SlideShare una empresa de Scribd logo
1 de 58
Descargar para leer sin conexión
DETERMINACION DEL POTENCIAL ANTIOXIDANTE DEL EXTRACTO Y
METABOLITOS SECUNDARIOS AISLADOS PERTENECIENTES AL LIQUEN
COLOMBIANO RIMELIA CETRATA
JEISSON ANDRES PABON ORTIZ
20022150056
NINA MARIA SANCHEZ RAMIREZ
20012150070
MARIA DEL PILAR SILVA MARTINEZ
20022150069
Trabajo de grado para optar al titulo de Licenciatura en Química.
Línea Evaluación Biológica y Fisicoquímica de Metabolitos Secundarios de
Líquenes Colombianos
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA EDUCACION
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
DEPARTAMENTO DE QUIMICA FARMACEUTICA
BOGOTA, D.C. 2007
DETERMINACION DEL POTENCIAL ANTIOXIDANTE DEL EXTRACTO Y
METABOLITOS SECUNDARIOS AISLADOS PERTENECIENTES AL LIQUEN
COLOMBIANO RIMELIA CETRATA
JEISSON ANDRES PABON ORTIZ
20022150056
NINA MARIA SANCHEZ RAMIREZ
20012150070
MARIA DEL PILAR SILVA MARTINEZ
20022150069
Trabajo de grado para optar al titulo de Licenciatura en Química.
Línea Evaluación Biológica y Fisicoquímica de Metabolitos Secundarios de
Líquenes Colombianos
DIRIGIDO POR:
DR. JOSE LEOPOLDO ROJAS ARAQUE
Investigador Principal
DRA. NORMA ANGELICA VALENCIA ISLAS
Co- Investigadora
LIC. MARISOL RAMOS
Docente Titular Universidad Distrital Francisco José de Caldas
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA EDUCACION
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
DEPARTAMENTO DE QUIMICA FARMACEUTICA
BOGOTA, D.C. 2007
Nota de Aceptación
________________________
________________________
________________________
__________________________
Firma del Presidente del Jurado
__________________________
Firma del Jurado
__________________________
Firma del Jurado
Dedicatoria
“Si resultara cierto que alimentar a los extraños es inherente a la naturaleza toda,
como
Algo que tiene carácter de ley general, muchos enigmas quedarían entonces
resueltos”
Goethe 1827, in Kropotkin, El apoyo mutuo: un factor de evolución.
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan agradecimientos a:
Marisol Ramos, Licenciada en Química, Facultad de Ciencias de la Educación,
Universidad Distrital Francisco José de Caldas, Docente Titular, por su constante apoyo
y motivación al trabajo.
DRA. Norma Angélica Valencia Islas, Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias,
Universidad Nacional de Colombia, Co- investigadora del proyecto, por sus valiosos e
importantes aportes y orientaciones.
DR. José Leopoldo Rojas Araque, Departamento de Química, facultad de Ciencias,
Universidad Nacional de Colombia, Investigador Principal del proyecto, por sus valiosas
sugerencias.
CONTENIDO
Pág.
1. INDICE DE TABLAS 0
2. INDICE DE FIGURAS 0
3. INDICE DE ANEXOS 0
4. RESUMEN 0
5. CAPITULO I 0
5.1. JUSTIFICACIÓN 0
5.2. INTRODUCCION 0
5.3. ESTUDIOS PREVIOS 0
5.3.1. Del Género 0
5.3.2. Del Método 0
5.4 PROBLEMA 0
5.5. HIPOTESIS 0
5.6. OBJETIVO GENERAL 0
5.7. OBJETIVOS ESPECIFICOS 0
6. CAPITULO II 0
6.1. LIQUENES 0
6.2. CONSTITUYENTES DE LOS LIQUENES 0
6.2.1. Fotobionte o componente algal (ficobionte) 0
6.2.2. Micobionte u hongo liquenizado 0
6.2.3. Relaciones entre los simbiontes 0
6.2.3.1. Relación fisiológica 0
6.2.4. Morfología y anatomía del talo 0
6.3. ASPECTOS ECOLOGICOS 0
6.3.1. Sustratos liquénicos 0
6.3.2. Resistencia a condiciones extremas 0
6.3.3. Sustancias de los líquenes 0
6.3.4. Uso de los líquenes 0
6.3.5. Habitats de los líquenes 0
6.4. QUIMIOTAXONOMIA 0
6.4.1. Química de los líquenes 0
6.4.2. Test de coloración 0
6.4.3. Cristalización 0
6.4.4. Técnicas cromatográficas 0
6.4.4.1. Cromatografía en capa fina 0
6.4.4.2. Cromatografía en columna 0
6.4.5. Técnicas espectroscópicas 0
6.4.5.1. Espectroscopía infrarrojo 0
6.4.5.2. Espectroscopía RMN 0
6.4.5.3. Espectroscopía ultravioleta 0
6.5. TECNICAS DE COLECCIÓN Y ESTUDIO 0
6.5.1. Materiales 0
6.5.2. Datos de campo 0
6.5.3. Colecta 0
6.5.4. Estudio del material en el laboratorio 0
7. CAPITULO III 0
7.1. METODOLOGIA 0
7.1.1. Colecta y Selección del Liquen 0
7.1.2. Método de Extracción 0
7.1.3. Elución del extracto primario crudo en 0
cromatografía en columna (CC)
7.1.4. Aislamiento de compuestos por polaridad 0
7.1.5. Test de coloración 0
7.1.6. Clasificación y separación de compuestos 0
en cromatografía en placa.
7.1.7. Purificación de compuestos (CC y CP) 0
7.1.8. Elucidación estructural de compuestos 0
(RMN, IR, UV, MP, EM).
7.1.9. Ensayo de actividad antioxidante (CP) 0
compuestos impuros.
7.1.10. Prueba de actividad antioxidante 0
(método DPPHo
) de extracto.
8. CAPITULO IV 0
8.1. RESULTADOS 0
8.2. ANALISIS DE RESULTADOS 0
8.3. CONCLUSIONES 0
9. CAPITULO V 0
9.1. RECURSOS 0
9.1.1. HUMANOS 0
9.1.2. FISICOS 0
9.1.2.1. Materiales 0
9.1.2.2. Equipos 0
9.1.2.3. Reactivos 0
9.1.3. FINANCIEROS 0
9.2. CRONOGRAMA 0
9.3. COMPONENTE PEDAGOGICO 0
9.4. BIBLIOGRAFIA 0
1. INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Algas participantes en la simbiosis primaria de líquenes.
Tabla 2. Fases de formación de un talo.
Tabla 3. Distribución de líquenes según sustrato.
Tabla 4. Test De Coloración.
Tabla. Materiales
Tabla. Equipos
Tabla. Tiempo De Los Líquenes 1y 2 En El Sistema Soxhlet
Tabla. Masa Inicial Del Liquen Rimelia Cetrata
Tabla. Ubicación De La Especie Parmotrema
Tabla. Tiempo De Los Líquenes En El Método Soxhlet
Tabla. Test De Coloración. Para El LQ Rimelia Cetrata Y LQ 2
Tabla. Test De Coloración. Para Las Fracciones Del El LQ Rimelia
Tabla. Sistemas Para El Barrido De Las Cromatografías
Tabla. Elusión Del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata
Tabla . Clave De La Elusión Del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo De La
Rimelia Cetrata
Tabla . Punto De Fusión De Algunas De Las Claves Que Se Encuentran Puras De La
Rimelia Cetrata
Tabla . Masas Del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata
Tabla . De Las Masas Del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo De La Rimelia
Cetrata
Tabla . Cromatografía En Columna De La Fracción D A Partir Del Extracto Crudo De La
Rimelia Cetrata
Tabla . Clave De La CC De La Fracción D A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia
Cetrata
Tabla . Masas De La Fracción D De La Rimelia Cetrata
Tabla . CC De La Fracción E A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata
Tabla . Clave De La CC De La Fracción E A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia
Cetrata
Tabla . CC De La Fracción CDd A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata
Tabla .Clave De La CC De La Fracción CDd A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia
Cetrata
Tabla . Masas De Las Fracciones A partir De CDd De La Rimelia Cetrata
Tabla . CC De La Fracción Ed A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata
Tabla . Clave De La CC De La Fracción Ed A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia
Cetrata
Tabla . Masas De Las Fracciones Ed De La Rimelia Cetrata
Preparativa De La Fracción 2cdd Y De La 3cdd
Tabla . Preparativa De La Fracción 2cdd Y De La 3cdd
Tabla . Cromatografía Flash De Mediana Presión De La Fracción E A Partir Del
Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata
Tabla .Clave De La cromatografía Flash De Mediana Presión De La Fracción E A Partir
Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata
Tabla . Masas Del Fraccionamiento Primario Del Ed De La Rimelia Cetrata
Tabla . Cromatografía Flash De Mediana Presión De La Fracción E,
Tabla . Clave De La Cromatografía Flash De Mediana Presión De La Fracción E
Tabla . Masas Del Fraccionamiento Primario Del E De La Rimelia Cetrata
Tabla . Valores Espectrofotometricos De [DPPH°] & Absorbancia
Tabla . Valores Espectrofotometricos De [AcAsc] & Absorbancia
2. INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructuras de metabolitos secundarios aislados de líquenes.
Figura 2. Cromatografía en columna.
Figura 3. Cromatografía en placa bidimensional.
Figura 4. Esquema de la metodología empleada.
Figura 5. Método soxhlet.
3. INDICE DE ANEXOS
Anexo . Sistema Soxlher
Anexo . Preparación De La Sílice Gel Impregnada Con Ácido Oxálico Al 1%.
Anexo . Cromatografía En Columna
Anexo . Cromatografía Preparativa
Anexo . Recristalizacion
Anexo . Preparación De La Curva De La Curva De Calibración Del Radical [DDPPH]
Diagrama . Cinética Del Ácido Ascórbico & Radical Libre (DDPPH)
Anexo . Cinética De La Muestra Biológica Del Liquen Rimelia Cetrata Con El Radical
Libre (DPPH).
Anexo . Balanza Analítica
Anexo . Balanza de tres brazos
Anexo . Cámara de UV
Anexo . Campana de Extracción
Anexo . Columna Cromatografica
Anexo . Columna Flash de mediana Presión
Anexo . Espectrofotómetro UV
Anexo . Horno de calentamiento
Anexo . Horno Secador
Anexo . Microscopio
Anexo . Punto de Fusión
Anexo . Rotavapor)
Anexo . Soxhlet
nexo . 1,2 DifenilEndiamina
Anexo . Etilo Acetato Para Cromatografía En Fase Liquida
Anexo . Acido Acético (Glacial) 100% Puro
Anexo . Acido L (+) Ascórbico
Anexo . Acido Formico
Anexo . Acido Oxálico Dihidratado
Anexo . Acido Sulfurico
Anexo . Agua Destilada
Anexo . Benceno Para Cromatografía En Fase Liquida
Anexo . Cloruro de Hierro (III)
Anexo . Etanol
Anexo . Éter Dietilico Puro
Anexo . Hidróxido De Potasio
Anexo . Hipoclorito De Sodio
Anexo . Metanol
Anexo . n-Hexano Para Cromatografía En Fase Liquida
Anexo . Silicagel Granulado
Anexo . Sulfato De Magnesio
Anexo . Tolueno Para Cromatografía En Fase Liquida
Anexo . Infrarrojo del Compuesto B
Anexo . Infrarrojo del Compuesto C
Anexo . Resonancia Magnética Nuclear del CompuestoB
Anexo . Resonancia Magnética Nuclear del CompuestoC
Anexo . Resonancia Magnética Nuclear del CompuestoD
4. RESUMEN
El principal objetivo de esta investigación es realizar un estudio detallado de una especie
de Liquen de Género Rimelia, desde el punto de vista Fitoquímico y así posteriormente
hacer el estudio Cinético a nivel de Extracto con el Radical Libre 2,2- Difenil-1-
picrilhidracilo DPPH°.
Como consecuencia de la gran diversidad biótica que posee nuestro país y la
incalculable fuente de riquezas se puede llegar a tener aplicaciones muy útiles en la
salud, industria, agricultura, biotecnología, entre otras. Uno de estos recursos que no ha
sido muy estudiado desde la parte Química son los Líquenes pero llama bastante la
atención la capacidad que este posee para sobrevivir en condiciones extremas,
habitando en medio ambientales como en el desierto, en los polos, y mas aún en zonas
donde se presenta un clima tropical
Durante el desarrollo de este trabajo nos propusimos cumplir a cabalidad con los
objetivos planteados, relacionado casi en su totalidad con la parte Química del Liquen
perteneciente al Género Rimelia.
Así pues, en el Capitulo I se hace una descripción de los objetivos propuestos, el
problema de investigación y los estudios previos realizados por otros autores.
En el Capitulo II, se tratan todos los aspectos relacionados con la diversidad y riqueza
en las regiones Naturales de Colombia, aspectos ecológicos, y un gran énfasis con
respecto a la Quimiotaxonomia, técnicas de Colección y Estudio. En el Capitulo III se
expone la metodología utilizada durante el proceso de investigación.
En el Capitulo IV, se muestran los resultados obtenidos y se realiza el análisis en
cuanto a estos y se concluye finalmente.
En el Capitulo V se tiene en cuenta el enfoque Pedagógico y Medioambiental como
Futuros Licenciados En Ciencias De La Educación.
Es de gran importancia resaltar que para el estudio Fisicoquímico se hace uso de
Técnicas y Métodos de Separación (cromatografía); en un principio se realizó la
extracción del LQ haciendo uso de la Extracción Continua en Equipos Soxhlet (20°C),
pues es uno de los métodos mas utilizados para obtener constituyentes orgánicos de
tejidos vegetales secos y pulverizados, este procedimiento es ideal para el análisis a
gran escala y como disolvente se utiliza Metanol el cual nos brindará un buen
rendimiento, ya que puede llegar a penetrar rápidamente en los órganos vegetales,
además se tiene en cuenta otras características como la selectividad (poder
disolvente), temperatura de ebullición (estabilidad térmica de los constituyente), poder
de penetración de las paredes celulares, facilidad de recuperar, precio o costo,
seguridad de manipulación, baja reactividad.
Ya con el extracto en bruto se empleo una de las técnicas de separación para los
componentes de una mezcla de solutos, como son las separaciones cromatográficas, la
cual tiene en cuenta las propiedades fisicoquímicas, tales como la polaridad y la carga
iónica de los solutos, el tamaño molecular, el grado de adsorción entre los solutos y las
fases estacionarias, o el reparto entre dos solutos entre las fases líquidas inmiscibles.
En este estudio vamos a utilizar la Cromatografía en columna (CC), la cromatografía en
capa fina (CCF), cromatografía preparativa (CP).
Posteriormente se utilizo Métodos Instrumentales como Infrarrojo (IR), Ultravioleta (UV),
Masas, Resonancia Magnética Nuclear (RMN), espectrofotometría UV, de los
compuestos puros, con el fin de conocer los compuestos hallados. Finalmente se
realizo el Estudio Cinético del Extracto frente al radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidracilo
DPPH°.
5. CAPITULO I
5.1. JUSTIFICACIÓN
En nuestro país existe una amplia biodiversidad de líquenes, los cuales representan un
recurso de gran importancia y atractivo para el mundo. El estudio de estos organismos
ha despertado en la actualidad un gran interés debido a varias propiedades bioactivas
que poseen los metabolitos secundarios que los conforman. Gracias a varios estudios
realizados en Colombia se conoce una amplia gama de las especies que existen de
estos organismos, donde las investigaciones realizadas se han enfocado básicamente
en la clasificación taxonómica contribuyendo en gran medida al conocimiento de la
biodiversidad de líquenes de nuestro país.
Sin embargo en el aspecto químico y biológico los estudios realizados han sido pocos,
ya que aún existe una gran cantidad de especies sin clasificar taxonómicamente dada
la carencia de estudios químicos indispensables para tal fin, la siguiente propuesta
pretende contribuir al conocimiento de la química de los líquenes Colombianos.
Por las razones expuestas y dado el gran potencial que ofrecen los Líquenes como una
fuente de nuevos principios activos y la gran diversidad de Colombia en este recurso
natural, la búsqueda de nuevos y mejores agentes antioxidantes para el tratamiento y
prevención de muchas enfermedades y para el uso en alimentos y cosméticos serán las
problemáticas guías en el proyecto de investigación.
5.2. INTRODUCCIÓN
Los líquenes son organismos simbióticos entre un alga y un hongo, dichos organismos
han sido poco estudiados en nuestro país. Gracias al grupo de investigación en
Estudios Biológicos y Fisicoquímicos de Líquenes Colombianos de la Universidad
Nacional de Colombia dirigido por el Dr. José Leopoldo Rojas Araque, junto con el
apoyo del Instituto de Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia se ha podido
incrementar la investigación en este campo.
El estudio de la actividad antioxidante en extractos liquénicos y compuestos aislados
de los mismos ha sido poco explorado en nuestro país, como se menciono con
anterioridad, los estudios realizados por autores como, (K. DIVAKAR, BLANCO, L.
HAWKSWORTH, CRESPO, 2005) en el género Rimelia cetrata se han encaminado al
estudio taxonómico del mismo, sin embargo no se ha realizado un estudio detallado
acerca de la bioactividad de los metabolitos secundarios que se presentan en dicha
especie.
Para ello es de gran importancia realizar inicialmente un estudio fitoquímico donde se
logre aislar e identificar aquellos metabolitos secundarios de mayor actividad que
presenta la especie y de esta manera realizar un estudio fisicoquímico para lograr
contribuir al desarrollo científico de nuestro país.
5.3. ESTUDIOS PREVIOS
5.3.1. Antecedentes del Género Rimelia
En la base de datos consultada, se encontraron tres artículos relacionados con el
género Rimelia cetrata, estos están basados básicamente en el aislamiento e
identificación de glucanos y galactoglucanos con el fin de presentar información acerca
de la taxonomía de este líquen.
En el articulo titulado “Molecular phylogenetic studies on the Parmotrema reticulatum
(syn. Rimelia reticulata) complex, including the confirmation of P. pseudoreticulatum as
a distinct species” (K. DIVAKAR, BLANCO, L. HAWKSWORTH, CRESPO, 2005).
Se concluye que la Parmotrema reticulatum (TAYLOR, M.CHOISY), P. clavuliferum y P.
pseudoreticulatum, son organismos simbióticos de una misma familia que provienen de
un grupo morfológicamente similar, por tal motivo es indiscutible su parecido
químicamente (todos estos géneros contienen atranorina, cloroatranorina, ácido
salazinico y consalazinico). Sin embargo algunos autores (Sano & Fletcher 1990; Sano
& DePriest 1999; Kurokawa 1991, 2003), colocan dichos géneros por separado o a
veces en el género Rimelia, en el cual se encuentra el cetrata.
En los artículos titulados “Chemotypes significance of lichenized fungi by structural
characterization of heteropolysaccharides from the genera Parmotrema and Rimelia” y “
Chemotypes significance of lichenized fungi by structural characterization of
heteropolysaccharides from the genera Parmotrema and Rimelia” (ROSECHRER,
GRASSI MELLINGER A, ELIASARO B, GORIN A, IACOMINI, 2005). Se aislaron
Galactoglucanos y glucanos de los hongos liquenizados del género Parmotrema
(austrosinense de Parmotrema, Parmotrema delicatulum, mantiqueirense de
Parmotrema, schindlerii de Parmotrema, y tinctorum de Parmotrema) y de Rimelia (el
cetrata de Rimelia y reticulata de Rimelia) en dichos estudios se concluyo la similitud
de estos dos géneros. La química y análisis de estos compuestos es posible a varios
métodos espectroscópicos y cromatográficos. Gracias a estos análisis la taxonomia de
este tipo de organismos se estructura aún más.
Los estudios mostrados con anterioridad elucidan la problemática taxonómica de estos
géneros (Parmotrema y Rimelia) en cuanto a sus propiedades químicas, por medio del
aislamiento y la aplicación de métodos espectroscópicos y cromatográficos de dichos
compuestos (glucanos y galactoglucanos) se pudo llegar a la conclusión de que estos
géneros no pueden ser separados. Sin embargo se desaprovecha el potencial del sin
número de compuestos que presentan este tipo de hongos liquenizados, por tal razón
es de suma importancia utilizar dichas propiedades con el fin de un desarrollo a futuro
en el campo de la medicina, industria, alimentos, etc.
5.3.2. Antecedentes del Método
Los estudios y trabajos que se han realizado con líquenes tanto en el aislamiento de
compuestos como en lo relacionado con actividad antioxidante han marcado una pauta
en cuanto a la utilización de estos en distintas áreas tanto en la educación como a nivel
científico, de estos citaremos algunos ya que por su interés y hallazgo son relevantes,
de tal forma también se tuvo en cuenta estos para aplicar la metodología de este
estudio.
En el artículo “Use of Free Radical Method to Evaluate Antioxidant Activity” (WILLIAMS,
E. CUVELIER, C. BERSET, 1995) se utiliza el radical DPPH (2,2-Difenil-1-picrilhidracilo)
como técnica para la evaluación de actividad antioxidante, esta prueba se hace para
compuestos fenólicos, los cuales presentan mayor actividad. Se hace un análisis
detallado de los resultados y se discute de acuerdo a la química de las reacciones
establecidas. Este artículo es la base del estudio cinético para determinar actividad
antioxidante en nuestro estudio, y posee constantes establecidas para posibles
compuestos aislados.
El segundo articulo relevante y de gran ayuda en nuestro estudio se titula “Improved
Chromatographic Method for the Purification of Phenolic Constituents of the Lichen
Parmotrema Tinctorum (Nyl.) Hale” (G. K. JAYAPRAKASHA, L. JAGANMOHAN, R. P.
SINGH, K. K. SAKARIAH, 1998) en este trabajo se estandariza el método
cromatografico para el aislamiento de los compuestos liquénicos, establece criterios
comprobados en cuanto a cantidad de reactivos y características de estos y menciona
los diversos sistemas de elución para obtener determinado compuesto. Otro articulo
relacionado con estos estudios cromatográficos en líquenes se titula “A Standardized
Method for the Identification of the Lichen Products” (F. CULBERSON, H.
KRISTINSSON, 1970) Se diferencia del anterior por poseer tablas de RF y test de
coloración de compuestos liquénicos. Además muestra otros sistemas de Elución y la
correcta forma de tomar los rf.
En otros estudios relacionados con la actividad antioxidante de importancia han sido:
“Determination of Antioxidative Potencial of Lichen Usnea Ghattensis in Vitro” (B. C.
BEHERA, N. VERMA, A. SONONE, U. MAKHIJA, 2004), “Free Radical Scavenging
Behavior Antioxidant Compounds of Sesame (Sesamum Indicum L.) in DPPHo
System”
(K. P. SUJA, A. JAYALEKSHMY, C, ARUMUGHAN, 2004), “Comparison of Antoxidant
Activity and Phenolic Content of Three Lichens Species”(F. ODABASOGLU, A. ASLAN,
A. CAKIR, H. SULEYMAN, Y. KARAGOZ, M. HALICI, Y. BAYIR, 2004 ) “Determination
of Antioxidant Activity of Lichen Cetraria Islandica(L) Ach ” (I. GÜLÇIN, M. OKTAY, Ö.
KÜFREVIOGLU, A. ASLAN, 2001), algunos nombran el método de tiocianato con el fin
de ensayar actividad antioxidante, sin embargo realizan otros estudios, como
determinación de contenido fenólico y poder reductor.
5.4. PROBLEMA
Aislar los Metabolitos Secundarios de mayor Actividad frente al radical 2,2-Difenil-1-
picrilhidracilo DPPH●
de un LQ Colombiano del género Rimelia y así poder realizar los
ensayos del poder antioxidante a nivel de Extracto.
5.5. HIPOTESIS
• Los metabolitos aislados del líquen de la especie Rimelia presentaran una actividad
antioxidante relevante frente al radical 2,2-Difenil-1-picrilhidracilo DPPH●.
• El aislamiento de los metabolitos de la especie Rimelia permitirá la clasificación
taxonómica dentro de la colección de líquenes Colombianos del Instituto de Ciencias
de la Universidad Nacional de Colombia.
5.6. OBJETIVO GENERAL
• Contribuir al conocimiento de la química de los líquenes Colombianos del género
Rimelia de una especie no analizada, con la finalidad de identificar y aislar los
metabolitos secundarios presentes en el organismo y de esta manera determinar el
potencial antioxidante a nivel de Extracto mediante el ensayo del poder antioxidante
y del poder reductor.
5.7. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Realizar un estudio Fitoquímico detallado del LQ perteneciente al Género Rimelia.
• Identificar y caracterizar los metabolitos secundarios aislados presentes en el liquen
estudiado mediante la determinación de sus constantes físicas a partir de técnicas
espectroscópicas.
• Hacer uso del estudio cinético de la reacción del compuesto con el radical libre de
DPPH°
a partir de la constante de velocidad y de los Ec50.
6. CAPITULO II
6.1. LÍQUENES.
Los líquenes u hongos liquenizado son organismos complejos formados por un hongo
y un alga. A estas unidades se llega por un equilibrio dinámico entre estos dos tipos de
organismos, en ellos la parte algal actúa como organismo fotoautótrofo que aporta
hidratos de carbono, mientras que la parte fúngica actúa como heterótrofo aportando
sales y agua. Los líquenes se clasifican de acuerdo con el tipo de hongo (llamado
micobionte) que los componen. El micobionte de la mayoría de los líquenes es un
ascomicete, aunque en algunos líquenes tropicales es un basidiomicete (VALENCIA-
AGUIRRE, 2002; DE BARY, 1879; SCHWENDENER, 1868). El alga que compone un
liquen (llamada ficobionte) suele ser unicelular del tipo de las algas verdes, como
Trebouxia o Coccomyxa, o del tipo de las algas verdeazuladas, como Nostoc o
Scytonema.
6.2. CONSTITUYENTES DE LOS LIQUENES.
6.2.1. Fotobionte O Componente Algal (Ficobionte)
Las algas presentes en los talos liquénicos (aproximadamente cuarenta géneros),
clorofíceas y cianobacterias de tipo unicelular, cenóbico o filamentoso reciben
diferentes denominaciones como: algas simbióticas, algas liquenicas, componente
algal, fotobionte o ficobionte. Las algas simbiontes son de vida libre, pueden subsistir
libremente en la naturaleza en donde se reproducen sexual y asexualmente
comportándose como simbiontes facultativos en la asociación liquénica (VALENCIA-
AGUIRRE, 2002).
Los géneros Trebouxia, Trentepholia y Nostoc son los fotobiontes más frecuentes, y de
amplia distribución en las asociaciones liquénicas. Los géneros Trebouxia, Trentepholia
son eucarióticos y pertenecen a algas verdes; Nostoc pertenece al grupo de bacteria
oxígeno –fotosintética (cianobacteria). Cuando un alga se encuentra asociada con un
micobionte no se reproduce sexualmente, lo hace en forma asexual. Las cianobacterias
(algas verde-azules) se multiplican por fisión binaria, heterocistes o akinetos, son de
naturaleza procariota. Las clorofíceas, por su parte se multiplican por división celular
vegetativa o por formación asexual de esporas llamadas aplanoesporas.
El fotobionte en asociación liquénica puede cambiar la intensidad del color, la forma
general, el tamaño, las cubiertas de gelatina y tener cambios fisiológicos. Algas como
Trentepholia y Gloeocapsa son más pigmentadas en vida libre que el liquen. En ciertas
especies de Trebouxia y Nostoc una cubierta gelatinosa esta presente en medio de
cultivo, pero no en el talo (VALENCIA-AGUIRRE, 2002). Aproximadamente el 92% de
las especies poseen ficobiontes verdes, frente a un 8% de cianobacterias.Nostoc,
Scytonema, Stigonema, Gloeocapsa y Calothrix son los cianosimbiontes más comúnes
(BARRENO, 1997).
Los principales grupos de algas participantes en la simbiosis primaria de líquenes son:
CHLOROPHYTA: 90 A 95 % EN REGIONES TROPICALES.
Palmellaceae, Coccomyxaceae, Protococcaceae, Trentepohliaceae, Cladophoraceae, Chlorococcaceae,
Oocystaceae, Botryococcaceae.
CYANOPHYTA: 5 A 10 % EN REGIONES TROPICALES.
Chroococcaceae, Nostocaceae, Scytonemataceae, Rivulariaceae.
XANTHOPHYCEAE Heterococcus en Verrucaria sp.
PHAEOPHYCEAEPetroderma en Verrucaria sp.
TABLA.1 ALGAS PARTICIPANTES EN LA SIMBIOSIS PRIMARIA DE LIQUENES. (FERRARO, INSTITUTO DE CIENCIAS BOTANICAS, 2000)
6.2.2. Micobionte U Hongo Liquenizado
Los hongos que entran en la constitución de los líquenes son principalmente
Ascomycotina y sólo unos pocos pertenecen a los Basidiomycotina o Deuteromycotina.
Se han observado también algunas formas más o menos inciertas de liquenización
detectadas de otros grupos fungales (VALENCIA-AGUIRRE, 2002).
La clasificación y denominación de los líquenes se refiere siempre al micobionte, según
lo establecido en el Código Internacional de la Nomenclatura Botánica (CINB). El
hongo determina la naturaleza y forma de la mayoría de los líquenes y produce las
estructuras fructificantes, comparables a las formas de vida libre (BARRENO, 1997;
VALENCIA-AGUIRRE, 2002).
Los hongos de los líquenes casi siempre son simbiontes estrictos y no son capaces de
prosperar en la naturaleza sin el ficobionte apropiado (son simbiontes obligados). La
mayoría de ellos forman colonias compactas y elevadas de diversa formas, color y
tamaño; por el contrario los hongos separados del fotobionte forman un micelo carente
de la organización y la diferenciación celular típica del talo del liquen. La pared del
hongo debe ser flexible para facilitar los contactos con el ficobionte; también participan
en la captación de agua, de nutrientes y en su transporte al citoplasma. El agua de las
células algales está controlada por el hongo a través del apoplasto fangal, por lo tanto
no tienen acceso directo a ella (RICHARDSON, 1999; HONNEGGER, 1998).
Otros grupos particulares de hongos como los Myxomycetes al unirse con algas forman
"mixolíquenes" mientras que la unión de Actinomicetes con algas constituyen
"actinolíquenes", no son muy frecuentes.
6.2.3. RELACIONES ENTRE LOS SIMBIONTES
6.2.3.1. Relación Fisiológica
Es el rol fisiológico que cumple cada uno de los simbiontes en beneficio del consorcio.
El hongo protege al alga contra la desecación y el calor solar produciendo pigmentos en
los tejidos; proporciona al fotobionte gas carbónico de su respiración, retiene agua y
minerales en sus tejidos, los cuales toma a través de sus paredes; extrae minerales del
sustrato, compite por espacio en el mismo; da forma al liquen (en la mayoria de los
casos). Sin embargo, la forma del talo liquénico no es la misma que la del hongo
aislado. Este hecho presupone que el alga también contribuye en alguna porción, al
establecimiento de la forma y estructura del liquen.
El hongo se reproduce sexualmente, aloja al alga de tal forma que tenga el óptimo de
intensidad lumínica y dispone sus hifas para que se pueda alojar adecuadamente. La
mayoría de los líquenes sin fotófilos, pero cuando se presenta iluminación excesiva el
talo se deseca para proteger el aparato fotosintético.
El alga, por su parte, sintetiza un exceso de compuestos orgánicos (especialmente
azúcares simples o monosacáridos), los cuales son utilizados por el micobionte para se
supervivencia, almacenándolos en forma de manitol no disponible para el fotobionte. El
transporte depende de la mediación de algunas sustancias segregadas por el hongo
que facilitan los procesos de difusión, que del contacto entre el micobionte y fotobionte
(VALENCIA-AGUIRRE, 2002).
Cuando el fotobionte es una cianobacteria, suministra sustancias nitrogenadas al
consorcio, ya que tiene la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico; sin embargo, sólo
utiliza una pequeña cantidad del nitrógeno fijado y el resto lo libera en forma de amonio,
para ser utilizado por el hongo para la producción de proteínas y aminoácidos. Cuando
el fotobionte es un alga verde, el suministro del nitrógeno del consorcio es de origen
exógeno y a partir de la urea, nitratos o aminoácidos. Las cianobacterias excretan
glucosa (GALUN, 1988 citado por MOORE LANDECKER, 1996; WERNER, 1992),
mientras que las algas verdes secretan poliol; igualmente proporcionan tiamina y
biotina.
Parece ser que tanto el hongo como el alga pueden obtener, en parte, sustancias
carbonatadas del sustrato, lo cual depende de la relación existente entre éste y el
liquen. Otros aportes del componente fúngico al consorcio son la regulación de las
poblaciones del fotobionte y la longevidad de las células fúngicas liquenizadas,
comparadas con la vida libre (VALENCIA-AGUIRRE, 2002; HONEGGER, 1998).
6.2.4. MORFOLOGIA Y ANATOMIA DEL TALO
Los líquenes exhiben una amplia variedad morfológica que se extiende desde los tipos
rudimentarios hasta los altamente diferenciados. Como respuesta a la unión que se
establece entre los simbiontes y el papel predominante que juega el componente
fúngico dentro de la morfogénesis (VALENCIA-AGUIRRE, 2002). La unión de los dos
simbiontes se realiza mediante un proceso complejo de liquenización, que presenta
numerosas fases, las cuales se describen a continuación en el siguiente cuadro
(MARCANO ,1994):
FASE DE PRE-CONTACTO: Estimulación por parte del alga y respuesta tigmotrófica del hongo
FASE DE CONTACTO: Reconocimiento y aglutinación.
FASE DE ENVOLTURA DEL ALGA POR EL MICOBIONTE: Desarrollo de haustorios.
FASE DE INCORPORACIÓN DE AMBOS SIMBIONTES PARA LA FORMACIÓN DE UNA MATRIZ
COMÚN: Integración. Fase soredial.
FASE DE FORMACIÓN Y DIFERENCIACIÓN DEL TALO.
TABLA 3. FASES DE FORMACION DE UN TALO. (FERRARO, INSTITUTO DE CIENCIAS BOTANICAS, 2000)
El talo puede presentar una estratificación con zonas bien delimitadas, con un estrato
algal superior y una médula formada por hifas del hongo, éstos son talos heterómeros.
Este es el tipo de arreglo más común en los líquenes. Si las algas se distribuyen entre
las células del hongo sin ninguna orden el talo es homómero. Los talos pueden ser:
1. CRUSTOSOS: con aspecto de costra, muy adheridos al sustrato, pueden ser
continuos o fragmentados en placas o areólas. El 65% de las 15.000 especies de
líquenes conocidos son crustosos.
2. FOLIOSOS: con aspecto de hojas, muy extendidos, son llamativos y es la forma
más común entre los macrolíquenes.
3. FRUTICULOSOS: son talos ramificados, erguidos o pendientes, como arbolitos
pequeños o barbas enmarañadas, muy largas.
4. GELATINOSOS: talos gruesos, quebradizos cuando se encuentran secos y muy
blandos e hinchados en presencia de agua.
5. TALOS COMBINADOS: crustoso (escamoso o microfilino) y fruticuloso (con
apotecios): podecios (Cladonia sp.) o pseudopodecios (Stereocaulon).
6.3. ASPECTOS ECOLOGICOS
6.3.1. Sustratos Liquénicos
Se definen como el soporte sobre el cual crecen líquenes. Los sustratos influyen sobre
su comportamiento de acuerdo con la textura física y la estabilidad, pH, el contenido
mineral, la composición química y la capacidad de retención de agua que ofrecen para
su establecimiento.
Dada la capacidad de colonizar una amplia variedad de sustratos, han sido ubicados en
una amplia clasificación y de uso común (VALENCIA-AGUIRRE, 2002). (ver tabla 4).
SUSTRATO TIPO
ROCAS O MINERALES SAXÍCOLAS (rupestres o rupículas)
* Epilíticos ( encima del sustrato)
*Endolíticos (dentro del sustrato)
*Calcícolas ( en rocas caliza)
*Magnícolas (en serpentina)
*Ferrugíneos ( en magnetita)
*Calcófilos (en calcopirita)
CORTEZA DE ÁRBOLES CORTÍCOLAS Ó CORTICICOLAS
*Epifleódico (encima de la corteza)
*Endofleódicos (dentro de la corteza)
SUELO TERRÍCOLAS
MADERA LIGNÍCOLAS
BRIOFITAS MUSCÍCOLAS
HOJAS EPIFILOS
*Folícolas
TABLA 4. DISTRIBUCION DE LIQUENES SEGÚN SUSTRATO. (VALENCIA, AGUIRRE, 2002)
La distribución de los líquenes en un área tiene mucho que ver con el grado de
especificidad que muestra por el sustrato. Las especies que colonizan sustratos
indiferenciados tienden a tener una amplia distribución por la mayor oferta de sustratos,
mientras que los que prefieren los específicos poseen un radio de distribución más
limitado. Por esto se observa que la distribución geográfica de un liquen esta en
relación directa con la especificidad que muestra el sustrato (BRODO, 1973).
6.3.2. Resistencia a condiciones extremas
La mayoría de los líquenes son tolerantes a iluminaciones extremas, períodos de frío
intenso o desecación casi completa, condiciones que son frecuentes en su medio
natural. Su capacidad adaptativa es la mayor y la más completa de todos los vegetales
en regiones inhóspitas, donde otro tipo de plantas no se desarrollan. Pueden soportar
durante el día temperaturas de 60°C y en la noche por debajo de 0°C. Estos rasgos de
tolerancia varían de acuerdo con el grado de adaptación a los diferentes hábitats
ecológicos (AHMADJIAN, 1966).
6.3.3. Sustancias de los líquenes
Los líquenes producen, por su actividad metabólica, varios tipos de compuestos
orgánicos, principalmente aromáticos. Entre ellos se incluyen ácidos alifáticos,
depsidonas, depsonas, ésteres bencílicos, dibenzofuranos, ácidos úsnicos, xantonas,
antraquinonas, terpenoides y derivados del ácido pulvínico. Estas sustancias juegan un
papel biológico, comenzando por aceptar que la simbiosis se relaciona con la
producción de todas estas sustancias (VALENCIA-AGUIRRE, 2002). De entre todas
estas sustancias, son los dépsidos (para y meta), las depsidonas y los ácidos úsnicos
hacia los que los liquenólogos han dirigido principalmente su atención, por tratarse de
compuestos que solo se han encontrado en los líquenes, con la salvedad de algunos
pocos que han sido descritos también en hongos no liquenizados, como el ácido
lecanórico (paradépsido), presente en Pyricularia. No obstante, se ha comprobado que
cuando estas sustancias se presentan en hongos no liquenizados lo hacen siempre en
muy bajas concentraciones. (MANRIQUE REOL, E. 1989.)
Las sustancias químicas presentes en los líquenes se localizan como componentes de
las membranas celulares en el contenido celular o en forma extracelular, como masas
amorfas o cristales, coloras o incoloras. Son insolubles en agua y solubles en solventes
orgánicos, la mayoría de sabor amargo. Las sustancias producidas por los líquenes
tienen un interés desde el punto de vista de su acción antibiótica. Estas sustancias son
activas contra una gran variedad de microorganismos, preferencialmente contra
bacterias gram-positivas y hongos.
6.3.4. Uso de los líquenes
El uso de los líquenes por parte del hombre ha sido muy variado y conocido desde
tiempos muy antiguos, con propósitos alimenticios, curativos y económicos. Las
propiedades potenciales o reales de estos organismos han permitido su utilización en
medicina en forma de extractos o cocimientos desde las antiguas cultura china y
egipcia. Existen numerosos ejemplos. Cetraria islandica, por ejemplo, es utilizada en la
medicina homeopática hoy en día para curar diferentes enfermedades, entre ellas la
tuberculosis; se sabe que su alto contenido de polisacáridos sirve para la fabricación de
harinas de fácil digestibilidad. Usnea longissima ha sido utilizada como expectorante y
para curar las úlceras al aplicarse localmente (FILHO-TOLEDO, 1976). Se sabe de la
existencia de una enorme cantidad de compuestos bioáctivos sin explorar y que pueden
estar en disposición de la industria farmacéutica para utilizar a gran escala médica y
comercial (VALENCIA-AGUIRRE, 2002).
Desde el siglo XVI los líquenes se han utilizado como materia prima en la industria de
cosméticos y perfumes. A varios ácidos liquénicos como el ácido úsnico se le ha
encontrado propiedades antibióticas, por lo que las especies Usnea se han considerado
activas en el tratamiento de enfermedades. Un buen número de líquenes son utilizados
hoy en día como base para la fabricación de cremas, shampoo, desodorantes y
pastillas. Sin embargo en vía opuesta también los productos de los líquenes son
responsables de enfermedades por contacto como dermatitis y eczemas, y otros
problemas de piel caracterizados por hinchazón y enrojecimiento. Especies del género
Cladonia se comercializan en grandes cantidades y además es aprovechada en gran
medida en la industria del perfume.
La amplia gama de actividades biológicas que se les ha atribuido a los líquenes ha
despertado el interés por la investigación de estos organismos, confirmando que
muchos de los metabolitos que producen son “agentes biodinámicas” con propiedades
antibiótica, antiviral, antitumoral, analgésica, antipirética, antiinflamatoria, antioxidante,
antiproliferativa, alelopática e inhibidora de enzimas.
Acorde a las recientes investigaciones de las actividades biológicas de las sustancias
de los líquenes se pueden dividir en:
• Actividad Antibiótica: Despidas (INGOLFSDOTTIR, 1985), depsidonas y acido
úsnico son activos contra microorganismos Gram-positivos, drogas
comercializadas en Europa de compuestos como el benzydimetil son distribuidas
como USNO contra ulceras, otitis y mastitis.
• Actividad Antitumoral y Antimutagénica: El ácido úsnico, (+)-
protoliquenesterinico presentan una actividad antitumoral y antimutagénica
considerable.
• Actividad inhibición enzimatica: Las siguientes sustancias de los líquenes
presentan una actividad de inhibición: ácido lecanorico, ácido úsnico y extractos
de la Vulpicida Juniperinus, Hypogymnia Physodes y Letharia Vulpina.
• Actividad contra el Síndrome de Inmunodeficiencia Humana (VIH): Sustancias
químicas derivadas del extracto de la Umbilicaria esculenta inhiben el efecto
citopatológico del VIH in Vitro (Hirabayashi, 1998).
• Actividad Antialergica: Numerosas sustancias de los líquenes presentan esta
actividad ellas se encuentran: la atranorina, parietrina, ácido úsnico y ácido
protoliquenesterinico.
6.3.5. Habitats de los líquenes
Los líquenes se encuentran en todos los ecosistemas y regiones de vida colombianas;
son componentes muy conspicuos de la flora. La mayor expresión la exhiben en las
regiones de la vida andina y paramuna, en lo que respecta a líquenes foliosos y
fructicosos.
La mayoría de los líquenes son terrestres, algunos se dan cerca de caídas de agua. Su
tamaño varía mucho, desde pocos milímetros hasta varios centímetros. Existe una clara
zonación florística de estos organismos a lo largo del gradiente altitudinal; los líquenes
comienzan a ser comunes a medida que se incrementa la altitud y el óptimo esta entre
3.000 y 4.000 metros. Entre 1.000 y 2.000 metros el número de especies de
Heterodermia Leptogium y Parmotrema aumentan. Por encima de los 2.000 metros en
la zona de la andina baja, media y alta, es elevada la frecuencia de los líquenes foliosos
Parmeliaceae, Stictaceae, Lobariacae y Collemataceae, siendo por lo general
dominantes (VALENCIA-AGUIRRE, 2002).
6.4. QUIMIOTAXONOMIA
6.4.1. Química de los líquenes
La quimiotaxonomia ha jugado un papel importante en la compresión de grupos que
pertenecen a las categorías taxonómicas superiores, en los líquenes se ha enfocado en
el uso taxonómico de los datos de metabolitos a los niveles de especie y subespecie.
Dentro de los compuestos liquénicos producto del metabolismo del liquen se encuentra
los llamados ácidos liquénicos y otros tipos de sustancias orgánicas. Se conoce la
constitución química de 220 metabolitos secundarios encontrados en los líquenes, los
más comunes y conocidos son la atranorina y la parietrina y los ácidos úsnico,
rizocárpico, norstíctico, thamnólico, barbárico, vulpínico, entre otros. (BARRENO 1997,
VALENCIA AGUIRRE 2002). Varios de los metabolitos anteriormente nombrados
presentan propiedades biológicas importantes con relación ha esto varios de estos
compuestos han sido estudiados para determinar su actividad antioxidante. Algunos de
los compuestos mencionados con anterioridad se muestran en la figura 1.
FIGURA1. ESTRUCTURAS DE METABOLITOS SECUNDARIOS AISLADOS DE LÍQUENES.
NEELAKANTAN (1965) presentó una importante contribución sobre la clasificación de
las sustancias liquénicas, a nivel de grupos así:
1. Serie alifática
• Grupo 1- Ácidos Carboxílicos
• Grupo 2-Derivados de carbohidratos
• Grupo 3- Compuestos sulfurados
2. Serie carbocíclica
• Grupo 1- Isoprenoides alicíclicos
• Grupo 2- Dépsidas
• Grupo 3- Quinonas
3. Serie heterocíclica oxigenada
• Grupo 1- Derivados del ácido tetrónico
• Grupo 2- Depsidonas
• Grupo 3- Depsonas
• Grupo 4- Dibenzofuranos
• Grupo 5- Xantonas
• Grupo 6- Chromonas
4. Serie heterocíclica nitrogenada
6.4.2. Test de Coloración
El test de coloración es un método rutinario, simple. Se orienta exclusivamente a
detectar microscópicamente la presencia de grupos de compuestos químicos, que se
presentan dentro de un grupo taxonómicamente dado, evidenciado por los cambios de
color (VALENCIA-AGUIRRE, 2002). El test de coloración indica la presencia o
ausencia de sustancias alifáticas y aromáticas. Rutinariamente se emplean cuatro test
de coloración para sustancias liquenicas, cuya denominación convencional es: test K,
test C, test KC y test P o PD. Los test C, K y KC fueron descubiertos por NYLANDER
(1866, citado por SANTESSON, 1973). Los test de PD o (P) fue introducido por
ASAHINA (1934). Estas pruebas se llevan a cabo aplicando el reactivo apropiado
directamente sobre un fragmento liquénico, por medio de una varilla de vidrio
puntiaguda o haciendo una incisión al talo o la apotecio. Las reacciones color obtenidas
dependen de cierta forma de la concentración y localización de las sustancias
liquenicas en el talo; la corteza o médula deben ser tratadas a parte y para su
observación es mejor hacerlo bajo estereoscopio (VALENCIA-AGUIRRE, 2002).
Los cambios de coloración (amarillo, anaranjado, rojo, violeta) se consideran positivos e
indican la presencia de un grupo de compuestos determinados; se consideran negativo
si no hay cambio de color.
• Test C: Se emplea como reactivo una solución acuosa saturada de hipoclorito de
sodio o calcio. Como sustituido puede usarse blanqueador líquido comercial. Las
reacciones de color obtenidas por este test son inestables.
• Test K: Se usa como reactivo una solución acuosa de hidróxido de potasio.
• Test KC: Es una mezcla de hipoclorito de calcio con hidróxido de potasio.
Primero se aplica K e inmediatamente C.
• Test P o PD: Se utiliza como reactivo la fenilenodiamina en una solución
alcohólica fresca al 5%. Actualmente se emplea un reactivo más estable
denominado mezcla de Steiner.
En la siguiente tabla se resume la reacciones de las pruebas de coloración de algunas
sustancias liquénicas; sin embargo sólo indica los grupos de compuestos
(SANTESSON, 1973; VALENCIA-AGUIRRE, 2002).
REACCION COMPUESTOS
Pigmentos
K+
Rojo a
violeta
Antraquinonas, Bisantraquininas, terpenilquinonas
naftoquinonas, pyxiferina
K+,KC+ Xantonas,Sordidona
K+,PD+,K+ Ácidos úsnicos
Compuestos Incoloros
PD+,K+
Despidas:ácido alectoriálico,atranorina
ácido baeomicico,ácido barbatólico
cloroatranorina,ácido descarboxithamnólico
ácido emathamnólico, nefroarctina
ácido thamnólico
Depsidonas:ácido constíctico, ácido fumar-
protocetrárico,ácido norstíctico
ácido fisodálico,ácido salazinico
ácido stictico,ácido virénsico
PD+,K-
Pannarina,ácido psorómico,ácido fumar
protocetrarico
ácido protocetrarico, ácido virensico
PD-,K+,C+
Ácido critoclorofaeíco,ácido hiascico
ácido hipomnólico (K+violeta)
ácido meroclorofaeíco,ácido paludósico
ácido ramalinolico,scrobiculina
PD-,K-,C+ Rojo
Ácido anziáico,ácido4-O-dimetilbarbático
eritrina,etilorcelinato,ácido gyrofórico
ácido lecanorico,montagnetol,ácidoolivetorico,
Siphulina.
PD-,K-,C+ Verdoso
Ácido didymico,ácido pannarico,ácido
strepsilina
PD-,K-,C+ Azuloso Ácido diploschistesico
PD-,K-,C-,KC
+
Ácido alectóronico,ácido a-collatolico
ácido glomeliférico,ácido lobárico
ácido 4-O-metilfisódico
ácido microphillinico,ácido physidico
norlobaridona,ácido picroliquénico
TABLA 5. TEST DE COLORACION (SANTENSSON, 1973)
6.4.3. Cristalización
La cristalización es el proceso de separación de un soluto a partir de una solución, por
sobresaturación, concentración o enfriamiento de la misma. La cristalización permite
separar soluto a partir de una solución, en forma prácticamente pura.
Existen varias formas de sobresaturar una solución para que esta comience a cristalizar
fracciones de soluto: por saturación de solución en caliente y posterior enfriamiento de
la misma. Por concentración de la solución, mediante la evaporación de una parte del
solvente. Por adición de una substancia de mayor solubilidad en el solvente, que el
compuesto que se desea separar. Cuanto más lento sea el enfriamiento de la solución
saturada, más grandes y puros serán los cristales del sólido que se separa.
6.4.4. Técnicas cromatográficas
Debido a la gran diversidad de técnicas cromatográficas las cuales posibilitan el
aislamiento de estos metabolitos secundarios, la cromatografía se ha convertido en la
técnica microquímica más utilizada en las determinación de muchas sustancias
liquénicas, debido a su sensibilidad, rapidez y relativa simplicidad del equipo utilizado
(VALENCIA, AGUIRRE 2002).
La palabra Cromatografía significa "Escribir en Colores" ya que cuando fue desarrollada
los componentes separados eran colorantes. Los componentes de una mezcla pueden
presentar una diferente tendencia a permanecer en cualquiera de las fases
involucradas. Mientras más veces los componentes viajen de una fase a la otra
(partición) se obtendrá una mejor separación. En todas las técnicas cromatográficas
hay una fase móvil que consiste en un fluido (gas, líquido o fluido supercrítico) que
arrastra a la muestra a través de una fase estacionaria que se trata de un sólido o un
líquido fijado en un sólido.
Los componentes de la mezcla interaccionan con distinta forma con la fase estacionaria
y con la fase móvil. De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a
distintas velocidades y se van separando (S. DOUGLAS ,1995). Después de haber
pasado los componentes por la fase estacionaria y haberse separado pasan por un
detector que genera una señal que puede depender de la concentración y del tipo de
compuesto.
La cromatografía en sus diversas modalidades constituye hoy por hoy, una de las
herramientas analíticas más potentes que se conocen. Las técnicas cromatográficas
pueden clasificarse de diversas formas:
6.4.4.1. Cromatografía en capa fina
Un importante papel es una técnica nueva, la cromatografía en capa fina, con mucha
mayor sensibilidad y capacidad resolutiva, que, aunque conocida con anterioridad, no
fue aplicada al estudio de la química de los líquenes hasta el comienzo de la década de
los setenta (CULBERSON & KRISTINSON, 1970; CULBERSON, 1972; MENLOVE,
1974, CULBERSON & AMMANN, 1979). Esta técnica permitió el descubrimiento y
caracterización de sustancias nuevas que habían pasado inadvertidas, mediante el uso
de la cromatografía en papel, quizá por problemas de solapamiento o por bajas
concentraciones.
6.4.4.2. Cromatografía en columna
La cromatografía es una técnica que se emplea en el fraccionamiento de compuestos
orgánicos. Consiste en la aplicación de una muestra en una columna de cristal en la
que se ha situado una matriz sólida porosa que está inmersa en el solvente (SKOOG,
DOUGLAS 2003). A continuación se bombea una gran cantidad de solvente a través de
la columna Los diferentes compuestos se van retrasando de manera distinta según sus
interacciones con la matriz, por lo que pueden ser recogidas separadas a medida que
son eluídas por el fondo de la columna (ver figura 2.). Según la matriz escogida, los
compuestos se pueden separar de acuerdo a su carga, su hidrofobicidad, su tamaño o
su capacidad de unirse a grupos químicos particulares.
En la cromatografía en columna se utilizan los siguientes términos:
Matriz de la columna: Sustancia que está empapada de solvente y que se empaqueta
en la columna. También se denomina el lecho de la columna.
Longitud de la columna: Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna. Es
importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco
importante en otras como la cromatografía de afinidad.
Volumen de la columna: Volumen total de gel que se empaqueta en una columna
cromatográfica.
Volumen muerto de la columna: Cantidad de solvente que tiene que atravesar la
columna para asegurar que se ha reemplazado completamente. Coincide con el
volumen de solvente que sale de la columna desde que se aplica la muestra hasta que
empieza a salir la primera proteína. En general, y dependiendo del tipo de
cromatografía puede ser de 1 a varias veces el volumen de la columna (SKOOG,
DOUGLAS 2003).
FIGURA 2. CROMATOGRAFIA EN COLUMNA. (SKOOG, DOUGLAS 2003).
De las muchas variantes que se conocen en la actualidad, son de particular importancia
en este trabajo la cromatografía en placa preparativa, cromatografía bidimensional (ver
figura 3) y cromatografía flash de mediana presión. Todas estas técnicas conservan el
mismo principio de elución, pero su utilización depende tanto de la naturaleza de la
muestra como de las posibles variantes que se presenten a lo largo del proceso.
FIGURA 3. CROMATOGRAFIA EN PLACA BIDIMENSIONAL. (SKOOG, DOUGLAS 2003).
6.4.5. Técnicas espectroscópicas
La caracterización y la elucidación estructural de los metabolitos secundarios aislados
de la especie de liquen seleccionada se realiza mediante la determinación de sus
propiedades físicas color, apariencia, puntos de fusión, datos espectroscópicos (RMN
1
H, RMN 13
C).
6.4.5.1. Espectroscopía infrarroja (Espectroscopía IR)
Es la rama de la espectroscopía que trata con la parte infrarroja del espectro
electromagnético. Esta cubre un conjunto de técnicas, siendo la más común una forma
de espectroscopía de absorción. Así como otras técnicas espectroscópicas, puede
usarse para identificar un compuesto e investigar la composición de una muestra.
Para medir una muestra, un rayo de luz infrarroja atraviesa la muestra, y se registra la
cantidad de energía absorbida en cada longitud de onda. Esto puede lograrse
escaneando el espectro con un rayo monocromático, el cual cambia de longitud de
onda a través del tiempo, o usando una transformada de Fourier para medir todas las
longitudes de onda a la vez. A partir de esto, se puede trazar un espectro de
transmitancia o absorbancia, el cual muestra a cuales longitudes de onda la muestra
absorbe el IR, y permite una interpretación de cuales enlaces están presentes. (GROS,
POMILIO, SELDES, BURTON 1985).
Esta técnica funciona exclusivamente con enlaces covalentes, y como tal es de gran
utilidad en química orgánica. Espectros nítidos se obtienen de muestras con pocos
enlaces activos al IR y altos niveles de pureza. Estructuras moleculares más complejas
llevan a más bandas de absorción y a un espectro más complejo. Sin embargo esta
técnica no se ha podido utilizar para la caracterización de mezclas muy complejas.
6.4.5.2. Espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN)
Es una técnica empleada principalmente en la elucidación de estructuras moleculares,
aunque también se puede emplear con fines cuantitativos.
Algunos núcleos atómicos sometidos a un campo magnético externo absorben
radiación electromagnética en la región de las frecuencias de radio o radiofrecuencias.
Como la frecuencia exacta de esta absorción depende del entorno de estos núcleos, se
puede emplear para determinar la estructura de la molécula en donde se encuentran
éstos.
Para que se pueda emplear la técnica los núcleos deben tener un momento magnético
distinto de cero. Esta condición no la cumplen los núcleos con número másico y número
atómico par. Los núcleos más importantes en química orgánica son: ¹H, 13
C, 31
P, 19
F y
15
N. Otros núcleos importantes: 29
Si, 77
Se, 117
Sn, 195
Pt, 199
Hg, 203
Tl, 205
Tl, 207
Pb.
6.4.5.3. Espectroscopia Ultravioleta
El espectro Ultravioleta y Visible de las moléculas está asociado a transiciones
electrónicas entre los diferentes niveles energéticos en ciertos grupos o átomos de la
molécula y no caracterizan a la molécula como entidad.
En contraste la absorción de energía en la región Infrarroja estimulan la molécula
completa y causa cambios vibracionales y rotacionales en esta lo cual caracteriza la
entidad estructural de dicha molécula.
Los grupos de átomos que dan origen a la absorción en el UV cercano o UV de cuarzo,
se conocen como grupos cromóforos. La mayoría de los grupos insaturados y
heteroatómicos que tienen pares de electrones no compartidos, son cromóforos
potenciales y estos grupos son la base de la elucidación de grupos estructurales en las
moléculas activas en el UV cercano.
El espectro Ultravioleta de una molécula se obtiene generalmente en forma adicional al
espectro infrarrojo de la misma especie. Este espectro IR frecuentemente sirve como
dato confirmativo de la ausencia o presencia de ciertos grupos funcionales.
En algunos casos la espectroscopia UV puede ser fundamental para el estudio de
ciertos problemas específicos. Por ejemplo en la industria de los cosméticos, tintes,
colorantes y pinturas. El estudio de los grupos auxocromos y de su influencia en el
desplazamiento de ciertos compuestos químicos hacia la región visible hacen de esta
técnica una de las de mayor interés en ésta área. (SKOOG, D. A.; LEARY J.J. HOLLER
F. JAMES)
6.5. TECNICAS DE COLECCIÓN Y ESTUDIO
Para coleccionar líquenes se deben tener en cuenta las siguientes recomendaciones.
6.5.1. Materiales
Bolsas de papel, bolsas plásticas, navaja o cuchillo, martillo geológico, cincel, marcador
a prueba de agua, lupa de campo, libreta de notas, lápiz, reactivos.
6.5.2. Datos de campo
• Localidad: país, departamento, estado, provincia, vereda, finca, kilometraje a la
localidad mas cercana, coordenadas geográficas.
• Hábitat: descripción breve del tipo de bosque (primario, secundario), talud del
camino; potrero; condiciones ambientales circundantes, iluminación, humedad.
• Sustrato: suelo (tipo si es posible), roca, corteza, hojas (en lo posible el nombre
científico y/o vulgar del árbol), parte del árbol.
• Altitud: sobre el nivel del mar o en forma aproximada cuando no se conoce.
• Fecha: durante la cual se realizó la colección; especificar día, mes y año.
• Colector y número de colección: Nombre y apellido del colector o colectores, y el
número de colección.
Los datos anteriores se deben consignar en una libreta de notas para cada espécimen
coleccionado.
6.5.3. Colecta
Para colectar un ejemplar liquénico se deben tener en cuenta ciertas condiciones
inherentes a cada tipo de liquen: los crustáceos por su unión tan íntima con el sustrato
deben retirarse con un fragmento de éste y usar para ello una navaja o cuchillo; cuando
se trata de líquenes epilíticos o endolíticos se recomienda utilizar un martillo geológico.
Los líquenes se buscan sobre las rocas, en el suelo, en el talud de los caminos, sobre
troncos caídos, en las cercas. En el interior de los bosques se recomienda recorrer
cuidadosamente todas las partes del árbol (las cortezas, las ramas, el dosel). Para
buscar y colectar líquenes gelatinosos es mejor hacerlo después de la lluvia, por cuanto
en estado seco son inconspicuos y pueden pasar desapercibidos.
Se debe tener precaución con los líquenes foliosos muy secos, puesto que se puede
fracturar fácilmente; en estos casos, es mejor humedecerlos un poco o hacer la colecta
cuando el ambiente esté más húmedo.
Los ejemplares se toman en bolsas plásticas y se marcan con el número de colección
correspondiente. La muestra debe ser suficiente y en buen estado; se debe tomar una
buena cantidad que llene una bolsa, excepto cuando la población es pequeña; en lo
posible debe ser material fértil; no obstante, el material estéril no se debe desechar.
Posteriormente las muestras se pasan a bolsas de papel y en ellas se secan a baja
temperatura en la estufa o en el aire. No necesitan prensarse. Cuando las condiciones
ambientales son favorables, se puede coleccionar directamente en bolsas de papel.
Una vez el material esté seco, se puede guardar indefinidamente como material de
estudio docente o seguir el proceso habitual para su inclusión en el herbario. Cuando se
necesita hacer un estudio microscópico en el laboratorio, se coloca fragmentos de la
muestra (cuadrados de 0.5 – 1 cm de lado), apotecios enteros o seccionados (si son
grandes) en frascos con FFA (formol, ácido acético, alcohol) o con FPA (formol, ácido
propiónico, alcohol).
6.5.4. Estudio del material en el laboratorio
Los ejemplares deshidratados y debidamente preservados se pueden utilizar en el
laboratorio y seguir las técnicas pertinentes para las cuales se efectúo la colección. En
términos generales se puede humedecer parcial o totalmente la muestra; en este caso,
se debe ser muy cuidadoso con el material de donde se tomo la porción, para evitar que
otros organismos la contaminen y no pueda volverse a utilizar.
Los especimenes requeridos en estudios taxonómicos se tratan de manera muy
especial, no así aquellos utilizados en la docencia, que pueden ser fragmentados o
reutilizados para este propósito. Si se necesita hacer observaciones anatómicas del
talo, se realizan cortes transversales a mano alzada, usando pauche como soporte. Los
cortes más delgados se escogen para observaciones en el montaje húmedo.
Para detectar mejor sus constituyentes, el corte delgado de la muestra se coloca en una
solución acuosa de hipoclorito al 0.2-0.5 %; esta sustancia actúa como aclarante y
permite visualizar la coloración de las algas y la orientación de las hifas.
Para realizar los tests de coloración tenga en cuenta las precauciones de preparación y
el manejo de reactivos. (VALENCIA, AGUIRRE 2002).
7. CAPITULO III
7.1. METODOLOGIA
La metodología utilizada se muestra en la figura 4. Se explicara a continuación cada
uno de los pasos empleados.Colecta y selección
de la muestra
Extracción (método
Soxhlet)
Elución del extracto primario
crudo en cromatografía en
columna (CC)
Aislamiento de
compuestos por
polaridad
Clasificación y separación de
compuestos en cromatografía
en placa (CP)
Purificación de
compuestos
(CC y CP)
Elucidación estructural
de compuestos (RMN, IR,
UV, MP, EM)
Prueba de actividad
antioxidante
(método DPPHo
) de
extracto.
Ensayo de actividad
antioxidante (CP)
compuestos impuros.
Test de
coloración.
FIGURA 4. ESQUEMA DE LA METODOLOGIA EMPLEADA.
7.1.1. Colecta y Selección del Liquen
Se seleccionó una especie de Liquen perteneciente a la familia Parmotrema a la que
no se le ha designado la especie. Con la colaboración de la Dra. Norma Valencia Islas
perteneciente al Departamento de Farmacia. Facultad de Ciencias. Universidad
Nacional de Colombia. Así mismo, en el Instituto de Ciencias Naturales de la
Universidad Nacional de Colombia se depositará un vaucher de referencia de la especie
analizada.
La cantidad recolectada de la especie fue de 300.7 g. El material liquénico
completamente seco y limpio se trituró en un molino de cuchillas, obteniendo como
peso neto 228.3 g; para que posteriormente se obtengan extractos orgánicos mediante
un proceso de extracción continua vía Soxhlet en metanol.
7.1.2. Método de extracción
Este tipo de extracción se realiza habitualmente en un aparato denominado Soxhlet.
FIGURA 5. METODO SOXHLET. (SKOOG, DOUGLAS, 2003)
La muestra (LQ) sólida se introdujo en un cartucho poroso (hecho con papel de filtro,
que permite al solvente entrar y salir reteniendo al sólido) el cual se colocó dentro del
recipiente B (ver figura 5). Se une un balón C a dicho recipiente donde se adicionó el
volumen de solvente (250 ml de metanol). Por el extremo superior del recipiente B, se
coloca un condensador D.
El solvente se calienta; los vapores ascienden por el tubo E, condensan en el
refrigerante D y caen dentro del recipiente B impregnando el líquen que se encuentra
en el cartucho A. El recipiente B se va llenando lentamente de líquido hasta que llega al
tope del tubo F y se descarga dentro del balón C por efecto de sifón, llevando consigo a
la sustancia extraída. El proceso se repitió hasta que la extracción se completa. El
solvente de extracción se evapora, recuperando así el extracto.
Se hicieron 3 (tres) montajes con el fin de acelerar el proceso, con lo cual cada montaje
tuvo un tiempo en el soxhlet, hasta el momento en el que se vio claro el solvente
mezclado con el liquen.
7.1.3. Elución del extracto primario crudo en cromatografía en columna (CC)
8. CAPITULO IV
8.1. RESULTADOS
El Estudio Fitoquímico y Fisicoquímico de Actividad Antioxidante frente al Radical Libre
2,2-difenil-1-picrilhidracilo a nivel de Extracto, se realizo durante un periodo de seis
meses, los resultados obtenidos por los integrantes se reportan a continuación:
8.1.1. Estudio Taxonómico
Gracias a la colaboración del Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional
de Colombia, se determino que el liquen estudiado presenta la siguiente clasificación
taxonómica, según la tabla…. :
REIN
O FILO CLASE ORDEN FAMILIA
GÉNER
O ESPECIE
FUNGI
Ascomycot
a
Lecanoromycete
s
Lecanorale
s
Parmeliacea
e Rimelia Cetrata
Tabla . Clasificación Taxonómica del LQ Rimelia Cetrata
Debido a esto, el género y la especie del líquen estudiado es:
RIMELIA CETRATA (syn PARMOTREMA CETRATUM)
Figura. LQ Rimelia Cetrata Figura. LQ Rimelia Cetrata parte posterior
8.1.2. Colecta y Selección del Líquen
Se colectaron dos clases de material vegetal, la especie analizada (Rimelia Cetrata) y
un líquen de género desconocido al que llamaremos Líquen 2 (LQ 2). La cantidad
recolectada del líquen Rimelia Cetrata fue de 300.7 g y del líquen 2 fue de 61.2 g peso
en bruto, después de la respectiva limpieza y molienda se obtuvo 228.3 g del líquen
Rimelia Cetrata y 36.6 g de líquen 2. Los datos anteriormente descritos se observan en
la tabla….; a continuación:
Tabla . Peso en Gramos de Material Vegetal obtenido
8.1.3. Extracción
El método de extracción utilizado fue Soxhlet en metanol, en la tabla…. se observa el
número de extracciones, el tiempo transcurrido, junto con los respectivos intervalos de
cada material vegetal, hasta la extracción completa.
LIQUEN (LQ)
MASA DEL LQ FRESCO (g) MASA DEL LQ SECO
Y LIMPIO (g)
Rimelia Cetrata 300.7 228.3
2 61.2 36.6
LIQUEN
No DE
EXTRACCIONES DISOLVENTE TIEMPO(H)
INTERVALOS DE
TIEMPO
Rimelia
Cetrata
1 Metanol 10 2
2 Metanol 12 1
3 Metanol 11 1
4 Metanol 8 1
2 1 Metanol 8 2
Tabla . Tiempo de Líquenes Rimelia Cetrata y LQ 2 en el Sistema Soxlher
LIQUEN No DE
MONTAJES
TIEMPO(HORAS)
Rimelia
Cetrata
1 8
2 4 42
Tabla. Tiempo de Líquenes en el Método Soxlher
Al finalizar la extracción de cada uno de los líquenes se obtuvo los siguientes
resultados, en la tabla….. , se observa la cantidad en gramos colectada de cada líquen,
posteriormente la cantidad de material vegetal seco, limpio y molido; y por último de la
cantidad obtenida de extracto en bruto; se separo 2.5 g con sequedad total de extracto
del líquen Rimelia Cetrata para actividad biológica, por diferencia se obtuvo 45 g de
extracto en bruto del líquen Rimelia Cetrata.
Tabla. Cantidades Obtenidas del LQ Rimelia Cetrata y LQ 2.
LIQUEN
CANTIDAD
DEL LQ
FRESCO
(g)
CANTIDAD
DEL LQ
SECO Y
LIMPIO (g)
CANTIDAD
DEL
EXTRACT
O EN
BRUTO (g)
CANTIDAD
DEL
EXTRACTO
EN BRUTA
PARA CC
(g)
CANTIDAD
DEL
EXTRACTO
EN BRUTO
PARA
ACTIVIDAD
BIOLOGICA
(g)
Rimelia
Cetrata
300.7 228.3 48.583 45 2.5
2 61.2 36.6 6.656
0.216
8.1.4. Aislamiento de Metabolitos Secundarios del LQ Rimelia Cetrata
8.1.4.1 Elución del Fraccionamiento Primario del Extracto en Crudo del
Líquen Rimelia Cetrata
SISTEMA PROPORCION
%
FRACCIONES
Hexano 100 1-9
Hexano-
Tolueno
50-50 10-16
Tolueno 100 17-21
Tolueno-
Acetato de
Etilo
50-50 22-39
Acetato de
Etilo
100 40-49
Acetato de
Etilo-Metanol
50-50 50-54
Metanol 100 55-66
Tabla . Elución Del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo del LQ Rimelia Cetrata
Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata
Sistema Hexano
Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata
Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata
Sistema Metanol
Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata
FRACCIONES
COBINADAS
CLAVE
1-10 A
11-15 B
16-18 C
19-22 D
23-37 E
38-46 F
47-54 G
55-60 H
61-66 I
Tabla. Clave De Elución Del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo del LQ Rimelia Cetrata
FRACCION FRACCION
COMBINADA
PESO
DEL
VIAL
VACIO
(g)
PESO DEL
VIAL CON
MUESTRA
(g)
PESO DE LA
FRACCION(mg)
ORDEN DE
LAS
FRACCIONES
DE INTERES
A 1-10 5.954 6.030 76 |
B 11-15 5.640 5.942 302
C 16-18 5.677 6.307 63
D 19-22 49.175 51.976 2801
E 23-37 51.915 54.279 2364
F 38-46 5.623 7.561 1938
G(ℓ) 47-54 5.392 6.467 1075
G(s) 47-54 28.180 28.652 472
H 55-60 86.49 88.611 2121
I(ℓ) 61-66 137.08 143.353 6271
I(s) 61-66 41.588 45.601 4013
Tabla. Masas del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata
avance de tesis liquenes

Más contenido relacionado

La actualidad más candente

Balotario de quimica inorganica seccion 1 y 2
Balotario de quimica inorganica seccion 1 y 2Balotario de quimica inorganica seccion 1 y 2
Balotario de quimica inorganica seccion 1 y 2Liset Ramírez Díaz
 
Practica n° 03
Practica n° 03Practica n° 03
Practica n° 03dopeca
 
02 DesmineralizacióN 2009
02 DesmineralizacióN 200902 DesmineralizacióN 2009
02 DesmineralizacióN 2009Miguel Neira
 
Reporte de Práctica-Síntesis y Propiedades del Cloruro de Terc-butilo.
Reporte de Práctica-Síntesis y Propiedades del Cloruro de Terc-butilo.Reporte de Práctica-Síntesis y Propiedades del Cloruro de Terc-butilo.
Reporte de Práctica-Síntesis y Propiedades del Cloruro de Terc-butilo.Irvin de Jesús Rodríguez Martínez
 
Sobre los estudios fitoquímicos. El caso de Morinda panamensis.
Sobre los estudios fitoquímicos. El caso de Morinda panamensis.Sobre los estudios fitoquímicos. El caso de Morinda panamensis.
Sobre los estudios fitoquímicos. El caso de Morinda panamensis.loreshares
 
metodos de extraccion de alcaloides
metodos de extraccion de alcaloidesmetodos de extraccion de alcaloides
metodos de extraccion de alcaloidesadn estela martin
 
Minerales visita a museos virtuales
Minerales visita a museos virtualesMinerales visita a museos virtuales
Minerales visita a museos virtualesScar Hdz
 
clasificacion de metodos de separacion
 clasificacion de metodos de separacion clasificacion de metodos de separacion
clasificacion de metodos de separacionsergio cardenas
 
Postlaboratorio práctica 2
Postlaboratorio práctica 2Postlaboratorio práctica 2
Postlaboratorio práctica 2Angie Marín
 
84604185 laboratorio-de-sintesis-organica
84604185 laboratorio-de-sintesis-organica84604185 laboratorio-de-sintesis-organica
84604185 laboratorio-de-sintesis-organicarosario_caez
 
Informe 3 de analisis quimico terminado finish finish
Informe 3 de analisis quimico terminado finish finishInforme 3 de analisis quimico terminado finish finish
Informe 3 de analisis quimico terminado finish finishisaacquilla
 

La actualidad más candente (20)

Balotario de quimica inorganica
Balotario de quimica inorganicaBalotario de quimica inorganica
Balotario de quimica inorganica
 
Balotario de quimica inorganica seccion 1 y 2
Balotario de quimica inorganica seccion 1 y 2Balotario de quimica inorganica seccion 1 y 2
Balotario de quimica inorganica seccion 1 y 2
 
Práctica n 10
Práctica n 10Práctica n 10
Práctica n 10
 
Practica n° 03
Practica n° 03Practica n° 03
Practica n° 03
 
02 DesmineralizacióN 2009
02 DesmineralizacióN 200902 DesmineralizacióN 2009
02 DesmineralizacióN 2009
 
Alcaloides exposicion
Alcaloides exposicionAlcaloides exposicion
Alcaloides exposicion
 
Seminario 3
Seminario 3Seminario 3
Seminario 3
 
Obtencion yodoformo
Obtencion yodoformoObtencion yodoformo
Obtencion yodoformo
 
Reporte de Práctica-Síntesis y Propiedades del Cloruro de Terc-butilo.
Reporte de Práctica-Síntesis y Propiedades del Cloruro de Terc-butilo.Reporte de Práctica-Síntesis y Propiedades del Cloruro de Terc-butilo.
Reporte de Práctica-Síntesis y Propiedades del Cloruro de Terc-butilo.
 
Sobre los estudios fitoquímicos. El caso de Morinda panamensis.
Sobre los estudios fitoquímicos. El caso de Morinda panamensis.Sobre los estudios fitoquímicos. El caso de Morinda panamensis.
Sobre los estudios fitoquímicos. El caso de Morinda panamensis.
 
metodos de extraccion de alcaloides
metodos de extraccion de alcaloidesmetodos de extraccion de alcaloides
metodos de extraccion de alcaloides
 
GUIA
GUIAGUIA
GUIA
 
Reporte de Práctica-Síntesis de Butanona.
Reporte de Práctica-Síntesis de Butanona.Reporte de Práctica-Síntesis de Butanona.
Reporte de Práctica-Síntesis de Butanona.
 
Minerales visita a museos virtuales
Minerales visita a museos virtualesMinerales visita a museos virtuales
Minerales visita a museos virtuales
 
clasificacion de metodos de separacion
 clasificacion de metodos de separacion clasificacion de metodos de separacion
clasificacion de metodos de separacion
 
Química organica i
Química organica iQuímica organica i
Química organica i
 
Postlaboratorio práctica 2
Postlaboratorio práctica 2Postlaboratorio práctica 2
Postlaboratorio práctica 2
 
84604185 laboratorio-de-sintesis-organica
84604185 laboratorio-de-sintesis-organica84604185 laboratorio-de-sintesis-organica
84604185 laboratorio-de-sintesis-organica
 
Reporte de Práctica-Síntesis del Naranja de Metilo.
Reporte de Práctica-Síntesis del Naranja de Metilo.Reporte de Práctica-Síntesis del Naranja de Metilo.
Reporte de Práctica-Síntesis del Naranja de Metilo.
 
Informe 3 de analisis quimico terminado finish finish
Informe 3 de analisis quimico terminado finish finishInforme 3 de analisis quimico terminado finish finish
Informe 3 de analisis quimico terminado finish finish
 

Similar a avance de tesis liquenes

Comportamiento electroquímico de polímeros caiónicos en interfaces líquidolíq...
Comportamiento electroquímico de polímeros caiónicos en interfaces líquidolíq...Comportamiento electroquímico de polímeros caiónicos en interfaces líquidolíq...
Comportamiento electroquímico de polímeros caiónicos en interfaces líquidolíq...JulietaSoledadRiva
 
Sustentacion Definitiva
Sustentacion DefinitivaSustentacion Definitiva
Sustentacion Definitivaruampi
 
Colorantes azoicos
Colorantes azoicosColorantes azoicos
Colorantes azoicosISAANFELL
 
Presentación en Power Point para defensa de tesis de Ingeniería Química Uni...
Presentación en Power Point para defensa de tesis de Ingeniería Química Uni...Presentación en Power Point para defensa de tesis de Ingeniería Química Uni...
Presentación en Power Point para defensa de tesis de Ingeniería Química Uni...Argenis Macea
 
Taller 6º métodos de separación
Taller 6º métodos de separaciónTaller 6º métodos de separación
Taller 6º métodos de separaciónPiedad
 
Universidad técnica de ambato
Universidad técnica de ambatoUniversidad técnica de ambato
Universidad técnica de ambatoDiego796
 
Cuadro de ecas
Cuadro de ecasCuadro de ecas
Cuadro de ecasC4rlito2
 
Colorantes azoicos
Colorantes azoicosColorantes azoicos
Colorantes azoicosISAANFELL
 
Colorantes azoicos
Colorantes azoicosColorantes azoicos
Colorantes azoicosISAANFELL
 
03 guia ciencias3 sep2013
03 guia ciencias3 sep201303 guia ciencias3 sep2013
03 guia ciencias3 sep2013Rakell Gonzalez
 
Sintesis y separación_de_tetrahidropirazolo
Sintesis y separación_de_tetrahidropirazoloSintesis y separación_de_tetrahidropirazolo
Sintesis y separación_de_tetrahidropirazoloRenesteban Forero Franco
 
Analisis de la bioquimica Universitaria.pptx
Analisis de la bioquimica Universitaria.pptxAnalisis de la bioquimica Universitaria.pptx
Analisis de la bioquimica Universitaria.pptxCarlosBravoGonzales1
 
Quimica organica carey 6edi
Quimica organica   carey 6ediQuimica organica   carey 6edi
Quimica organica carey 6ediLuis MayoPra
 
Química orgánica, 6ta Edición – Francis A. Carey
Química orgánica, 6ta Edición – Francis A. CareyQuímica orgánica, 6ta Edición – Francis A. Carey
Química orgánica, 6ta Edición – Francis A. CareyPaReJaiiZz
 

Similar a avance de tesis liquenes (20)

Comportamiento electroquímico de polímeros caiónicos en interfaces líquidolíq...
Comportamiento electroquímico de polímeros caiónicos en interfaces líquidolíq...Comportamiento electroquímico de polímeros caiónicos en interfaces líquidolíq...
Comportamiento electroquímico de polímeros caiónicos en interfaces líquidolíq...
 
Cloruro (spinreact)
Cloruro (spinreact)Cloruro (spinreact)
Cloruro (spinreact)
 
Sustentacion Definitiva
Sustentacion DefinitivaSustentacion Definitiva
Sustentacion Definitiva
 
Colorantes azoicos
Colorantes azoicosColorantes azoicos
Colorantes azoicos
 
Presentación tesis
Presentación tesisPresentación tesis
Presentación tesis
 
Presentación en Power Point para defensa de tesis de Ingeniería Química Uni...
Presentación en Power Point para defensa de tesis de Ingeniería Química Uni...Presentación en Power Point para defensa de tesis de Ingeniería Química Uni...
Presentación en Power Point para defensa de tesis de Ingeniería Química Uni...
 
Tesis digestión anaerobia
Tesis digestión anaerobiaTesis digestión anaerobia
Tesis digestión anaerobia
 
Oxitocinas
OxitocinasOxitocinas
Oxitocinas
 
Taller 6º métodos de separación
Taller 6º métodos de separaciónTaller 6º métodos de separación
Taller 6º métodos de separación
 
Compuestos corona
Compuestos coronaCompuestos corona
Compuestos corona
 
Universidad técnica de ambato
Universidad técnica de ambatoUniversidad técnica de ambato
Universidad técnica de ambato
 
Cuadro de ecas
Cuadro de ecasCuadro de ecas
Cuadro de ecas
 
Colorantes azoicos
Colorantes azoicosColorantes azoicos
Colorantes azoicos
 
Colorantes azoicos
Colorantes azoicosColorantes azoicos
Colorantes azoicos
 
03 guia ciencias3 sep2013
03 guia ciencias3 sep201303 guia ciencias3 sep2013
03 guia ciencias3 sep2013
 
Sintesis y separación_de_tetrahidropirazolo
Sintesis y separación_de_tetrahidropirazoloSintesis y separación_de_tetrahidropirazolo
Sintesis y separación_de_tetrahidropirazolo
 
Guia de quimica organica
Guia de quimica organicaGuia de quimica organica
Guia de quimica organica
 
Analisis de la bioquimica Universitaria.pptx
Analisis de la bioquimica Universitaria.pptxAnalisis de la bioquimica Universitaria.pptx
Analisis de la bioquimica Universitaria.pptx
 
Quimica organica carey 6edi
Quimica organica   carey 6ediQuimica organica   carey 6edi
Quimica organica carey 6edi
 
Química orgánica, 6ta Edición – Francis A. Carey
Química orgánica, 6ta Edición – Francis A. CareyQuímica orgánica, 6ta Edición – Francis A. Carey
Química orgánica, 6ta Edición – Francis A. Carey
 

Más de jpabon1985

Lineamientos olimpiadas virtuales (1)
Lineamientos olimpiadas virtuales (1)Lineamientos olimpiadas virtuales (1)
Lineamientos olimpiadas virtuales (1)jpabon1985
 
Circular olimpiadas virtuales (1)
Circular olimpiadas virtuales (1)Circular olimpiadas virtuales (1)
Circular olimpiadas virtuales (1)jpabon1985
 
Taller bioquimica
Taller bioquimicaTaller bioquimica
Taller bioquimicajpabon1985
 
Biologia. respiracion celular
Biologia. respiracion celularBiologia. respiracion celular
Biologia. respiracion celularjpabon1985
 
Reacciones quimicas
Reacciones quimicasReacciones quimicas
Reacciones quimicasjpabon1985
 
Ejer formulacion once
Ejer formulacion  onceEjer formulacion  once
Ejer formulacion oncejpabon1985
 
Problemas estequiometria
Problemas estequiometriaProblemas estequiometria
Problemas estequiometriajpabon1985
 
Ejercicios estequiometria
Ejercicios estequiometriaEjercicios estequiometria
Ejercicios estequiometriajpabon1985
 
Fq1 bach estequiomet
Fq1 bach estequiometFq1 bach estequiomet
Fq1 bach estequiometjpabon1985
 
Guia reacciones-quimicas-y-balanceo-por-tanteo
Guia reacciones-quimicas-y-balanceo-por-tanteoGuia reacciones-quimicas-y-balanceo-por-tanteo
Guia reacciones-quimicas-y-balanceo-por-tanteojpabon1985
 
Cien 9 b2_p4_est_web
Cien 9 b2_p4_est_webCien 9 b2_p4_est_web
Cien 9 b2_p4_est_webjpabon1985
 
Problemas de-genc3a9tica-mendeliana
Problemas de-genc3a9tica-mendelianaProblemas de-genc3a9tica-mendeliana
Problemas de-genc3a9tica-mendelianajpabon1985
 
Guia de ph y poh
Guia de ph y pohGuia de ph y poh
Guia de ph y pohjpabon1985
 
Taller de octavo
Taller de octavoTaller de octavo
Taller de octavojpabon1985
 
Recuperacion octavo4
Recuperacion octavo4Recuperacion octavo4
Recuperacion octavo4jpabon1985
 
Quimica organica
Quimica organicaQuimica organica
Quimica organicajpabon1985
 
Ejercicios acido base
Ejercicios acido baseEjercicios acido base
Ejercicios acido basejpabon1985
 
Equilibrio q uimico
Equilibrio q uimicoEquilibrio q uimico
Equilibrio q uimicojpabon1985
 

Más de jpabon1985 (20)

Lineamientos olimpiadas virtuales (1)
Lineamientos olimpiadas virtuales (1)Lineamientos olimpiadas virtuales (1)
Lineamientos olimpiadas virtuales (1)
 
Circular olimpiadas virtuales (1)
Circular olimpiadas virtuales (1)Circular olimpiadas virtuales (1)
Circular olimpiadas virtuales (1)
 
Taller bioquimica
Taller bioquimicaTaller bioquimica
Taller bioquimica
 
Biologia. respiracion celular
Biologia. respiracion celularBiologia. respiracion celular
Biologia. respiracion celular
 
Reacciones quimicas
Reacciones quimicasReacciones quimicas
Reacciones quimicas
 
Ejer formulacion once
Ejer formulacion  onceEjer formulacion  once
Ejer formulacion once
 
Problemas estequiometria
Problemas estequiometriaProblemas estequiometria
Problemas estequiometria
 
Ejercicios estequiometria
Ejercicios estequiometriaEjercicios estequiometria
Ejercicios estequiometria
 
Fq1 bach estequiomet
Fq1 bach estequiometFq1 bach estequiomet
Fq1 bach estequiomet
 
Quimica mol
Quimica molQuimica mol
Quimica mol
 
Guia reacciones-quimicas-y-balanceo-por-tanteo
Guia reacciones-quimicas-y-balanceo-por-tanteoGuia reacciones-quimicas-y-balanceo-por-tanteo
Guia reacciones-quimicas-y-balanceo-por-tanteo
 
Cien 9 b2_p4_est_web
Cien 9 b2_p4_est_webCien 9 b2_p4_est_web
Cien 9 b2_p4_est_web
 
Problemas de-genc3a9tica-mendeliana
Problemas de-genc3a9tica-mendelianaProblemas de-genc3a9tica-mendeliana
Problemas de-genc3a9tica-mendeliana
 
Mendel
MendelMendel
Mendel
 
Guia de ph y poh
Guia de ph y pohGuia de ph y poh
Guia de ph y poh
 
Taller de octavo
Taller de octavoTaller de octavo
Taller de octavo
 
Recuperacion octavo4
Recuperacion octavo4Recuperacion octavo4
Recuperacion octavo4
 
Quimica organica
Quimica organicaQuimica organica
Quimica organica
 
Ejercicios acido base
Ejercicios acido baseEjercicios acido base
Ejercicios acido base
 
Equilibrio q uimico
Equilibrio q uimicoEquilibrio q uimico
Equilibrio q uimico
 

Último

Presentacionde Prueba 2024 dsdasdasdsadsadsadsadasdasdsadsa
Presentacionde Prueba 2024 dsdasdasdsadsadsadsadasdasdsadsaPresentacionde Prueba 2024 dsdasdasdsadsadsadsadasdasdsadsa
Presentacionde Prueba 2024 dsdasdasdsadsadsadsadasdasdsadsaFarid Abud
 
Salvando mi mundo , mi comunidad , y mi entorno
Salvando mi mundo , mi comunidad  , y mi entornoSalvando mi mundo , mi comunidad  , y mi entorno
Salvando mi mundo , mi comunidad , y mi entornoday561sol
 
TALLER_DE_ORALIDAD_LECTURA_ESCRITURA_Y.pptx
TALLER_DE_ORALIDAD_LECTURA_ESCRITURA_Y.pptxTALLER_DE_ORALIDAD_LECTURA_ESCRITURA_Y.pptx
TALLER_DE_ORALIDAD_LECTURA_ESCRITURA_Y.pptxMartaChaparro1
 
Revista Apuntes de Historia. Abril 2024.pdf
Revista Apuntes de Historia. Abril 2024.pdfRevista Apuntes de Historia. Abril 2024.pdf
Revista Apuntes de Historia. Abril 2024.pdfapunteshistoriamarmo
 
Si cuidamos el mundo, tendremos un mundo mejor.
Si cuidamos el mundo, tendremos un mundo mejor.Si cuidamos el mundo, tendremos un mundo mejor.
Si cuidamos el mundo, tendremos un mundo mejor.monthuerta17
 
Apunte de clase Pisos y Revestimientos 2
Apunte de clase Pisos y Revestimientos 2Apunte de clase Pisos y Revestimientos 2
Apunte de clase Pisos y Revestimientos 2Gonella
 
Biografía del General Eloy Alfaro Delgado
Biografía del General Eloy Alfaro DelgadoBiografía del General Eloy Alfaro Delgado
Biografía del General Eloy Alfaro DelgadoJosé Luis Palma
 
La-cosmovision-del-curriculo-educativo-en-Venezuela (1).pptx
La-cosmovision-del-curriculo-educativo-en-Venezuela (1).pptxLa-cosmovision-del-curriculo-educativo-en-Venezuela (1).pptx
La-cosmovision-del-curriculo-educativo-en-Venezuela (1).pptxMAURICIO329243
 
Buenas Practicas de Manufactura para Industria Farmaceutica
Buenas Practicas de Manufactura para Industria FarmaceuticaBuenas Practicas de Manufactura para Industria Farmaceutica
Buenas Practicas de Manufactura para Industria FarmaceuticaMarco Camacho
 
Presentación MF 1445 EVALUACION COMO Y QUE
Presentación MF 1445 EVALUACION COMO Y QUEPresentación MF 1445 EVALUACION COMO Y QUE
Presentación MF 1445 EVALUACION COMO Y QUEJosé Hecht
 
LOS AMBIENTALISTAS todo por un mundo mejor
LOS AMBIENTALISTAS todo por un mundo mejorLOS AMBIENTALISTAS todo por un mundo mejor
LOS AMBIENTALISTAS todo por un mundo mejormrcrmnrojasgarcia
 
HISTORIETA: AVENTURAS VERDES (ECOLOGÍA).
HISTORIETA: AVENTURAS VERDES (ECOLOGÍA).HISTORIETA: AVENTURAS VERDES (ECOLOGÍA).
HISTORIETA: AVENTURAS VERDES (ECOLOGÍA).hebegris04
 
ENSEÑAR ACUIDAR EL MEDIO AMBIENTE ES ENSEÑAR A VALORAR LA VIDA.
ENSEÑAR ACUIDAR  EL MEDIO AMBIENTE ES ENSEÑAR A VALORAR LA VIDA.ENSEÑAR ACUIDAR  EL MEDIO AMBIENTE ES ENSEÑAR A VALORAR LA VIDA.
ENSEÑAR ACUIDAR EL MEDIO AMBIENTE ES ENSEÑAR A VALORAR LA VIDA.karlazoegarciagarcia
 
5° Proyecto 13 Cuadernillo para proyectos
5° Proyecto 13 Cuadernillo para proyectos5° Proyecto 13 Cuadernillo para proyectos
5° Proyecto 13 Cuadernillo para proyectosTrishGutirrez
 
EL MOVIMIENTO Y LA ENERGÍA EN LOS CUERPOS.pptx
EL MOVIMIENTO Y LA ENERGÍA EN LOS CUERPOS.pptxEL MOVIMIENTO Y LA ENERGÍA EN LOS CUERPOS.pptx
EL MOVIMIENTO Y LA ENERGÍA EN LOS CUERPOS.pptxduquemariact
 

Último (20)

Presentacionde Prueba 2024 dsdasdasdsadsadsadsadasdasdsadsa
Presentacionde Prueba 2024 dsdasdasdsadsadsadsadasdasdsadsaPresentacionde Prueba 2024 dsdasdasdsadsadsadsadasdasdsadsa
Presentacionde Prueba 2024 dsdasdasdsadsadsadsadasdasdsadsa
 
Salvando mi mundo , mi comunidad , y mi entorno
Salvando mi mundo , mi comunidad  , y mi entornoSalvando mi mundo , mi comunidad  , y mi entorno
Salvando mi mundo , mi comunidad , y mi entorno
 
TALLER_DE_ORALIDAD_LECTURA_ESCRITURA_Y.pptx
TALLER_DE_ORALIDAD_LECTURA_ESCRITURA_Y.pptxTALLER_DE_ORALIDAD_LECTURA_ESCRITURA_Y.pptx
TALLER_DE_ORALIDAD_LECTURA_ESCRITURA_Y.pptx
 
Sesión ¿Amor o egoísmo? Esa es la cuestión
Sesión  ¿Amor o egoísmo? Esa es la cuestiónSesión  ¿Amor o egoísmo? Esa es la cuestión
Sesión ¿Amor o egoísmo? Esa es la cuestión
 
Revista Apuntes de Historia. Abril 2024.pdf
Revista Apuntes de Historia. Abril 2024.pdfRevista Apuntes de Historia. Abril 2024.pdf
Revista Apuntes de Historia. Abril 2024.pdf
 
PPT La guerra detrás de todas las guerras
PPT La guerra detrás de todas las guerrasPPT La guerra detrás de todas las guerras
PPT La guerra detrás de todas las guerras
 
Si cuidamos el mundo, tendremos un mundo mejor.
Si cuidamos el mundo, tendremos un mundo mejor.Si cuidamos el mundo, tendremos un mundo mejor.
Si cuidamos el mundo, tendremos un mundo mejor.
 
Apunte de clase Pisos y Revestimientos 2
Apunte de clase Pisos y Revestimientos 2Apunte de clase Pisos y Revestimientos 2
Apunte de clase Pisos y Revestimientos 2
 
Biografía del General Eloy Alfaro Delgado
Biografía del General Eloy Alfaro DelgadoBiografía del General Eloy Alfaro Delgado
Biografía del General Eloy Alfaro Delgado
 
La-cosmovision-del-curriculo-educativo-en-Venezuela (1).pptx
La-cosmovision-del-curriculo-educativo-en-Venezuela (1).pptxLa-cosmovision-del-curriculo-educativo-en-Venezuela (1).pptx
La-cosmovision-del-curriculo-educativo-en-Venezuela (1).pptx
 
Buenas Practicas de Manufactura para Industria Farmaceutica
Buenas Practicas de Manufactura para Industria FarmaceuticaBuenas Practicas de Manufactura para Industria Farmaceutica
Buenas Practicas de Manufactura para Industria Farmaceutica
 
Presentación MF 1445 EVALUACION COMO Y QUE
Presentación MF 1445 EVALUACION COMO Y QUEPresentación MF 1445 EVALUACION COMO Y QUE
Presentación MF 1445 EVALUACION COMO Y QUE
 
LOS AMBIENTALISTAS todo por un mundo mejor
LOS AMBIENTALISTAS todo por un mundo mejorLOS AMBIENTALISTAS todo por un mundo mejor
LOS AMBIENTALISTAS todo por un mundo mejor
 
HISTORIETA: AVENTURAS VERDES (ECOLOGÍA).
HISTORIETA: AVENTURAS VERDES (ECOLOGÍA).HISTORIETA: AVENTURAS VERDES (ECOLOGÍA).
HISTORIETA: AVENTURAS VERDES (ECOLOGÍA).
 
ENSEÑAR ACUIDAR EL MEDIO AMBIENTE ES ENSEÑAR A VALORAR LA VIDA.
ENSEÑAR ACUIDAR  EL MEDIO AMBIENTE ES ENSEÑAR A VALORAR LA VIDA.ENSEÑAR ACUIDAR  EL MEDIO AMBIENTE ES ENSEÑAR A VALORAR LA VIDA.
ENSEÑAR ACUIDAR EL MEDIO AMBIENTE ES ENSEÑAR A VALORAR LA VIDA.
 
5° Proyecto 13 Cuadernillo para proyectos
5° Proyecto 13 Cuadernillo para proyectos5° Proyecto 13 Cuadernillo para proyectos
5° Proyecto 13 Cuadernillo para proyectos
 
Acuerdo segundo periodo - Grado Once.pptx
Acuerdo segundo periodo - Grado Once.pptxAcuerdo segundo periodo - Grado Once.pptx
Acuerdo segundo periodo - Grado Once.pptx
 
Acuerdo segundo periodo 2024 - Octavo.pptx
Acuerdo segundo periodo 2024 - Octavo.pptxAcuerdo segundo periodo 2024 - Octavo.pptx
Acuerdo segundo periodo 2024 - Octavo.pptx
 
EL MOVIMIENTO Y LA ENERGÍA EN LOS CUERPOS.pptx
EL MOVIMIENTO Y LA ENERGÍA EN LOS CUERPOS.pptxEL MOVIMIENTO Y LA ENERGÍA EN LOS CUERPOS.pptx
EL MOVIMIENTO Y LA ENERGÍA EN LOS CUERPOS.pptx
 
¿Amor o egoísmo? Esa es la cuestión.pptx
¿Amor o egoísmo? Esa es la cuestión.pptx¿Amor o egoísmo? Esa es la cuestión.pptx
¿Amor o egoísmo? Esa es la cuestión.pptx
 

avance de tesis liquenes

  • 1. DETERMINACION DEL POTENCIAL ANTIOXIDANTE DEL EXTRACTO Y METABOLITOS SECUNDARIOS AISLADOS PERTENECIENTES AL LIQUEN COLOMBIANO RIMELIA CETRATA JEISSON ANDRES PABON ORTIZ 20022150056 NINA MARIA SANCHEZ RAMIREZ 20012150070 MARIA DEL PILAR SILVA MARTINEZ 20022150069 Trabajo de grado para optar al titulo de Licenciatura en Química. Línea Evaluación Biológica y Fisicoquímica de Metabolitos Secundarios de Líquenes Colombianos UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS DE LA EDUCACION UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA DEPARTAMENTO DE QUIMICA FARMACEUTICA BOGOTA, D.C. 2007
  • 2. DETERMINACION DEL POTENCIAL ANTIOXIDANTE DEL EXTRACTO Y METABOLITOS SECUNDARIOS AISLADOS PERTENECIENTES AL LIQUEN COLOMBIANO RIMELIA CETRATA JEISSON ANDRES PABON ORTIZ 20022150056 NINA MARIA SANCHEZ RAMIREZ 20012150070 MARIA DEL PILAR SILVA MARTINEZ 20022150069 Trabajo de grado para optar al titulo de Licenciatura en Química. Línea Evaluación Biológica y Fisicoquímica de Metabolitos Secundarios de Líquenes Colombianos DIRIGIDO POR: DR. JOSE LEOPOLDO ROJAS ARAQUE Investigador Principal DRA. NORMA ANGELICA VALENCIA ISLAS Co- Investigadora LIC. MARISOL RAMOS Docente Titular Universidad Distrital Francisco José de Caldas UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS DE LA EDUCACION UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA DEPARTAMENTO DE QUIMICA FARMACEUTICA BOGOTA, D.C. 2007
  • 3. Nota de Aceptación ________________________ ________________________ ________________________ __________________________ Firma del Presidente del Jurado __________________________ Firma del Jurado __________________________ Firma del Jurado
  • 5. “Si resultara cierto que alimentar a los extraños es inherente a la naturaleza toda, como Algo que tiene carácter de ley general, muchos enigmas quedarían entonces resueltos” Goethe 1827, in Kropotkin, El apoyo mutuo: un factor de evolución.
  • 6. AGRADECIMIENTOS Los autores expresan agradecimientos a: Marisol Ramos, Licenciada en Química, Facultad de Ciencias de la Educación, Universidad Distrital Francisco José de Caldas, Docente Titular, por su constante apoyo y motivación al trabajo. DRA. Norma Angélica Valencia Islas, Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Co- investigadora del proyecto, por sus valiosos e importantes aportes y orientaciones. DR. José Leopoldo Rojas Araque, Departamento de Química, facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Investigador Principal del proyecto, por sus valiosas sugerencias.
  • 7. CONTENIDO Pág. 1. INDICE DE TABLAS 0 2. INDICE DE FIGURAS 0 3. INDICE DE ANEXOS 0 4. RESUMEN 0 5. CAPITULO I 0 5.1. JUSTIFICACIÓN 0 5.2. INTRODUCCION 0 5.3. ESTUDIOS PREVIOS 0 5.3.1. Del Género 0 5.3.2. Del Método 0 5.4 PROBLEMA 0 5.5. HIPOTESIS 0 5.6. OBJETIVO GENERAL 0 5.7. OBJETIVOS ESPECIFICOS 0 6. CAPITULO II 0 6.1. LIQUENES 0 6.2. CONSTITUYENTES DE LOS LIQUENES 0 6.2.1. Fotobionte o componente algal (ficobionte) 0 6.2.2. Micobionte u hongo liquenizado 0 6.2.3. Relaciones entre los simbiontes 0 6.2.3.1. Relación fisiológica 0 6.2.4. Morfología y anatomía del talo 0 6.3. ASPECTOS ECOLOGICOS 0 6.3.1. Sustratos liquénicos 0 6.3.2. Resistencia a condiciones extremas 0 6.3.3. Sustancias de los líquenes 0 6.3.4. Uso de los líquenes 0 6.3.5. Habitats de los líquenes 0 6.4. QUIMIOTAXONOMIA 0 6.4.1. Química de los líquenes 0 6.4.2. Test de coloración 0 6.4.3. Cristalización 0 6.4.4. Técnicas cromatográficas 0 6.4.4.1. Cromatografía en capa fina 0 6.4.4.2. Cromatografía en columna 0 6.4.5. Técnicas espectroscópicas 0
  • 8. 6.4.5.1. Espectroscopía infrarrojo 0 6.4.5.2. Espectroscopía RMN 0 6.4.5.3. Espectroscopía ultravioleta 0 6.5. TECNICAS DE COLECCIÓN Y ESTUDIO 0 6.5.1. Materiales 0 6.5.2. Datos de campo 0 6.5.3. Colecta 0 6.5.4. Estudio del material en el laboratorio 0 7. CAPITULO III 0 7.1. METODOLOGIA 0 7.1.1. Colecta y Selección del Liquen 0 7.1.2. Método de Extracción 0 7.1.3. Elución del extracto primario crudo en 0 cromatografía en columna (CC) 7.1.4. Aislamiento de compuestos por polaridad 0 7.1.5. Test de coloración 0 7.1.6. Clasificación y separación de compuestos 0 en cromatografía en placa. 7.1.7. Purificación de compuestos (CC y CP) 0 7.1.8. Elucidación estructural de compuestos 0 (RMN, IR, UV, MP, EM). 7.1.9. Ensayo de actividad antioxidante (CP) 0 compuestos impuros. 7.1.10. Prueba de actividad antioxidante 0 (método DPPHo ) de extracto. 8. CAPITULO IV 0 8.1. RESULTADOS 0 8.2. ANALISIS DE RESULTADOS 0 8.3. CONCLUSIONES 0 9. CAPITULO V 0 9.1. RECURSOS 0 9.1.1. HUMANOS 0 9.1.2. FISICOS 0 9.1.2.1. Materiales 0
  • 9. 9.1.2.2. Equipos 0 9.1.2.3. Reactivos 0 9.1.3. FINANCIEROS 0 9.2. CRONOGRAMA 0 9.3. COMPONENTE PEDAGOGICO 0 9.4. BIBLIOGRAFIA 0
  • 10. 1. INDICE DE TABLAS Tabla 1. Algas participantes en la simbiosis primaria de líquenes. Tabla 2. Fases de formación de un talo. Tabla 3. Distribución de líquenes según sustrato. Tabla 4. Test De Coloración. Tabla. Materiales Tabla. Equipos Tabla. Tiempo De Los Líquenes 1y 2 En El Sistema Soxhlet Tabla. Masa Inicial Del Liquen Rimelia Cetrata Tabla. Ubicación De La Especie Parmotrema Tabla. Tiempo De Los Líquenes En El Método Soxhlet Tabla. Test De Coloración. Para El LQ Rimelia Cetrata Y LQ 2 Tabla. Test De Coloración. Para Las Fracciones Del El LQ Rimelia Tabla. Sistemas Para El Barrido De Las Cromatografías Tabla. Elusión Del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata Tabla . Clave De La Elusión Del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata Tabla . Punto De Fusión De Algunas De Las Claves Que Se Encuentran Puras De La Rimelia Cetrata Tabla . Masas Del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata Tabla . De Las Masas Del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata
  • 11. Tabla . Cromatografía En Columna De La Fracción D A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata Tabla . Clave De La CC De La Fracción D A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata Tabla . Masas De La Fracción D De La Rimelia Cetrata Tabla . CC De La Fracción E A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata Tabla . Clave De La CC De La Fracción E A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata Tabla . CC De La Fracción CDd A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata Tabla .Clave De La CC De La Fracción CDd A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata Tabla . Masas De Las Fracciones A partir De CDd De La Rimelia Cetrata Tabla . CC De La Fracción Ed A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata Tabla . Clave De La CC De La Fracción Ed A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata Tabla . Masas De Las Fracciones Ed De La Rimelia Cetrata Preparativa De La Fracción 2cdd Y De La 3cdd Tabla . Preparativa De La Fracción 2cdd Y De La 3cdd Tabla . Cromatografía Flash De Mediana Presión De La Fracción E A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata Tabla .Clave De La cromatografía Flash De Mediana Presión De La Fracción E A Partir Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata Tabla . Masas Del Fraccionamiento Primario Del Ed De La Rimelia Cetrata Tabla . Cromatografía Flash De Mediana Presión De La Fracción E, Tabla . Clave De La Cromatografía Flash De Mediana Presión De La Fracción E Tabla . Masas Del Fraccionamiento Primario Del E De La Rimelia Cetrata Tabla . Valores Espectrofotometricos De [DPPH°] & Absorbancia Tabla . Valores Espectrofotometricos De [AcAsc] & Absorbancia
  • 12. 2. INDICE DE FIGURAS Figura 1. Estructuras de metabolitos secundarios aislados de líquenes. Figura 2. Cromatografía en columna. Figura 3. Cromatografía en placa bidimensional. Figura 4. Esquema de la metodología empleada. Figura 5. Método soxhlet.
  • 13. 3. INDICE DE ANEXOS Anexo . Sistema Soxlher Anexo . Preparación De La Sílice Gel Impregnada Con Ácido Oxálico Al 1%. Anexo . Cromatografía En Columna Anexo . Cromatografía Preparativa Anexo . Recristalizacion Anexo . Preparación De La Curva De La Curva De Calibración Del Radical [DDPPH] Diagrama . Cinética Del Ácido Ascórbico & Radical Libre (DDPPH) Anexo . Cinética De La Muestra Biológica Del Liquen Rimelia Cetrata Con El Radical Libre (DPPH). Anexo . Balanza Analítica Anexo . Balanza de tres brazos Anexo . Cámara de UV Anexo . Campana de Extracción Anexo . Columna Cromatografica Anexo . Columna Flash de mediana Presión Anexo . Espectrofotómetro UV Anexo . Horno de calentamiento Anexo . Horno Secador Anexo . Microscopio Anexo . Punto de Fusión Anexo . Rotavapor) Anexo . Soxhlet nexo . 1,2 DifenilEndiamina Anexo . Etilo Acetato Para Cromatografía En Fase Liquida Anexo . Acido Acético (Glacial) 100% Puro Anexo . Acido L (+) Ascórbico Anexo . Acido Formico Anexo . Acido Oxálico Dihidratado Anexo . Acido Sulfurico Anexo . Agua Destilada Anexo . Benceno Para Cromatografía En Fase Liquida Anexo . Cloruro de Hierro (III)
  • 14. Anexo . Etanol Anexo . Éter Dietilico Puro Anexo . Hidróxido De Potasio Anexo . Hipoclorito De Sodio Anexo . Metanol Anexo . n-Hexano Para Cromatografía En Fase Liquida Anexo . Silicagel Granulado Anexo . Sulfato De Magnesio Anexo . Tolueno Para Cromatografía En Fase Liquida Anexo . Infrarrojo del Compuesto B Anexo . Infrarrojo del Compuesto C Anexo . Resonancia Magnética Nuclear del CompuestoB Anexo . Resonancia Magnética Nuclear del CompuestoC Anexo . Resonancia Magnética Nuclear del CompuestoD
  • 15. 4. RESUMEN El principal objetivo de esta investigación es realizar un estudio detallado de una especie de Liquen de Género Rimelia, desde el punto de vista Fitoquímico y así posteriormente hacer el estudio Cinético a nivel de Extracto con el Radical Libre 2,2- Difenil-1- picrilhidracilo DPPH°. Como consecuencia de la gran diversidad biótica que posee nuestro país y la incalculable fuente de riquezas se puede llegar a tener aplicaciones muy útiles en la salud, industria, agricultura, biotecnología, entre otras. Uno de estos recursos que no ha sido muy estudiado desde la parte Química son los Líquenes pero llama bastante la atención la capacidad que este posee para sobrevivir en condiciones extremas, habitando en medio ambientales como en el desierto, en los polos, y mas aún en zonas donde se presenta un clima tropical Durante el desarrollo de este trabajo nos propusimos cumplir a cabalidad con los objetivos planteados, relacionado casi en su totalidad con la parte Química del Liquen perteneciente al Género Rimelia. Así pues, en el Capitulo I se hace una descripción de los objetivos propuestos, el problema de investigación y los estudios previos realizados por otros autores. En el Capitulo II, se tratan todos los aspectos relacionados con la diversidad y riqueza en las regiones Naturales de Colombia, aspectos ecológicos, y un gran énfasis con respecto a la Quimiotaxonomia, técnicas de Colección y Estudio. En el Capitulo III se expone la metodología utilizada durante el proceso de investigación. En el Capitulo IV, se muestran los resultados obtenidos y se realiza el análisis en cuanto a estos y se concluye finalmente.
  • 16. En el Capitulo V se tiene en cuenta el enfoque Pedagógico y Medioambiental como Futuros Licenciados En Ciencias De La Educación. Es de gran importancia resaltar que para el estudio Fisicoquímico se hace uso de Técnicas y Métodos de Separación (cromatografía); en un principio se realizó la extracción del LQ haciendo uso de la Extracción Continua en Equipos Soxhlet (20°C), pues es uno de los métodos mas utilizados para obtener constituyentes orgánicos de tejidos vegetales secos y pulverizados, este procedimiento es ideal para el análisis a gran escala y como disolvente se utiliza Metanol el cual nos brindará un buen rendimiento, ya que puede llegar a penetrar rápidamente en los órganos vegetales, además se tiene en cuenta otras características como la selectividad (poder disolvente), temperatura de ebullición (estabilidad térmica de los constituyente), poder de penetración de las paredes celulares, facilidad de recuperar, precio o costo, seguridad de manipulación, baja reactividad. Ya con el extracto en bruto se empleo una de las técnicas de separación para los componentes de una mezcla de solutos, como son las separaciones cromatográficas, la cual tiene en cuenta las propiedades fisicoquímicas, tales como la polaridad y la carga iónica de los solutos, el tamaño molecular, el grado de adsorción entre los solutos y las fases estacionarias, o el reparto entre dos solutos entre las fases líquidas inmiscibles. En este estudio vamos a utilizar la Cromatografía en columna (CC), la cromatografía en capa fina (CCF), cromatografía preparativa (CP). Posteriormente se utilizo Métodos Instrumentales como Infrarrojo (IR), Ultravioleta (UV), Masas, Resonancia Magnética Nuclear (RMN), espectrofotometría UV, de los compuestos puros, con el fin de conocer los compuestos hallados. Finalmente se realizo el Estudio Cinético del Extracto frente al radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidracilo DPPH°.
  • 17. 5. CAPITULO I 5.1. JUSTIFICACIÓN En nuestro país existe una amplia biodiversidad de líquenes, los cuales representan un recurso de gran importancia y atractivo para el mundo. El estudio de estos organismos ha despertado en la actualidad un gran interés debido a varias propiedades bioactivas que poseen los metabolitos secundarios que los conforman. Gracias a varios estudios realizados en Colombia se conoce una amplia gama de las especies que existen de estos organismos, donde las investigaciones realizadas se han enfocado básicamente en la clasificación taxonómica contribuyendo en gran medida al conocimiento de la biodiversidad de líquenes de nuestro país. Sin embargo en el aspecto químico y biológico los estudios realizados han sido pocos, ya que aún existe una gran cantidad de especies sin clasificar taxonómicamente dada la carencia de estudios químicos indispensables para tal fin, la siguiente propuesta pretende contribuir al conocimiento de la química de los líquenes Colombianos. Por las razones expuestas y dado el gran potencial que ofrecen los Líquenes como una fuente de nuevos principios activos y la gran diversidad de Colombia en este recurso natural, la búsqueda de nuevos y mejores agentes antioxidantes para el tratamiento y prevención de muchas enfermedades y para el uso en alimentos y cosméticos serán las problemáticas guías en el proyecto de investigación. 5.2. INTRODUCCIÓN Los líquenes son organismos simbióticos entre un alga y un hongo, dichos organismos han sido poco estudiados en nuestro país. Gracias al grupo de investigación en Estudios Biológicos y Fisicoquímicos de Líquenes Colombianos de la Universidad
  • 18. Nacional de Colombia dirigido por el Dr. José Leopoldo Rojas Araque, junto con el apoyo del Instituto de Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia se ha podido incrementar la investigación en este campo. El estudio de la actividad antioxidante en extractos liquénicos y compuestos aislados de los mismos ha sido poco explorado en nuestro país, como se menciono con anterioridad, los estudios realizados por autores como, (K. DIVAKAR, BLANCO, L. HAWKSWORTH, CRESPO, 2005) en el género Rimelia cetrata se han encaminado al estudio taxonómico del mismo, sin embargo no se ha realizado un estudio detallado acerca de la bioactividad de los metabolitos secundarios que se presentan en dicha especie. Para ello es de gran importancia realizar inicialmente un estudio fitoquímico donde se logre aislar e identificar aquellos metabolitos secundarios de mayor actividad que presenta la especie y de esta manera realizar un estudio fisicoquímico para lograr contribuir al desarrollo científico de nuestro país. 5.3. ESTUDIOS PREVIOS 5.3.1. Antecedentes del Género Rimelia En la base de datos consultada, se encontraron tres artículos relacionados con el género Rimelia cetrata, estos están basados básicamente en el aislamiento e identificación de glucanos y galactoglucanos con el fin de presentar información acerca de la taxonomía de este líquen. En el articulo titulado “Molecular phylogenetic studies on the Parmotrema reticulatum (syn. Rimelia reticulata) complex, including the confirmation of P. pseudoreticulatum as a distinct species” (K. DIVAKAR, BLANCO, L. HAWKSWORTH, CRESPO, 2005).
  • 19. Se concluye que la Parmotrema reticulatum (TAYLOR, M.CHOISY), P. clavuliferum y P. pseudoreticulatum, son organismos simbióticos de una misma familia que provienen de un grupo morfológicamente similar, por tal motivo es indiscutible su parecido químicamente (todos estos géneros contienen atranorina, cloroatranorina, ácido salazinico y consalazinico). Sin embargo algunos autores (Sano & Fletcher 1990; Sano & DePriest 1999; Kurokawa 1991, 2003), colocan dichos géneros por separado o a veces en el género Rimelia, en el cual se encuentra el cetrata. En los artículos titulados “Chemotypes significance of lichenized fungi by structural characterization of heteropolysaccharides from the genera Parmotrema and Rimelia” y “ Chemotypes significance of lichenized fungi by structural characterization of heteropolysaccharides from the genera Parmotrema and Rimelia” (ROSECHRER, GRASSI MELLINGER A, ELIASARO B, GORIN A, IACOMINI, 2005). Se aislaron Galactoglucanos y glucanos de los hongos liquenizados del género Parmotrema (austrosinense de Parmotrema, Parmotrema delicatulum, mantiqueirense de Parmotrema, schindlerii de Parmotrema, y tinctorum de Parmotrema) y de Rimelia (el cetrata de Rimelia y reticulata de Rimelia) en dichos estudios se concluyo la similitud de estos dos géneros. La química y análisis de estos compuestos es posible a varios métodos espectroscópicos y cromatográficos. Gracias a estos análisis la taxonomia de este tipo de organismos se estructura aún más. Los estudios mostrados con anterioridad elucidan la problemática taxonómica de estos géneros (Parmotrema y Rimelia) en cuanto a sus propiedades químicas, por medio del aislamiento y la aplicación de métodos espectroscópicos y cromatográficos de dichos compuestos (glucanos y galactoglucanos) se pudo llegar a la conclusión de que estos géneros no pueden ser separados. Sin embargo se desaprovecha el potencial del sin número de compuestos que presentan este tipo de hongos liquenizados, por tal razón es de suma importancia utilizar dichas propiedades con el fin de un desarrollo a futuro en el campo de la medicina, industria, alimentos, etc.
  • 20. 5.3.2. Antecedentes del Método Los estudios y trabajos que se han realizado con líquenes tanto en el aislamiento de compuestos como en lo relacionado con actividad antioxidante han marcado una pauta en cuanto a la utilización de estos en distintas áreas tanto en la educación como a nivel científico, de estos citaremos algunos ya que por su interés y hallazgo son relevantes, de tal forma también se tuvo en cuenta estos para aplicar la metodología de este estudio. En el artículo “Use of Free Radical Method to Evaluate Antioxidant Activity” (WILLIAMS, E. CUVELIER, C. BERSET, 1995) se utiliza el radical DPPH (2,2-Difenil-1-picrilhidracilo) como técnica para la evaluación de actividad antioxidante, esta prueba se hace para compuestos fenólicos, los cuales presentan mayor actividad. Se hace un análisis detallado de los resultados y se discute de acuerdo a la química de las reacciones establecidas. Este artículo es la base del estudio cinético para determinar actividad antioxidante en nuestro estudio, y posee constantes establecidas para posibles compuestos aislados. El segundo articulo relevante y de gran ayuda en nuestro estudio se titula “Improved Chromatographic Method for the Purification of Phenolic Constituents of the Lichen Parmotrema Tinctorum (Nyl.) Hale” (G. K. JAYAPRAKASHA, L. JAGANMOHAN, R. P. SINGH, K. K. SAKARIAH, 1998) en este trabajo se estandariza el método cromatografico para el aislamiento de los compuestos liquénicos, establece criterios comprobados en cuanto a cantidad de reactivos y características de estos y menciona los diversos sistemas de elución para obtener determinado compuesto. Otro articulo relacionado con estos estudios cromatográficos en líquenes se titula “A Standardized Method for the Identification of the Lichen Products” (F. CULBERSON, H. KRISTINSSON, 1970) Se diferencia del anterior por poseer tablas de RF y test de
  • 21. coloración de compuestos liquénicos. Además muestra otros sistemas de Elución y la correcta forma de tomar los rf. En otros estudios relacionados con la actividad antioxidante de importancia han sido: “Determination of Antioxidative Potencial of Lichen Usnea Ghattensis in Vitro” (B. C. BEHERA, N. VERMA, A. SONONE, U. MAKHIJA, 2004), “Free Radical Scavenging Behavior Antioxidant Compounds of Sesame (Sesamum Indicum L.) in DPPHo System” (K. P. SUJA, A. JAYALEKSHMY, C, ARUMUGHAN, 2004), “Comparison of Antoxidant Activity and Phenolic Content of Three Lichens Species”(F. ODABASOGLU, A. ASLAN, A. CAKIR, H. SULEYMAN, Y. KARAGOZ, M. HALICI, Y. BAYIR, 2004 ) “Determination of Antioxidant Activity of Lichen Cetraria Islandica(L) Ach ” (I. GÜLÇIN, M. OKTAY, Ö. KÜFREVIOGLU, A. ASLAN, 2001), algunos nombran el método de tiocianato con el fin de ensayar actividad antioxidante, sin embargo realizan otros estudios, como determinación de contenido fenólico y poder reductor. 5.4. PROBLEMA Aislar los Metabolitos Secundarios de mayor Actividad frente al radical 2,2-Difenil-1- picrilhidracilo DPPH● de un LQ Colombiano del género Rimelia y así poder realizar los ensayos del poder antioxidante a nivel de Extracto. 5.5. HIPOTESIS • Los metabolitos aislados del líquen de la especie Rimelia presentaran una actividad antioxidante relevante frente al radical 2,2-Difenil-1-picrilhidracilo DPPH●.
  • 22. • El aislamiento de los metabolitos de la especie Rimelia permitirá la clasificación taxonómica dentro de la colección de líquenes Colombianos del Instituto de Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia. 5.6. OBJETIVO GENERAL • Contribuir al conocimiento de la química de los líquenes Colombianos del género Rimelia de una especie no analizada, con la finalidad de identificar y aislar los metabolitos secundarios presentes en el organismo y de esta manera determinar el potencial antioxidante a nivel de Extracto mediante el ensayo del poder antioxidante y del poder reductor. 5.7. OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Realizar un estudio Fitoquímico detallado del LQ perteneciente al Género Rimelia. • Identificar y caracterizar los metabolitos secundarios aislados presentes en el liquen estudiado mediante la determinación de sus constantes físicas a partir de técnicas espectroscópicas. • Hacer uso del estudio cinético de la reacción del compuesto con el radical libre de DPPH° a partir de la constante de velocidad y de los Ec50.
  • 23. 6. CAPITULO II 6.1. LÍQUENES. Los líquenes u hongos liquenizado son organismos complejos formados por un hongo y un alga. A estas unidades se llega por un equilibrio dinámico entre estos dos tipos de organismos, en ellos la parte algal actúa como organismo fotoautótrofo que aporta hidratos de carbono, mientras que la parte fúngica actúa como heterótrofo aportando sales y agua. Los líquenes se clasifican de acuerdo con el tipo de hongo (llamado micobionte) que los componen. El micobionte de la mayoría de los líquenes es un ascomicete, aunque en algunos líquenes tropicales es un basidiomicete (VALENCIA- AGUIRRE, 2002; DE BARY, 1879; SCHWENDENER, 1868). El alga que compone un liquen (llamada ficobionte) suele ser unicelular del tipo de las algas verdes, como Trebouxia o Coccomyxa, o del tipo de las algas verdeazuladas, como Nostoc o Scytonema. 6.2. CONSTITUYENTES DE LOS LIQUENES. 6.2.1. Fotobionte O Componente Algal (Ficobionte) Las algas presentes en los talos liquénicos (aproximadamente cuarenta géneros), clorofíceas y cianobacterias de tipo unicelular, cenóbico o filamentoso reciben diferentes denominaciones como: algas simbióticas, algas liquenicas, componente algal, fotobionte o ficobionte. Las algas simbiontes son de vida libre, pueden subsistir libremente en la naturaleza en donde se reproducen sexual y asexualmente comportándose como simbiontes facultativos en la asociación liquénica (VALENCIA- AGUIRRE, 2002).
  • 24. Los géneros Trebouxia, Trentepholia y Nostoc son los fotobiontes más frecuentes, y de amplia distribución en las asociaciones liquénicas. Los géneros Trebouxia, Trentepholia son eucarióticos y pertenecen a algas verdes; Nostoc pertenece al grupo de bacteria oxígeno –fotosintética (cianobacteria). Cuando un alga se encuentra asociada con un micobionte no se reproduce sexualmente, lo hace en forma asexual. Las cianobacterias (algas verde-azules) se multiplican por fisión binaria, heterocistes o akinetos, son de naturaleza procariota. Las clorofíceas, por su parte se multiplican por división celular vegetativa o por formación asexual de esporas llamadas aplanoesporas. El fotobionte en asociación liquénica puede cambiar la intensidad del color, la forma general, el tamaño, las cubiertas de gelatina y tener cambios fisiológicos. Algas como Trentepholia y Gloeocapsa son más pigmentadas en vida libre que el liquen. En ciertas especies de Trebouxia y Nostoc una cubierta gelatinosa esta presente en medio de cultivo, pero no en el talo (VALENCIA-AGUIRRE, 2002). Aproximadamente el 92% de las especies poseen ficobiontes verdes, frente a un 8% de cianobacterias.Nostoc, Scytonema, Stigonema, Gloeocapsa y Calothrix son los cianosimbiontes más comúnes (BARRENO, 1997). Los principales grupos de algas participantes en la simbiosis primaria de líquenes son: CHLOROPHYTA: 90 A 95 % EN REGIONES TROPICALES. Palmellaceae, Coccomyxaceae, Protococcaceae, Trentepohliaceae, Cladophoraceae, Chlorococcaceae, Oocystaceae, Botryococcaceae. CYANOPHYTA: 5 A 10 % EN REGIONES TROPICALES. Chroococcaceae, Nostocaceae, Scytonemataceae, Rivulariaceae. XANTHOPHYCEAE Heterococcus en Verrucaria sp. PHAEOPHYCEAEPetroderma en Verrucaria sp.
  • 25. TABLA.1 ALGAS PARTICIPANTES EN LA SIMBIOSIS PRIMARIA DE LIQUENES. (FERRARO, INSTITUTO DE CIENCIAS BOTANICAS, 2000) 6.2.2. Micobionte U Hongo Liquenizado Los hongos que entran en la constitución de los líquenes son principalmente Ascomycotina y sólo unos pocos pertenecen a los Basidiomycotina o Deuteromycotina. Se han observado también algunas formas más o menos inciertas de liquenización detectadas de otros grupos fungales (VALENCIA-AGUIRRE, 2002). La clasificación y denominación de los líquenes se refiere siempre al micobionte, según lo establecido en el Código Internacional de la Nomenclatura Botánica (CINB). El hongo determina la naturaleza y forma de la mayoría de los líquenes y produce las estructuras fructificantes, comparables a las formas de vida libre (BARRENO, 1997; VALENCIA-AGUIRRE, 2002). Los hongos de los líquenes casi siempre son simbiontes estrictos y no son capaces de prosperar en la naturaleza sin el ficobionte apropiado (son simbiontes obligados). La mayoría de ellos forman colonias compactas y elevadas de diversa formas, color y tamaño; por el contrario los hongos separados del fotobionte forman un micelo carente de la organización y la diferenciación celular típica del talo del liquen. La pared del hongo debe ser flexible para facilitar los contactos con el ficobionte; también participan en la captación de agua, de nutrientes y en su transporte al citoplasma. El agua de las células algales está controlada por el hongo a través del apoplasto fangal, por lo tanto no tienen acceso directo a ella (RICHARDSON, 1999; HONNEGGER, 1998). Otros grupos particulares de hongos como los Myxomycetes al unirse con algas forman "mixolíquenes" mientras que la unión de Actinomicetes con algas constituyen "actinolíquenes", no son muy frecuentes.
  • 26. 6.2.3. RELACIONES ENTRE LOS SIMBIONTES 6.2.3.1. Relación Fisiológica Es el rol fisiológico que cumple cada uno de los simbiontes en beneficio del consorcio. El hongo protege al alga contra la desecación y el calor solar produciendo pigmentos en los tejidos; proporciona al fotobionte gas carbónico de su respiración, retiene agua y minerales en sus tejidos, los cuales toma a través de sus paredes; extrae minerales del sustrato, compite por espacio en el mismo; da forma al liquen (en la mayoria de los casos). Sin embargo, la forma del talo liquénico no es la misma que la del hongo aislado. Este hecho presupone que el alga también contribuye en alguna porción, al establecimiento de la forma y estructura del liquen. El hongo se reproduce sexualmente, aloja al alga de tal forma que tenga el óptimo de intensidad lumínica y dispone sus hifas para que se pueda alojar adecuadamente. La mayoría de los líquenes sin fotófilos, pero cuando se presenta iluminación excesiva el talo se deseca para proteger el aparato fotosintético. El alga, por su parte, sintetiza un exceso de compuestos orgánicos (especialmente azúcares simples o monosacáridos), los cuales son utilizados por el micobionte para se supervivencia, almacenándolos en forma de manitol no disponible para el fotobionte. El transporte depende de la mediación de algunas sustancias segregadas por el hongo que facilitan los procesos de difusión, que del contacto entre el micobionte y fotobionte (VALENCIA-AGUIRRE, 2002). Cuando el fotobionte es una cianobacteria, suministra sustancias nitrogenadas al consorcio, ya que tiene la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico; sin embargo, sólo utiliza una pequeña cantidad del nitrógeno fijado y el resto lo libera en forma de amonio,
  • 27. para ser utilizado por el hongo para la producción de proteínas y aminoácidos. Cuando el fotobionte es un alga verde, el suministro del nitrógeno del consorcio es de origen exógeno y a partir de la urea, nitratos o aminoácidos. Las cianobacterias excretan glucosa (GALUN, 1988 citado por MOORE LANDECKER, 1996; WERNER, 1992), mientras que las algas verdes secretan poliol; igualmente proporcionan tiamina y biotina. Parece ser que tanto el hongo como el alga pueden obtener, en parte, sustancias carbonatadas del sustrato, lo cual depende de la relación existente entre éste y el liquen. Otros aportes del componente fúngico al consorcio son la regulación de las poblaciones del fotobionte y la longevidad de las células fúngicas liquenizadas, comparadas con la vida libre (VALENCIA-AGUIRRE, 2002; HONEGGER, 1998). 6.2.4. MORFOLOGIA Y ANATOMIA DEL TALO Los líquenes exhiben una amplia variedad morfológica que se extiende desde los tipos rudimentarios hasta los altamente diferenciados. Como respuesta a la unión que se establece entre los simbiontes y el papel predominante que juega el componente fúngico dentro de la morfogénesis (VALENCIA-AGUIRRE, 2002). La unión de los dos simbiontes se realiza mediante un proceso complejo de liquenización, que presenta numerosas fases, las cuales se describen a continuación en el siguiente cuadro (MARCANO ,1994): FASE DE PRE-CONTACTO: Estimulación por parte del alga y respuesta tigmotrófica del hongo FASE DE CONTACTO: Reconocimiento y aglutinación. FASE DE ENVOLTURA DEL ALGA POR EL MICOBIONTE: Desarrollo de haustorios. FASE DE INCORPORACIÓN DE AMBOS SIMBIONTES PARA LA FORMACIÓN DE UNA MATRIZ COMÚN: Integración. Fase soredial.
  • 28. FASE DE FORMACIÓN Y DIFERENCIACIÓN DEL TALO. TABLA 3. FASES DE FORMACION DE UN TALO. (FERRARO, INSTITUTO DE CIENCIAS BOTANICAS, 2000) El talo puede presentar una estratificación con zonas bien delimitadas, con un estrato algal superior y una médula formada por hifas del hongo, éstos son talos heterómeros. Este es el tipo de arreglo más común en los líquenes. Si las algas se distribuyen entre las células del hongo sin ninguna orden el talo es homómero. Los talos pueden ser: 1. CRUSTOSOS: con aspecto de costra, muy adheridos al sustrato, pueden ser continuos o fragmentados en placas o areólas. El 65% de las 15.000 especies de líquenes conocidos son crustosos. 2. FOLIOSOS: con aspecto de hojas, muy extendidos, son llamativos y es la forma más común entre los macrolíquenes. 3. FRUTICULOSOS: son talos ramificados, erguidos o pendientes, como arbolitos pequeños o barbas enmarañadas, muy largas. 4. GELATINOSOS: talos gruesos, quebradizos cuando se encuentran secos y muy blandos e hinchados en presencia de agua. 5. TALOS COMBINADOS: crustoso (escamoso o microfilino) y fruticuloso (con apotecios): podecios (Cladonia sp.) o pseudopodecios (Stereocaulon). 6.3. ASPECTOS ECOLOGICOS 6.3.1. Sustratos Liquénicos Se definen como el soporte sobre el cual crecen líquenes. Los sustratos influyen sobre su comportamiento de acuerdo con la textura física y la estabilidad, pH, el contenido
  • 29. mineral, la composición química y la capacidad de retención de agua que ofrecen para su establecimiento. Dada la capacidad de colonizar una amplia variedad de sustratos, han sido ubicados en una amplia clasificación y de uso común (VALENCIA-AGUIRRE, 2002). (ver tabla 4). SUSTRATO TIPO ROCAS O MINERALES SAXÍCOLAS (rupestres o rupículas) * Epilíticos ( encima del sustrato) *Endolíticos (dentro del sustrato) *Calcícolas ( en rocas caliza) *Magnícolas (en serpentina) *Ferrugíneos ( en magnetita) *Calcófilos (en calcopirita) CORTEZA DE ÁRBOLES CORTÍCOLAS Ó CORTICICOLAS *Epifleódico (encima de la corteza) *Endofleódicos (dentro de la corteza) SUELO TERRÍCOLAS MADERA LIGNÍCOLAS BRIOFITAS MUSCÍCOLAS HOJAS EPIFILOS *Folícolas TABLA 4. DISTRIBUCION DE LIQUENES SEGÚN SUSTRATO. (VALENCIA, AGUIRRE, 2002) La distribución de los líquenes en un área tiene mucho que ver con el grado de especificidad que muestra por el sustrato. Las especies que colonizan sustratos indiferenciados tienden a tener una amplia distribución por la mayor oferta de sustratos, mientras que los que prefieren los específicos poseen un radio de distribución más limitado. Por esto se observa que la distribución geográfica de un liquen esta en relación directa con la especificidad que muestra el sustrato (BRODO, 1973). 6.3.2. Resistencia a condiciones extremas
  • 30. La mayoría de los líquenes son tolerantes a iluminaciones extremas, períodos de frío intenso o desecación casi completa, condiciones que son frecuentes en su medio natural. Su capacidad adaptativa es la mayor y la más completa de todos los vegetales en regiones inhóspitas, donde otro tipo de plantas no se desarrollan. Pueden soportar durante el día temperaturas de 60°C y en la noche por debajo de 0°C. Estos rasgos de tolerancia varían de acuerdo con el grado de adaptación a los diferentes hábitats ecológicos (AHMADJIAN, 1966). 6.3.3. Sustancias de los líquenes Los líquenes producen, por su actividad metabólica, varios tipos de compuestos orgánicos, principalmente aromáticos. Entre ellos se incluyen ácidos alifáticos, depsidonas, depsonas, ésteres bencílicos, dibenzofuranos, ácidos úsnicos, xantonas, antraquinonas, terpenoides y derivados del ácido pulvínico. Estas sustancias juegan un papel biológico, comenzando por aceptar que la simbiosis se relaciona con la producción de todas estas sustancias (VALENCIA-AGUIRRE, 2002). De entre todas estas sustancias, son los dépsidos (para y meta), las depsidonas y los ácidos úsnicos hacia los que los liquenólogos han dirigido principalmente su atención, por tratarse de compuestos que solo se han encontrado en los líquenes, con la salvedad de algunos pocos que han sido descritos también en hongos no liquenizados, como el ácido lecanórico (paradépsido), presente en Pyricularia. No obstante, se ha comprobado que cuando estas sustancias se presentan en hongos no liquenizados lo hacen siempre en muy bajas concentraciones. (MANRIQUE REOL, E. 1989.) Las sustancias químicas presentes en los líquenes se localizan como componentes de las membranas celulares en el contenido celular o en forma extracelular, como masas amorfas o cristales, coloras o incoloras. Son insolubles en agua y solubles en solventes orgánicos, la mayoría de sabor amargo. Las sustancias producidas por los líquenes
  • 31. tienen un interés desde el punto de vista de su acción antibiótica. Estas sustancias son activas contra una gran variedad de microorganismos, preferencialmente contra bacterias gram-positivas y hongos. 6.3.4. Uso de los líquenes El uso de los líquenes por parte del hombre ha sido muy variado y conocido desde tiempos muy antiguos, con propósitos alimenticios, curativos y económicos. Las propiedades potenciales o reales de estos organismos han permitido su utilización en medicina en forma de extractos o cocimientos desde las antiguas cultura china y egipcia. Existen numerosos ejemplos. Cetraria islandica, por ejemplo, es utilizada en la medicina homeopática hoy en día para curar diferentes enfermedades, entre ellas la tuberculosis; se sabe que su alto contenido de polisacáridos sirve para la fabricación de harinas de fácil digestibilidad. Usnea longissima ha sido utilizada como expectorante y para curar las úlceras al aplicarse localmente (FILHO-TOLEDO, 1976). Se sabe de la existencia de una enorme cantidad de compuestos bioáctivos sin explorar y que pueden estar en disposición de la industria farmacéutica para utilizar a gran escala médica y comercial (VALENCIA-AGUIRRE, 2002). Desde el siglo XVI los líquenes se han utilizado como materia prima en la industria de cosméticos y perfumes. A varios ácidos liquénicos como el ácido úsnico se le ha encontrado propiedades antibióticas, por lo que las especies Usnea se han considerado activas en el tratamiento de enfermedades. Un buen número de líquenes son utilizados hoy en día como base para la fabricación de cremas, shampoo, desodorantes y pastillas. Sin embargo en vía opuesta también los productos de los líquenes son responsables de enfermedades por contacto como dermatitis y eczemas, y otros problemas de piel caracterizados por hinchazón y enrojecimiento. Especies del género
  • 32. Cladonia se comercializan en grandes cantidades y además es aprovechada en gran medida en la industria del perfume. La amplia gama de actividades biológicas que se les ha atribuido a los líquenes ha despertado el interés por la investigación de estos organismos, confirmando que muchos de los metabolitos que producen son “agentes biodinámicas” con propiedades antibiótica, antiviral, antitumoral, analgésica, antipirética, antiinflamatoria, antioxidante, antiproliferativa, alelopática e inhibidora de enzimas. Acorde a las recientes investigaciones de las actividades biológicas de las sustancias de los líquenes se pueden dividir en: • Actividad Antibiótica: Despidas (INGOLFSDOTTIR, 1985), depsidonas y acido úsnico son activos contra microorganismos Gram-positivos, drogas comercializadas en Europa de compuestos como el benzydimetil son distribuidas como USNO contra ulceras, otitis y mastitis. • Actividad Antitumoral y Antimutagénica: El ácido úsnico, (+)- protoliquenesterinico presentan una actividad antitumoral y antimutagénica considerable. • Actividad inhibición enzimatica: Las siguientes sustancias de los líquenes presentan una actividad de inhibición: ácido lecanorico, ácido úsnico y extractos de la Vulpicida Juniperinus, Hypogymnia Physodes y Letharia Vulpina. • Actividad contra el Síndrome de Inmunodeficiencia Humana (VIH): Sustancias químicas derivadas del extracto de la Umbilicaria esculenta inhiben el efecto citopatológico del VIH in Vitro (Hirabayashi, 1998).
  • 33. • Actividad Antialergica: Numerosas sustancias de los líquenes presentan esta actividad ellas se encuentran: la atranorina, parietrina, ácido úsnico y ácido protoliquenesterinico. 6.3.5. Habitats de los líquenes Los líquenes se encuentran en todos los ecosistemas y regiones de vida colombianas; son componentes muy conspicuos de la flora. La mayor expresión la exhiben en las regiones de la vida andina y paramuna, en lo que respecta a líquenes foliosos y fructicosos. La mayoría de los líquenes son terrestres, algunos se dan cerca de caídas de agua. Su tamaño varía mucho, desde pocos milímetros hasta varios centímetros. Existe una clara zonación florística de estos organismos a lo largo del gradiente altitudinal; los líquenes comienzan a ser comunes a medida que se incrementa la altitud y el óptimo esta entre 3.000 y 4.000 metros. Entre 1.000 y 2.000 metros el número de especies de Heterodermia Leptogium y Parmotrema aumentan. Por encima de los 2.000 metros en la zona de la andina baja, media y alta, es elevada la frecuencia de los líquenes foliosos Parmeliaceae, Stictaceae, Lobariacae y Collemataceae, siendo por lo general dominantes (VALENCIA-AGUIRRE, 2002). 6.4. QUIMIOTAXONOMIA 6.4.1. Química de los líquenes La quimiotaxonomia ha jugado un papel importante en la compresión de grupos que pertenecen a las categorías taxonómicas superiores, en los líquenes se ha enfocado en
  • 34. el uso taxonómico de los datos de metabolitos a los niveles de especie y subespecie. Dentro de los compuestos liquénicos producto del metabolismo del liquen se encuentra los llamados ácidos liquénicos y otros tipos de sustancias orgánicas. Se conoce la constitución química de 220 metabolitos secundarios encontrados en los líquenes, los más comunes y conocidos son la atranorina y la parietrina y los ácidos úsnico, rizocárpico, norstíctico, thamnólico, barbárico, vulpínico, entre otros. (BARRENO 1997, VALENCIA AGUIRRE 2002). Varios de los metabolitos anteriormente nombrados presentan propiedades biológicas importantes con relación ha esto varios de estos compuestos han sido estudiados para determinar su actividad antioxidante. Algunos de los compuestos mencionados con anterioridad se muestran en la figura 1. FIGURA1. ESTRUCTURAS DE METABOLITOS SECUNDARIOS AISLADOS DE LÍQUENES.
  • 35. NEELAKANTAN (1965) presentó una importante contribución sobre la clasificación de las sustancias liquénicas, a nivel de grupos así: 1. Serie alifática • Grupo 1- Ácidos Carboxílicos • Grupo 2-Derivados de carbohidratos • Grupo 3- Compuestos sulfurados 2. Serie carbocíclica • Grupo 1- Isoprenoides alicíclicos • Grupo 2- Dépsidas • Grupo 3- Quinonas 3. Serie heterocíclica oxigenada • Grupo 1- Derivados del ácido tetrónico • Grupo 2- Depsidonas • Grupo 3- Depsonas • Grupo 4- Dibenzofuranos • Grupo 5- Xantonas • Grupo 6- Chromonas 4. Serie heterocíclica nitrogenada 6.4.2. Test de Coloración El test de coloración es un método rutinario, simple. Se orienta exclusivamente a detectar microscópicamente la presencia de grupos de compuestos químicos, que se presentan dentro de un grupo taxonómicamente dado, evidenciado por los cambios de
  • 36. color (VALENCIA-AGUIRRE, 2002). El test de coloración indica la presencia o ausencia de sustancias alifáticas y aromáticas. Rutinariamente se emplean cuatro test de coloración para sustancias liquenicas, cuya denominación convencional es: test K, test C, test KC y test P o PD. Los test C, K y KC fueron descubiertos por NYLANDER (1866, citado por SANTESSON, 1973). Los test de PD o (P) fue introducido por ASAHINA (1934). Estas pruebas se llevan a cabo aplicando el reactivo apropiado directamente sobre un fragmento liquénico, por medio de una varilla de vidrio puntiaguda o haciendo una incisión al talo o la apotecio. Las reacciones color obtenidas dependen de cierta forma de la concentración y localización de las sustancias liquenicas en el talo; la corteza o médula deben ser tratadas a parte y para su observación es mejor hacerlo bajo estereoscopio (VALENCIA-AGUIRRE, 2002). Los cambios de coloración (amarillo, anaranjado, rojo, violeta) se consideran positivos e indican la presencia de un grupo de compuestos determinados; se consideran negativo si no hay cambio de color. • Test C: Se emplea como reactivo una solución acuosa saturada de hipoclorito de sodio o calcio. Como sustituido puede usarse blanqueador líquido comercial. Las reacciones de color obtenidas por este test son inestables. • Test K: Se usa como reactivo una solución acuosa de hidróxido de potasio. • Test KC: Es una mezcla de hipoclorito de calcio con hidróxido de potasio. Primero se aplica K e inmediatamente C. • Test P o PD: Se utiliza como reactivo la fenilenodiamina en una solución alcohólica fresca al 5%. Actualmente se emplea un reactivo más estable denominado mezcla de Steiner. En la siguiente tabla se resume la reacciones de las pruebas de coloración de algunas sustancias liquénicas; sin embargo sólo indica los grupos de compuestos (SANTESSON, 1973; VALENCIA-AGUIRRE, 2002).
  • 37. REACCION COMPUESTOS Pigmentos K+ Rojo a violeta Antraquinonas, Bisantraquininas, terpenilquinonas naftoquinonas, pyxiferina K+,KC+ Xantonas,Sordidona K+,PD+,K+ Ácidos úsnicos Compuestos Incoloros PD+,K+ Despidas:ácido alectoriálico,atranorina ácido baeomicico,ácido barbatólico cloroatranorina,ácido descarboxithamnólico ácido emathamnólico, nefroarctina ácido thamnólico Depsidonas:ácido constíctico, ácido fumar- protocetrárico,ácido norstíctico ácido fisodálico,ácido salazinico ácido stictico,ácido virénsico PD+,K- Pannarina,ácido psorómico,ácido fumar protocetrarico ácido protocetrarico, ácido virensico PD-,K+,C+ Ácido critoclorofaeíco,ácido hiascico ácido hipomnólico (K+violeta) ácido meroclorofaeíco,ácido paludósico ácido ramalinolico,scrobiculina PD-,K-,C+ Rojo Ácido anziáico,ácido4-O-dimetilbarbático eritrina,etilorcelinato,ácido gyrofórico ácido lecanorico,montagnetol,ácidoolivetorico, Siphulina. PD-,K-,C+ Verdoso Ácido didymico,ácido pannarico,ácido strepsilina PD-,K-,C+ Azuloso Ácido diploschistesico PD-,K-,C-,KC + Ácido alectóronico,ácido a-collatolico ácido glomeliférico,ácido lobárico ácido 4-O-metilfisódico ácido microphillinico,ácido physidico norlobaridona,ácido picroliquénico TABLA 5. TEST DE COLORACION (SANTENSSON, 1973) 6.4.3. Cristalización
  • 38. La cristalización es el proceso de separación de un soluto a partir de una solución, por sobresaturación, concentración o enfriamiento de la misma. La cristalización permite separar soluto a partir de una solución, en forma prácticamente pura. Existen varias formas de sobresaturar una solución para que esta comience a cristalizar fracciones de soluto: por saturación de solución en caliente y posterior enfriamiento de la misma. Por concentración de la solución, mediante la evaporación de una parte del solvente. Por adición de una substancia de mayor solubilidad en el solvente, que el compuesto que se desea separar. Cuanto más lento sea el enfriamiento de la solución saturada, más grandes y puros serán los cristales del sólido que se separa. 6.4.4. Técnicas cromatográficas Debido a la gran diversidad de técnicas cromatográficas las cuales posibilitan el aislamiento de estos metabolitos secundarios, la cromatografía se ha convertido en la técnica microquímica más utilizada en las determinación de muchas sustancias liquénicas, debido a su sensibilidad, rapidez y relativa simplicidad del equipo utilizado (VALENCIA, AGUIRRE 2002). La palabra Cromatografía significa "Escribir en Colores" ya que cuando fue desarrollada los componentes separados eran colorantes. Los componentes de una mezcla pueden presentar una diferente tendencia a permanecer en cualquiera de las fases involucradas. Mientras más veces los componentes viajen de una fase a la otra (partición) se obtendrá una mejor separación. En todas las técnicas cromatográficas hay una fase móvil que consiste en un fluido (gas, líquido o fluido supercrítico) que arrastra a la muestra a través de una fase estacionaria que se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido. Los componentes de la mezcla interaccionan con distinta forma con la fase estacionaria y con la fase móvil. De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a
  • 39. distintas velocidades y se van separando (S. DOUGLAS ,1995). Después de haber pasado los componentes por la fase estacionaria y haberse separado pasan por un detector que genera una señal que puede depender de la concentración y del tipo de compuesto. La cromatografía en sus diversas modalidades constituye hoy por hoy, una de las herramientas analíticas más potentes que se conocen. Las técnicas cromatográficas pueden clasificarse de diversas formas: 6.4.4.1. Cromatografía en capa fina Un importante papel es una técnica nueva, la cromatografía en capa fina, con mucha mayor sensibilidad y capacidad resolutiva, que, aunque conocida con anterioridad, no fue aplicada al estudio de la química de los líquenes hasta el comienzo de la década de los setenta (CULBERSON & KRISTINSON, 1970; CULBERSON, 1972; MENLOVE, 1974, CULBERSON & AMMANN, 1979). Esta técnica permitió el descubrimiento y caracterización de sustancias nuevas que habían pasado inadvertidas, mediante el uso de la cromatografía en papel, quizá por problemas de solapamiento o por bajas concentraciones. 6.4.4.2. Cromatografía en columna La cromatografía es una técnica que se emplea en el fraccionamiento de compuestos orgánicos. Consiste en la aplicación de una muestra en una columna de cristal en la que se ha situado una matriz sólida porosa que está inmersa en el solvente (SKOOG, DOUGLAS 2003). A continuación se bombea una gran cantidad de solvente a través de la columna Los diferentes compuestos se van retrasando de manera distinta según sus
  • 40. interacciones con la matriz, por lo que pueden ser recogidas separadas a medida que son eluídas por el fondo de la columna (ver figura 2.). Según la matriz escogida, los compuestos se pueden separar de acuerdo a su carga, su hidrofobicidad, su tamaño o su capacidad de unirse a grupos químicos particulares. En la cromatografía en columna se utilizan los siguientes términos: Matriz de la columna: Sustancia que está empapada de solvente y que se empaqueta en la columna. También se denomina el lecho de la columna. Longitud de la columna: Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna. Es importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco importante en otras como la cromatografía de afinidad. Volumen de la columna: Volumen total de gel que se empaqueta en una columna cromatográfica. Volumen muerto de la columna: Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente. Coincide con el volumen de solvente que sale de la columna desde que se aplica la muestra hasta que empieza a salir la primera proteína. En general, y dependiendo del tipo de cromatografía puede ser de 1 a varias veces el volumen de la columna (SKOOG, DOUGLAS 2003).
  • 41. FIGURA 2. CROMATOGRAFIA EN COLUMNA. (SKOOG, DOUGLAS 2003). De las muchas variantes que se conocen en la actualidad, son de particular importancia en este trabajo la cromatografía en placa preparativa, cromatografía bidimensional (ver figura 3) y cromatografía flash de mediana presión. Todas estas técnicas conservan el mismo principio de elución, pero su utilización depende tanto de la naturaleza de la muestra como de las posibles variantes que se presenten a lo largo del proceso. FIGURA 3. CROMATOGRAFIA EN PLACA BIDIMENSIONAL. (SKOOG, DOUGLAS 2003). 6.4.5. Técnicas espectroscópicas La caracterización y la elucidación estructural de los metabolitos secundarios aislados de la especie de liquen seleccionada se realiza mediante la determinación de sus propiedades físicas color, apariencia, puntos de fusión, datos espectroscópicos (RMN 1 H, RMN 13 C). 6.4.5.1. Espectroscopía infrarroja (Espectroscopía IR) Es la rama de la espectroscopía que trata con la parte infrarroja del espectro electromagnético. Esta cubre un conjunto de técnicas, siendo la más común una forma
  • 42. de espectroscopía de absorción. Así como otras técnicas espectroscópicas, puede usarse para identificar un compuesto e investigar la composición de una muestra. Para medir una muestra, un rayo de luz infrarroja atraviesa la muestra, y se registra la cantidad de energía absorbida en cada longitud de onda. Esto puede lograrse escaneando el espectro con un rayo monocromático, el cual cambia de longitud de onda a través del tiempo, o usando una transformada de Fourier para medir todas las longitudes de onda a la vez. A partir de esto, se puede trazar un espectro de transmitancia o absorbancia, el cual muestra a cuales longitudes de onda la muestra absorbe el IR, y permite una interpretación de cuales enlaces están presentes. (GROS, POMILIO, SELDES, BURTON 1985). Esta técnica funciona exclusivamente con enlaces covalentes, y como tal es de gran utilidad en química orgánica. Espectros nítidos se obtienen de muestras con pocos enlaces activos al IR y altos niveles de pureza. Estructuras moleculares más complejas llevan a más bandas de absorción y a un espectro más complejo. Sin embargo esta técnica no se ha podido utilizar para la caracterización de mezclas muy complejas. 6.4.5.2. Espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) Es una técnica empleada principalmente en la elucidación de estructuras moleculares, aunque también se puede emplear con fines cuantitativos. Algunos núcleos atómicos sometidos a un campo magnético externo absorben radiación electromagnética en la región de las frecuencias de radio o radiofrecuencias. Como la frecuencia exacta de esta absorción depende del entorno de estos núcleos, se puede emplear para determinar la estructura de la molécula en donde se encuentran éstos.
  • 43. Para que se pueda emplear la técnica los núcleos deben tener un momento magnético distinto de cero. Esta condición no la cumplen los núcleos con número másico y número atómico par. Los núcleos más importantes en química orgánica son: ¹H, 13 C, 31 P, 19 F y 15 N. Otros núcleos importantes: 29 Si, 77 Se, 117 Sn, 195 Pt, 199 Hg, 203 Tl, 205 Tl, 207 Pb. 6.4.5.3. Espectroscopia Ultravioleta El espectro Ultravioleta y Visible de las moléculas está asociado a transiciones electrónicas entre los diferentes niveles energéticos en ciertos grupos o átomos de la molécula y no caracterizan a la molécula como entidad. En contraste la absorción de energía en la región Infrarroja estimulan la molécula completa y causa cambios vibracionales y rotacionales en esta lo cual caracteriza la entidad estructural de dicha molécula. Los grupos de átomos que dan origen a la absorción en el UV cercano o UV de cuarzo, se conocen como grupos cromóforos. La mayoría de los grupos insaturados y heteroatómicos que tienen pares de electrones no compartidos, son cromóforos potenciales y estos grupos son la base de la elucidación de grupos estructurales en las moléculas activas en el UV cercano. El espectro Ultravioleta de una molécula se obtiene generalmente en forma adicional al espectro infrarrojo de la misma especie. Este espectro IR frecuentemente sirve como dato confirmativo de la ausencia o presencia de ciertos grupos funcionales. En algunos casos la espectroscopia UV puede ser fundamental para el estudio de ciertos problemas específicos. Por ejemplo en la industria de los cosméticos, tintes,
  • 44. colorantes y pinturas. El estudio de los grupos auxocromos y de su influencia en el desplazamiento de ciertos compuestos químicos hacia la región visible hacen de esta técnica una de las de mayor interés en ésta área. (SKOOG, D. A.; LEARY J.J. HOLLER F. JAMES) 6.5. TECNICAS DE COLECCIÓN Y ESTUDIO Para coleccionar líquenes se deben tener en cuenta las siguientes recomendaciones. 6.5.1. Materiales Bolsas de papel, bolsas plásticas, navaja o cuchillo, martillo geológico, cincel, marcador a prueba de agua, lupa de campo, libreta de notas, lápiz, reactivos. 6.5.2. Datos de campo • Localidad: país, departamento, estado, provincia, vereda, finca, kilometraje a la localidad mas cercana, coordenadas geográficas. • Hábitat: descripción breve del tipo de bosque (primario, secundario), talud del camino; potrero; condiciones ambientales circundantes, iluminación, humedad. • Sustrato: suelo (tipo si es posible), roca, corteza, hojas (en lo posible el nombre científico y/o vulgar del árbol), parte del árbol. • Altitud: sobre el nivel del mar o en forma aproximada cuando no se conoce. • Fecha: durante la cual se realizó la colección; especificar día, mes y año. • Colector y número de colección: Nombre y apellido del colector o colectores, y el número de colección.
  • 45. Los datos anteriores se deben consignar en una libreta de notas para cada espécimen coleccionado. 6.5.3. Colecta Para colectar un ejemplar liquénico se deben tener en cuenta ciertas condiciones inherentes a cada tipo de liquen: los crustáceos por su unión tan íntima con el sustrato deben retirarse con un fragmento de éste y usar para ello una navaja o cuchillo; cuando se trata de líquenes epilíticos o endolíticos se recomienda utilizar un martillo geológico. Los líquenes se buscan sobre las rocas, en el suelo, en el talud de los caminos, sobre troncos caídos, en las cercas. En el interior de los bosques se recomienda recorrer cuidadosamente todas las partes del árbol (las cortezas, las ramas, el dosel). Para buscar y colectar líquenes gelatinosos es mejor hacerlo después de la lluvia, por cuanto en estado seco son inconspicuos y pueden pasar desapercibidos. Se debe tener precaución con los líquenes foliosos muy secos, puesto que se puede fracturar fácilmente; en estos casos, es mejor humedecerlos un poco o hacer la colecta cuando el ambiente esté más húmedo. Los ejemplares se toman en bolsas plásticas y se marcan con el número de colección correspondiente. La muestra debe ser suficiente y en buen estado; se debe tomar una buena cantidad que llene una bolsa, excepto cuando la población es pequeña; en lo posible debe ser material fértil; no obstante, el material estéril no se debe desechar. Posteriormente las muestras se pasan a bolsas de papel y en ellas se secan a baja temperatura en la estufa o en el aire. No necesitan prensarse. Cuando las condiciones ambientales son favorables, se puede coleccionar directamente en bolsas de papel. Una vez el material esté seco, se puede guardar indefinidamente como material de estudio docente o seguir el proceso habitual para su inclusión en el herbario. Cuando se necesita hacer un estudio microscópico en el laboratorio, se coloca fragmentos de la
  • 46. muestra (cuadrados de 0.5 – 1 cm de lado), apotecios enteros o seccionados (si son grandes) en frascos con FFA (formol, ácido acético, alcohol) o con FPA (formol, ácido propiónico, alcohol). 6.5.4. Estudio del material en el laboratorio Los ejemplares deshidratados y debidamente preservados se pueden utilizar en el laboratorio y seguir las técnicas pertinentes para las cuales se efectúo la colección. En términos generales se puede humedecer parcial o totalmente la muestra; en este caso, se debe ser muy cuidadoso con el material de donde se tomo la porción, para evitar que otros organismos la contaminen y no pueda volverse a utilizar. Los especimenes requeridos en estudios taxonómicos se tratan de manera muy especial, no así aquellos utilizados en la docencia, que pueden ser fragmentados o reutilizados para este propósito. Si se necesita hacer observaciones anatómicas del talo, se realizan cortes transversales a mano alzada, usando pauche como soporte. Los cortes más delgados se escogen para observaciones en el montaje húmedo. Para detectar mejor sus constituyentes, el corte delgado de la muestra se coloca en una solución acuosa de hipoclorito al 0.2-0.5 %; esta sustancia actúa como aclarante y permite visualizar la coloración de las algas y la orientación de las hifas. Para realizar los tests de coloración tenga en cuenta las precauciones de preparación y el manejo de reactivos. (VALENCIA, AGUIRRE 2002).
  • 47. 7. CAPITULO III 7.1. METODOLOGIA La metodología utilizada se muestra en la figura 4. Se explicara a continuación cada uno de los pasos empleados.Colecta y selección de la muestra Extracción (método Soxhlet) Elución del extracto primario crudo en cromatografía en columna (CC) Aislamiento de compuestos por polaridad Clasificación y separación de compuestos en cromatografía en placa (CP) Purificación de compuestos (CC y CP) Elucidación estructural de compuestos (RMN, IR, UV, MP, EM) Prueba de actividad antioxidante (método DPPHo ) de extracto. Ensayo de actividad antioxidante (CP) compuestos impuros. Test de coloración.
  • 48. FIGURA 4. ESQUEMA DE LA METODOLOGIA EMPLEADA. 7.1.1. Colecta y Selección del Liquen Se seleccionó una especie de Liquen perteneciente a la familia Parmotrema a la que no se le ha designado la especie. Con la colaboración de la Dra. Norma Valencia Islas perteneciente al Departamento de Farmacia. Facultad de Ciencias. Universidad Nacional de Colombia. Así mismo, en el Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia se depositará un vaucher de referencia de la especie analizada. La cantidad recolectada de la especie fue de 300.7 g. El material liquénico completamente seco y limpio se trituró en un molino de cuchillas, obteniendo como peso neto 228.3 g; para que posteriormente se obtengan extractos orgánicos mediante un proceso de extracción continua vía Soxhlet en metanol. 7.1.2. Método de extracción Este tipo de extracción se realiza habitualmente en un aparato denominado Soxhlet.
  • 49. FIGURA 5. METODO SOXHLET. (SKOOG, DOUGLAS, 2003) La muestra (LQ) sólida se introdujo en un cartucho poroso (hecho con papel de filtro, que permite al solvente entrar y salir reteniendo al sólido) el cual se colocó dentro del recipiente B (ver figura 5). Se une un balón C a dicho recipiente donde se adicionó el volumen de solvente (250 ml de metanol). Por el extremo superior del recipiente B, se coloca un condensador D. El solvente se calienta; los vapores ascienden por el tubo E, condensan en el refrigerante D y caen dentro del recipiente B impregnando el líquen que se encuentra en el cartucho A. El recipiente B se va llenando lentamente de líquido hasta que llega al tope del tubo F y se descarga dentro del balón C por efecto de sifón, llevando consigo a la sustancia extraída. El proceso se repitió hasta que la extracción se completa. El solvente de extracción se evapora, recuperando así el extracto. Se hicieron 3 (tres) montajes con el fin de acelerar el proceso, con lo cual cada montaje tuvo un tiempo en el soxhlet, hasta el momento en el que se vio claro el solvente mezclado con el liquen. 7.1.3. Elución del extracto primario crudo en cromatografía en columna (CC)
  • 50. 8. CAPITULO IV 8.1. RESULTADOS El Estudio Fitoquímico y Fisicoquímico de Actividad Antioxidante frente al Radical Libre 2,2-difenil-1-picrilhidracilo a nivel de Extracto, se realizo durante un periodo de seis meses, los resultados obtenidos por los integrantes se reportan a continuación: 8.1.1. Estudio Taxonómico Gracias a la colaboración del Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia, se determino que el liquen estudiado presenta la siguiente clasificación taxonómica, según la tabla…. : REIN O FILO CLASE ORDEN FAMILIA GÉNER O ESPECIE FUNGI Ascomycot a Lecanoromycete s Lecanorale s Parmeliacea e Rimelia Cetrata Tabla . Clasificación Taxonómica del LQ Rimelia Cetrata Debido a esto, el género y la especie del líquen estudiado es:
  • 51. RIMELIA CETRATA (syn PARMOTREMA CETRATUM) Figura. LQ Rimelia Cetrata Figura. LQ Rimelia Cetrata parte posterior 8.1.2. Colecta y Selección del Líquen Se colectaron dos clases de material vegetal, la especie analizada (Rimelia Cetrata) y un líquen de género desconocido al que llamaremos Líquen 2 (LQ 2). La cantidad recolectada del líquen Rimelia Cetrata fue de 300.7 g y del líquen 2 fue de 61.2 g peso en bruto, después de la respectiva limpieza y molienda se obtuvo 228.3 g del líquen Rimelia Cetrata y 36.6 g de líquen 2. Los datos anteriormente descritos se observan en la tabla….; a continuación: Tabla . Peso en Gramos de Material Vegetal obtenido 8.1.3. Extracción El método de extracción utilizado fue Soxhlet en metanol, en la tabla…. se observa el número de extracciones, el tiempo transcurrido, junto con los respectivos intervalos de cada material vegetal, hasta la extracción completa. LIQUEN (LQ) MASA DEL LQ FRESCO (g) MASA DEL LQ SECO Y LIMPIO (g) Rimelia Cetrata 300.7 228.3 2 61.2 36.6
  • 52. LIQUEN No DE EXTRACCIONES DISOLVENTE TIEMPO(H) INTERVALOS DE TIEMPO Rimelia Cetrata 1 Metanol 10 2 2 Metanol 12 1 3 Metanol 11 1 4 Metanol 8 1 2 1 Metanol 8 2 Tabla . Tiempo de Líquenes Rimelia Cetrata y LQ 2 en el Sistema Soxlher LIQUEN No DE MONTAJES TIEMPO(HORAS) Rimelia Cetrata 1 8 2 4 42 Tabla. Tiempo de Líquenes en el Método Soxlher Al finalizar la extracción de cada uno de los líquenes se obtuvo los siguientes resultados, en la tabla….. , se observa la cantidad en gramos colectada de cada líquen, posteriormente la cantidad de material vegetal seco, limpio y molido; y por último de la cantidad obtenida de extracto en bruto; se separo 2.5 g con sequedad total de extracto del líquen Rimelia Cetrata para actividad biológica, por diferencia se obtuvo 45 g de extracto en bruto del líquen Rimelia Cetrata. Tabla. Cantidades Obtenidas del LQ Rimelia Cetrata y LQ 2. LIQUEN CANTIDAD DEL LQ FRESCO (g) CANTIDAD DEL LQ SECO Y LIMPIO (g) CANTIDAD DEL EXTRACT O EN BRUTO (g) CANTIDAD DEL EXTRACTO EN BRUTA PARA CC (g) CANTIDAD DEL EXTRACTO EN BRUTO PARA ACTIVIDAD BIOLOGICA (g) Rimelia Cetrata 300.7 228.3 48.583 45 2.5 2 61.2 36.6 6.656 0.216
  • 53. 8.1.4. Aislamiento de Metabolitos Secundarios del LQ Rimelia Cetrata 8.1.4.1 Elución del Fraccionamiento Primario del Extracto en Crudo del Líquen Rimelia Cetrata SISTEMA PROPORCION % FRACCIONES Hexano 100 1-9 Hexano- Tolueno 50-50 10-16 Tolueno 100 17-21 Tolueno- Acetato de Etilo 50-50 22-39 Acetato de Etilo 100 40-49 Acetato de Etilo-Metanol 50-50 50-54 Metanol 100 55-66 Tabla . Elución Del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo del LQ Rimelia Cetrata
  • 54. Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata Sistema Hexano
  • 55. Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata
  • 56. Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata Sistema Metanol Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata Figura. CC Extracto Crudo Rimelia Cetrata FRACCIONES COBINADAS CLAVE 1-10 A 11-15 B 16-18 C 19-22 D 23-37 E 38-46 F 47-54 G 55-60 H 61-66 I Tabla. Clave De Elución Del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo del LQ Rimelia Cetrata FRACCION FRACCION COMBINADA PESO DEL VIAL VACIO (g) PESO DEL VIAL CON MUESTRA (g) PESO DE LA FRACCION(mg) ORDEN DE LAS FRACCIONES DE INTERES
  • 57. A 1-10 5.954 6.030 76 | B 11-15 5.640 5.942 302 C 16-18 5.677 6.307 63 D 19-22 49.175 51.976 2801 E 23-37 51.915 54.279 2364 F 38-46 5.623 7.561 1938 G(ℓ) 47-54 5.392 6.467 1075 G(s) 47-54 28.180 28.652 472 H 55-60 86.49 88.611 2121 I(ℓ) 61-66 137.08 143.353 6271 I(s) 61-66 41.588 45.601 4013 Tabla. Masas del Fraccionamiento Primario Del Extracto Crudo De La Rimelia Cetrata