben en las
regiones de la vida andina y paramuna, en lo que respecta a líquenes foliosos y
fructicosos.
La mayoría de los líquenes son terrestres, algunos se dan cerca de caídas de agua. Su
tamaño varía mucho, desde pocos milímetros hasta varios centímetros. Existe una clara
zonación florística de estos organismos a lo largo del gradiente altitudinal; los líquenes
comienzan a ser comunes a medida que se incrementa la altitud y el óptimo esta entre
3.000 y 4.000 metros. Entre 1.000 y 2.000 metros el número de especies de
Heterodermia Leptogium y Parmotrema aumentan. Por encima de los 2.000 metros en
la zona de la andina baja, media y alta, es elevada la frecuencia de los líquenes foliosos
Parmeliaceae, Stictaceae, Lobariacae y Collemataceae, siendo por lo general
dominantes (VALENCIA-AGUIRRE, 2002).
6.4. QUIMIOTAXONOMIA
6.4.1. Química de los líquenes
La quimiotaxonomia ha jugado un papel importante en la compresión de grupos que
pertenecen a las categorías taxonómicas superiores, en los líquenes se ha enfocado en

34. el uso taxonómico de los datos de metabolitos a los niveles de especie y subespecie.
Dentro de los compuestos liquénicos producto del metabolismo del liquen se encuentra
los llamados ácidos liquénicos y otros tipos de sustancias orgánicas. Se conoce la
constitución química de 220 metabolitos secundarios encontrados en los líquenes, los
más comunes y conocidos son la atranorina y la parietrina y los ácidos úsnico,
rizocárpico, norstíctico, thamnólico, barbárico, vulpínico, entre otros. (BARRENO 1997,
VALENCIA AGUIRRE 2002). Varios de los metabolitos anteriormente nombrados
presentan propiedades biológicas importantes con relación ha esto varios de estos
compuestos han sido estudiados para determinar su actividad antioxidante. Algunos de
los compuestos mencionados con anterioridad se muestran en la figura 1.
FIGURA1. ESTRUCTURAS DE METABOLITOS SECUNDARIOS AISLADOS DE LÍQUENES.

35. NEELAKANTAN (1965) presentó una importante contribución sobre la clasificación de
las sustancias liquénicas, a nivel de grupos así:
1. Serie alifática
• Grupo 1- Ácidos Carboxílicos
• Grupo 2-Derivados de carbohidratos
• Grupo 3- Compuestos sulfurados
2. Serie carbocíclica
• Grupo 1- Isoprenoides alicíclicos
• Grupo 2- Dépsidas
• Grupo 3- Quinonas
3. Serie heterocíclica oxigenada
• Grupo 1- Derivados del ácido tetrónico
• Grupo 2- Depsidonas
• Grupo 3- Depsonas
• Grupo 4- Dibenzofuranos
• Grupo 5- Xantonas
• Grupo 6- Chromonas
4. Serie heterocíclica nitrogenada
6.4.2. Test de Coloración
El test de coloración es un método rutinario, simple. Se orienta exclusivamente a
detectar microscópicamente la presencia de grupos de compuestos químicos, que se
presentan dentro de un grupo taxonómicamente dado, evidenciado por los cambios de

36. color (VALENCIA-AGUIRRE, 2002). El test de coloración indica la presencia o
ausencia de sustancias alifáticas y aromáticas. Rutinariamente se emplean cuatro test
de coloración para sustancias liquenicas, cuya denominación convencional es: test K,
test C, test KC y test P o PD. Los test C, K y KC fueron descubiertos por NYLANDER
(1866, citado por SANTESSON, 1973). Los test de PD o (P) fue introducido por
ASAHINA (1934). Estas pruebas se llevan a cabo aplicando el reactivo apropiado
directamente sobre un fragmento liquénico, por medio de una varilla de vidrio
puntiaguda o haciendo una incisión al talo o la apotecio. Las reacciones color obtenidas
dependen de cierta forma de la concentración y localización de las sustancias
liquenicas en el talo; la corteza o médula deben ser tratadas a parte y para su
observación es mejor hacerlo bajo estereoscopio (VALENCIA-AGUIRRE, 2002).
Los cambios de coloración (amarillo, anaranjado, rojo, violeta) se consideran positivos e
indican la presencia de un grupo de compuestos determinados; se consideran negativo
si no hay cambio de color.
• Test C: Se emplea como reactivo una solución acuosa saturada de hipoclorito de
sodio o calcio. Como sustituido puede usarse blanqueador líquido comercial. Las
reacciones de color obtenidas por este test son inestables.
• Test K: Se usa como reactivo una solución acuosa de hidróxido de potasio.
• Test KC: Es una mezcla de hipoclorito de calcio con hidróxido de potasio.
Primero se aplica K e inmediatamente C.
• Test P o PD: Se utiliza como reactivo la fenilenodiamina en una solución
alcohólica fresca al 5%. Actualmente se emplea un reactivo más estable
denominado mezcla de Steiner.
En la siguiente tabla se resume la reacciones de las pruebas de coloración de algunas
sustancias liquénicas; sin embargo sólo indica los grupos de compuestos
(SANTESSON, 1973; VALENCIA-AGUIRRE, 2002).

37. REACCION COMPUESTOS
Pigmentos
K+
Rojo a
violeta
Antraquinonas, Bisantraquininas, terpenilquinonas
naftoquinonas, pyxiferina
K+,KC+ Xantonas,Sordidona
K+,PD+,K+ Ácidos úsnicos
Compuestos Incoloros
PD+,K+
Despidas:ácido alectoriálico,atranorina
ácido baeomicico,ácido barbatólico
cloroatranorina,ácido descarboxithamnólico
ácido emathamnólico, nefroarctina
ácido thamnólico
Depsidonas:ácido constíctico, ácido fumar-
protocetrárico,ácido norstíctico
ácido fisodálico,ácido salazinico
ácido stictico,ácido virénsico
PD+,K-
Pannarina,ácido psorómico,ácido fumar
protocetrarico
ácido protocetrarico, ácido virensico
PD-,K+,C+
Ácido critoclorofaeíco,ácido hiascico
ácido hipomnólico (K+violeta)
ácido meroclorofaeíco,ácido paludósico
ácido ramalinolico,scrobiculina
PD-,K-,C+ Rojo
Ácido anziáico,ácido4-O-dimetilbarbático
eritrina,etilorcelinato,ácido gyrofórico
ácido lecanorico,montagnetol,ácidoolivetorico,
Siphulina.
PD-,K-,C+ Verdoso
Ácido didymico,ácido pannarico,ácido
strepsilina
PD-,K-,C+ Azuloso Ácido diploschistesico
PD-,K-,C-,KC
+
Ácido alectóronico,ácido a-collatolico
ácido glomeliférico,ácido lobárico
ácido 4-O-metilfisódico
ácido microphillinico,ácido physidico
norlobaridona,ácido picroliquénico
TABLA 5. TEST DE COLORACION (SANTENSSON, 1973)
6.4.3. Cristalización

38. La cristalización es el proceso de separación de un soluto a partir de una solución, por
sobresaturación, concentración o enfriamiento de la misma. La cristalización permite
separar soluto a partir de una solución, en forma prácticamente pura.
Existen varias formas de sobresaturar una solución para que esta comience a cristalizar
fracciones de soluto: por saturación de solución en caliente y posterior enfriamiento de
la misma. Por concentración de la solución, mediante la evaporación de una parte del
solvente. Por adición de una substancia de mayor solubilidad en el solvente, que el
compuesto que se desea separar. Cuanto más lento sea el enfriamiento de la solución
saturada, más grandes y puros serán los cristales del sólido que se separa.
6.4.4. Técnicas cromatográficas
Debido a la gran diversidad de técnicas cromatográficas las cuales posibilitan el
aislamiento de estos metabolitos secundarios, la cromatografía se ha convertido en la
técnica microquímica más utilizada en las determinación de muchas sustancias
liquénicas, debido a su sensibilidad, rapidez y relativa simplicidad del equipo utilizado
(VALENCIA, AGUIRRE 2002).
La palabra Cromatografía significa "Escribir en Colores" ya que cuando fue desarrollada
los componentes separados eran colorantes. Los componentes de una mezcla pueden
presentar una diferente tendencia a permanecer en cualquiera de las fases
involucradas. Mientras más veces los componentes viajen de una fase a la otra
(partición) se obtendrá una mejor separación. En todas las técnicas cromatográficas
hay una fase móvil que consiste en un fluido (gas, líquido o fluido supercrítico) que
arrastra a la muestra a través de una fase estacionaria que se trata de un sólido o un
líquido fijado en un sólido.
Los componentes de la mezcla interaccionan con distinta forma con la fase estacionaria
y con la fase móvil. De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a

39. distintas velocidades y se van separando (S. DOUGLAS ,1995). Después de haber
pasado los componentes por la fase estacionaria y haberse separado pasan por un
detector que genera una señal que puede depender de la concentración y del tipo de
compuesto.
La cromatografía en sus diversas modalidades constituye hoy por hoy, una de las
herramientas analíticas más potentes que se conocen. Las técnicas cromatográficas
pueden clasificarse de diversas formas:
6.4.4.1. Cromatografía en capa fina
Un importante papel es una técnica nueva, la cromatografía en capa fina, con mucha
mayor sensibilidad y capacidad resolutiva, que, aunque conocida con anterioridad, no
fue aplicada al estudio de la química de los líquenes hasta el comienzo de la década de
los setenta (CULBERSON & KRISTINSON, 1970; CULBERSON, 1972; MENLOVE,
1974, CULBERSON & AMMANN, 1979). Esta técnica permitió el descubrimiento y
caracterización de sustancias nuevas que habían pasado inadvertidas, mediante el uso
de la cromatografía en papel, quizá por problemas de solapamiento o por bajas
concentraciones.
6.4.4.2. Cromatografía en columna
La cromatografía es una técnica que se emplea en el fraccionamiento de compuestos
orgánicos. Consiste en la aplicación de una muestra en una columna de cristal en la
que se ha situado una matriz sólida porosa que está inmersa en el solvente (SKOOG,
DOUGLAS 2003). A continuación se bombea una gran cantidad de solvente a través de
la columna Los diferentes compuestos se van retrasando de manera distinta según sus

40. interacciones con la matriz, por lo que pueden ser recogidas separadas a medida que
son eluídas por el fondo de la columna (ver figura 2.). Según la matriz escogida, los
compuestos se pueden separar de acuerdo a su carga, su hidrofobicidad, su tamaño o
su capacidad de unirse a grupos químicos particulares.
En la cromatografía en columna se utilizan los siguientes términos:
Matriz de la columna: Sustancia que está empapada de solvente y que se empaqueta
en la columna. También se denomina el lecho de la columna.
Longitud de la columna: Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna. Es
importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco
importante en otras como la cromatografía de afinidad.
Volumen de la columna: Volumen total de gel que se empaqueta en una columna
cromatográfica.
Volumen muerto de la columna: Cantidad de solvente que tiene que atravesar la
columna para asegurar que se ha reemplazado completamente. Coincide con el
volumen de solvente que sale de la columna desde que se aplica la muestra hasta que
empieza a salir la primera proteína. En general, y dependiendo del tipo de
cromatografía puede ser de 1 a varias veces el volumen de la columna (SKOOG,
DOUGLAS 2003).

41. FIGURA 2. CROMATOGRAFIA EN COLUMNA. (SKOOG, DOUGLAS 2003).
De las muchas variantes que se conocen en la actualidad, son de particular importancia
en este trabajo la cromatografía en placa preparativa, cromatografía bidimensional (ver
figura 3) y cromatografía flash de mediana presión. Todas estas técnicas conservan el
mismo principio de elución, pero su utilización depende tanto de la naturaleza de la
muestra como de las posibles variantes que se presenten a lo largo del proceso.
FIGURA 3. CROMATOGRAFIA EN PLACA BIDIMENSIONAL. (SKOOG, DOUGLAS 2003).
6.4.5. Técnicas espectroscópicas
La caracterización y la elucidación estructural de los metabolitos secundarios aislados
de la especie de liquen seleccionada se realiza mediante la determinación de sus
propiedades físicas color, apariencia, puntos de fusión, datos espectroscópicos (RMN
1
H, RMN 13
C).
6.4.5.1. Espectroscopía infrarroja (Espectroscopía IR)
Es la rama de la espectroscopía que trata con la parte infrarroja del espectro
electromagnético. Esta cubre un conjunto de técnicas, siendo la más común una forma

42. de espectroscopía de absorción. Así como otras técnicas espectroscópicas, puede
usarse para identificar un compuesto e investigar la composición de una muestra.
Para medir una muestra, un rayo de luz infrarroja atraviesa la muestra, y se registra la
cantidad de energía absorbida en cada longitud de onda. Esto puede lograrse
escaneando el espectro con un rayo monocromático, el cual cambia de longitud de
onda a través del tiempo, o usando una transformada de Fourier para medir todas las
longitudes de onda a la vez. A partir de esto, se puede trazar un espectro de
transmitancia o absorbancia, el cual muestra a cuales longitudes de onda la muestra
absorbe el IR, y permite una interpretación de cuales enlaces están presentes. (GROS,
POMILIO, SELDES, BURTON 1985).
Esta técnica funciona exclusivamente con enlaces covalentes, y como tal es de gran
utilidad en química orgánica. Espectros nítidos se obtienen de muestras con pocos
enlaces activos al IR y altos niveles de pureza. Estructuras moleculares más complejas
llevan a más bandas de absorción y a un espectro más complejo. Sin embargo esta
técnica no se ha podido utilizar para la caracterización de mezclas muy complejas.
6.4.5.2. Espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN)
Es una técnica empleada principalmente en la elucidación de estructuras moleculares,
aunque también se puede emplear con fines cuantitativos.
Algunos núcleos atómicos sometidos a un campo magnético externo absorben
radiación electromagnética en la región de las frecuencias de radio o radiofrecuencias.
Como la frecuencia exacta de esta absorción depende del entorno de estos núcleos, se
puede emplear para determinar la estructura de la molécula en donde se encuentran
éstos.

43. Para que se pueda emplear la técnica los núcleos deben tener un momento magnético
distinto de cero. Esta condición no la cumplen los núcleos con número másico y número
atómico par. Los núcleos más importantes en química orgánica son: ¹H, 13
C, 31
P, 19
F y
15
N. Otros núcleos importantes: 29
Si, 77
Se, 117
Sn, 195
Pt, 199
Hg, 203
Tl, 205
Tl, 207
Pb.
6.4.5.3. Espectroscopia Ultravioleta
El espectro Ultravioleta y Visible de las moléculas está asociado a transiciones
electrónicas entre los diferentes niveles energéticos en ciertos grupos o átomos de la
molécula y no caracterizan a la molécula como entidad.
En contraste la absorción de energía en la región Infrarroja estimulan la molécula
completa y causa cambios vibracionales y rotacionales en esta lo cual caracteriza la
entidad estructural de dicha molécula.
Los grupos de átomos que dan origen a la absorción en el UV cercano o UV de cuarzo,
se conocen como grupos cromóforos. La mayoría de los grupos insaturados y
heteroatómicos que tienen pares de electrones no compartidos, son cromóforos
potenciales y estos grupos son la base de la elucidación de grupos estructurales en las
moléculas activas en el UV cercano.
El espectro Ultravioleta de una molécula se obtiene generalmente en forma adicional al
espectro infrarrojo de la misma especie. Este espectro IR frecuentemente sirve como
dato confirmativo de la ausencia o presencia de ciertos grupos funcionales.
En algunos casos la espectroscopia UV puede ser fundamental para el estudio de
ciertos problemas específicos. Por ejemplo en la industria de los cosméticos, tintes,

44. colorantes y pinturas. El estudio de los grupos auxocromos y de su influencia en el
desplazamiento de ciertos compuestos químicos hacia la región visible hacen de esta
técnica una de las de mayor interés en ésta área. (SKOOG, D. A.; LEARY J.J. HOLLER
F. JAMES)
6.5. TECNICAS DE COLECCIÓN Y ESTUDIO
Para coleccionar líquenes se deben tener en cuenta las siguientes recomendaciones.
6.5.1. Materiales
Bolsas de papel, bolsas plásticas, navaja o cuchillo, martillo geológico, cincel, marcador
a prueba de agua, lupa de campo, libreta de notas, lápiz, reactivos.
6.5.2. Datos de campo
• Localidad: país, departamento, estado, provincia, vereda, finca, kilometraje a la
localidad mas cercana, coordenadas geográficas.
• Hábitat: descripción breve del tipo de bosque (primario, secundario), talud del
camino; potrero; condiciones ambientales circundantes, iluminación, humedad.
• Sustrato: suelo (tipo si es posible), roca, corteza, hojas (en lo posible el nombre
científico y/o vulgar del árbol), parte del árbol.
• Altitud: sobre el nivel del mar o en forma aproximada cuando no se conoce.
• Fecha: durante la cual se realizó la colección; especificar día, mes y año.
• Colector y número de colección: Nombre y apellido del colector o colectores, y el
número de colección.

45. Los datos anteriores se deben consignar en una libreta de notas para cada espécimen
coleccionado.
6.5.3. Colecta
Para colectar un ejemplar liquénico se deben tener en cuenta ciertas condiciones
inherentes a cada tipo de liquen: los crustáceos por su unión tan íntima con el sustrato
deben retirarse con un fragmento de éste y usar para ello una navaja o cuchillo; cuando
se trata de líquenes epilíticos o endolíticos se recomienda utilizar un martillo geológico.
Los líquenes se buscan sobre las rocas, en el suelo, en el talud de los caminos, sobre
troncos caídos, en las cercas. En el interior de los bosques se recomienda recorrer
cuidadosamente todas las partes del árbol (las cortezas, las ramas, el dosel). Para
buscar y colectar líquenes gelatinosos es mejor hacerlo después de la lluvia, por cuanto
en estado seco son inconspicuos y pueden pasar desapercibidos.
Se debe tener precaución con los líquenes foliosos muy secos, puesto que se puede
fracturar fácilmente; en estos casos, es mejor humedecerlos un poco o hacer la colecta
cuando el ambiente esté más húmedo.
Los ejemplares se toman en bolsas plásticas y se marcan con el número de colección
correspondiente. La muestra debe ser suficiente y en buen estado; se debe tomar una
buena cantidad que llene una bolsa, excepto cuando la población es pequeña; en lo
posible debe ser material fértil; no obstante, el material estéril no se debe desechar.
Posteriormente las muestras se pasan a bolsas de papel y en ellas se secan a baja
temperatura en la estufa o en el aire. No necesitan prensarse. Cuando las condiciones
ambientales son favorables, se puede coleccionar directamente en bolsas de papel.
Una vez el material esté seco, se puede guardar indefinidamente como material de
estudio docente o seguir el proceso habitual para su inclusión en el herbario. Cuando se
necesita hacer un estudio microscópico en el laboratorio, se coloca fragmentos de la

46. muestra (cuadrados de 0.5 – 1 cm de lado), apotecios enteros o seccionados (si son
grandes) en frascos con FFA (formol, ácido acético, alcohol) o con FPA (formol, ácido
propiónico, alcohol).
6.5.4. Estudio del material en el laboratorio
Los ejemplares deshidratados y debidamente preservados se pueden utilizar en el
laboratorio y seguir las técnicas pertinentes para las cuales se efectúo la colección. En
términos generales se puede humedecer parcial o totalmente la muestra; en este caso,
se debe ser muy cuidadoso con el material de donde se tomo la porción, para evitar que
otros organismos la contaminen y no pueda volverse a utilizar.
Los especimenes requeridos en estudios taxonómicos se tratan de manera muy
especial, no así aquellos utilizados en la docencia, que pueden ser fragmentados o
reutilizados para este propósito. Si se necesita hacer observaciones anatómicas del
talo, se realizan cortes transversales a mano alzada, usando pauche como soporte. Los
cortes más delgados se escogen para observaciones en el montaje húmedo.
Para detectar mejor sus constituyentes, el corte delgado de la muestra se coloca en una
solución acuosa de hipoclorito al 0.2-0.5 %; esta sustancia actúa como aclarante y
permite visualizar la coloración de las algas y la orientación de las hifas.
Para realizar los tests de coloración tenga en cuenta las precauciones de preparación y
el manejo de reactivos. (VALENCIA, AGUIRRE 2002).

47. 7. CAPITULO III
7.1. METODOLOGIA
La metodología utilizada se muestra en la figura 4. Se explicara a continuación cada
uno de los pasos empleados.Colecta y selección
de la muestra
Extracción (método
Soxhlet)
Elución del extracto primario
crudo en cromatografía en
columna (CC)
Aislamiento de
compuestos por
polaridad
Clasificación y separación de
compuestos en cromatografía
en placa (CP)
Purificación de
compuestos
(CC y CP)
Elucidación estructural
de compuestos (RMN, IR,
UV, MP, EM)
Prueba de actividad
antioxidante
(método DPPHo
) de
extracto.
Ensayo de actividad
antioxidante (CP)
compuestos impuros.
Test de
coloración.

48. FIGURA 4. ESQUEMA DE LA METODOLOGIA EMPLEADA.
7.1.1. Colecta y Selección del Liquen
Se seleccionó una especie de Liquen perteneciente a la familia Parmotrema a la que
no se le ha designado la especie. Con la colaboración de la Dra. Norma Valencia Islas
perteneciente al Departamento de Farmacia. Facultad de Ciencias. Universidad
Nacional de Colombia. Así mismo, en el Instituto de Ciencias Naturales de la
Universidad Nacional de Colombia se depositará un vaucher de referencia de la especie
analizada.
La cantidad recolectada de la especie fue de 300.7 g. El material liquénico
completamente seco y limpio se trituró en un molino de cuchillas, obteniendo como
peso neto 228.3 g; para que posteriormente se obtengan extractos orgánicos mediante
un proceso de extracción continua vía Soxhlet en metanol.
7.1.2. Método de extracción
Este tipo de extracción se realiza habitualmente en un aparato denominado Soxhlet.

49. FIGURA 5. METODO SOXHLET. (SKOOG, DOUGLAS, 2003)
La muestra (LQ) sólida se introdujo en un cartucho poroso (hecho con papel de filtro,
que permite al solvente entrar y salir reteniendo al sólido) el cual se colocó dentro del
recipiente B (ver figura 5). Se une un balón C a dicho recipiente donde se adicionó el
volumen de solvente (250 ml de metanol). Por el extremo superior del recipiente B, se
coloca un condensador D.
El solvente se calienta; los vapores ascienden por el tubo E, condensan en el
refrigerante D y caen dentro del recipiente B impregnando el líquen que se encuentra
en el cartucho A. El recipiente B se va llenando lentamente de líquido hasta que llega al
tope del tubo F y se descarga dentro del balón C por efecto de sifón, llevando consigo a
la sustancia extraída. El proceso se repitió hasta que la extracción se completa. El
solvente de extracción se evapora, recuperando así el extracto.
Se hicieron 3 (tres) montajes con el fin de acelerar el proceso, con lo cual cada montaje
tuvo un tiempo en el soxhlet, hasta el momento en el que se vio claro el solvente
mezclado con el liquen.
7.1.3. Elución del extracto primario crudo en cromatografía en columna (CC)

50. 8. CAPITULO IV
8.1. RESULTADOS
El Estudio Fitoquímico y Fisicoquímico de Actividad Antioxidante frente al Radical Libre
2,2-difenil-1-picrilhidracilo a nivel de Extracto, se realizo durante un periodo de seis
meses, los resultados obtenidos por los integrantes se reportan a continuación:
8.1.1. Estudio Taxonómico
Gracias a la colaboración del Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional
de Colombia, se determino que el liquen estudiado presenta la siguiente clasificación
taxonómica, según la tabla…. :
REIN
O FILO CLASE ORDEN FAMILIA
GÉNER
O ESPECIE
FUNGI
Ascomycot
a
Lecanoromycete
s
Lecanorale
s
Parmeliacea
e Rimelia Cetrata
Tabla . Clasificación Taxonómica del LQ Rimelia Cetrata
Debido a esto, el género y la especie del líquen estudiado es:

51. RIMELIA CETRATA (syn PARMOTREMA CETRATUM)
Figura. LQ Rimelia Cetrata Figura. LQ Rimelia Cetrata parte posterior
8.1.2. Colecta y Selección del Líquen
Se colectaron dos clases de material vegetal, la especie analizada (Rimelia Cetrata) y
un líquen de género desconocido al que llamaremos Líquen 2 (LQ 2). La cantidad
recolectada del líquen Rimelia Cetrata fue de 300.7 g y del líquen 2 fue de 61.2 g peso
en bruto, después de la respectiva limpieza y molienda se obtuvo 228.3 g del líquen
Rimelia Cetrata y 36.6 g de líquen 2. Los datos anteriormente descritos se observan en
la tabla….; a continuación:
Tabla . Peso en Gramos de Material Vegetal obtenido
8.1.3. Extracción
El método de extracción utilizado fue Soxhlet en metanol, en la tabla…. se observa el
número de extracciones, el tiempo transcurrido, junto con los respectivos intervalos de
cada material vegetal, hasta la extracción completa.
LIQUEN (LQ)
MASA DEL LQ FRESCO (g) MASA DEL LQ SECO
Y LIMPIO (g)
Rimelia Cetrata 300.7 228.3
2 61.2 36.6

52. LIQUEN
No DE
EXTRACCIONES DISOLVENTE TIEMPO(H)
INTERVALOS DE
TIEMPO
Rimelia
Cetrata
1 Metanol 10 2
2 Metanol 12 1
3 Metanol 11 1
4 Metanol 8 1
2 1 Metanol 8 2
Tabla . Tiempo de Líquenes Rimelia Cetrata y LQ 2 en el Sistema Soxlher
LIQUEN No DE
MONTAJES
TIEMPO(HORAS)
Rimelia
Cetrata
1 8
2 4 42
Tabla. Tiempo de Líquenes en el Método Soxlher
Al finalizar la extracción de cada uno de los líquenes se obtuvo los siguientes
resultados, en la tabla….. , se observa la cantidad en gramos colectada de cada líquen,
posteriormente la cantidad de material vegetal seco, limpio y molido; y por último de la
cantidad obtenida de extracto en bruto; se separo 2.5 g con sequedad total de extracto
del líquen Rimelia Cetrata para actividad biológica, por diferencia se obtuvo 45 g de
extracto en bruto del líquen Rimelia Cetrata.
Tabla. Cantidades Obtenidas del LQ Rimelia Cetrata y LQ 2.
LIQUEN
CANTIDAD
DEL LQ
FRESCO
(g)
CANTIDAD
DEL LQ
SECO Y
LIMPIO (g)
CANTIDAD
DEL
EXTRACT
O EN
BRUTO (g)
CANTIDAD
DEL
EXTRACTO
EN BRUTA
PARA CC
(g)
CANTIDAD
DEL
EXTRACTO
EN BRUTO
PARA
ACTIVIDAD
BIOLOGICA
(g)
Rimelia
Cetrata
300.7 228.3 48.583 45 2.5
2 61.2 36.6 6.656
0.216

53. 8.1.4. Aislamiento de Metabolitos Secundarios del LQ Rimelia Cetrata
8.1.4.1 Elución del Fraccionamiento Primario del Extracto en Crudo del
Líquen Rimelia Cetrata
SISTEMA PROPORCION
%
FRACCIONES
Hexano 100 1-9
Hexano-
Tolueno
50-50 10-16
Tolueno 100 17-21
Tolueno-
Acetato de
Etilo
50-50 22-39
Acetato de
Etilo
100 40-49
Acetato de
Etilo-Metanol
50-50 50-54
Metanol 100 55-66
Tabla . Elución Del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo del LQ Rimelia Cetrata

54. Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata
Sistema Hexano

55. Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata

56. Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata
Sistema Metanol
Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata
FRACCIONES
COBINADAS
CLAVE
1-10 A
11-15 B
16-18 C
19-22 D
23-37 E
38-46 F
47-54 G
55-60 H
61-66 I
Tabla. Clave De Elución Del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo del LQ Rimelia Cetrata
FRACCION FRACCION
COMBINADA
PESO
DEL
VIAL
VACIO
(g)
PESO DEL
VIAL CON
MUESTRA
(g)
PESO DE LA
FRACCION(mg)
ORDEN DE
LAS
FRACCIONES
DE INTERES

57. A 1-10 5.954 6.030 76 |
B 11-15 5.640 5.942 302
C 16-18 5.677 6.307 63
D 19-22 49.175 51.976 2801
E 23-37 51.915 54.279 2364
F 38-46 5.623 7.561 1938
G(ℓ) 47-54 5.392 6.467 1075
G(s) 47-54 28.180 28.652 472
H 55-60 86.49 88.611 2121
I(ℓ) 61-66 137.08 143.353 6271
I(s) 61-66 41.588 45.601 4013
Tabla. Masas del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata