Poligaracturonasa

Tesis para optar al título de Doctor en Biología Molecular y
Biotecnología

Universidad Nacional de San Martín (UNSAM)

Instituto de Investigaciones Biotecnológicas – Instituto Tecnológico de
Chascomús (IIB-INTECH)

“Caracterización de la expresión poligalacturonasa durante la
maduración de variedades de frutilla con diferente velocidad de
ablandamiento”.

Nombre: Natalia M. Villarreal

Directores: Dres. Pedro M. Civello y Gustavo A. Martínez

Agradecimientos

· A mis directores, los doctores Marcos Civello y Gustavo Martínez por la
oportunidad de realizar mi tesis doctoral en la UB-4. Muchas gracias por el
trato amable de todos los días, por el apoyo, por conservar la curiosidad y las
ganas de seguir aprendiendo, y por la formación que recibí durante estos años.

· A la UNSAM, por el apoyo recibido. A la ANPCyT y al CONICET por
otorgarme una beca que permitió realizar mi doctorado.

· A todos los compañeros y amigos del INTECH, muchas gracias por compartir
sus conocimientos conmigo, y por los momentos que vivimos. Particularmente
agradezco a Mariela y Juan, Kari y Gustavo, Lis, Juli, Cori, Proli, Ana, Tini,
Lean y Emi. A los queridos amigos que estuvieron siempre aun a la distancia,
Naty y Pochy, y Maru y Diegui.

· A Marie Jean Watson y su hermosa familia (muchas gracias por todo amiga).

· A Claudia, muchísimas gracias por compartir conmigo la enorme cantidad de
cosas que sabés, tanto del laboratorio como de la vida (te admiro mucho
amiga).

· A Teresita y a Tora por su amor siempre alegre.

· A la gente de UB-1/UB-3 por ser tan generosos siempre.

· Al grupo de tenis, gracias a Vero, Anita, María, Caro, Naty, y por supuesto a
nuestro profe Guille, por todos los momentos de risas, distensión (muy
importante) y aprendizaje.

· A Cinty, Pablo, Vane, Ale, Vivi, Juan, Jackie, Manolo, y los nuevos integrantes
por su cariño y por la amistad de tantos, tantos años. A todos los amigos que
están en distintas partes del mundo.

· A mi queridísimo amigo Guille, te extraño siempre, me hacés mucha falta.

· A mis cuñados, cuñadas, sobrinos, tíos y primos, gracias por todo.

· A mi hermana, muchas gracias Marcelita por todo, por cuidarme,
comprenderme y apoyarme siempre, te quiero muchísimo. A Sofía, por ser tan
dulce y alegrar e iluminar nuestras vidas.

· A mi papá por transmitirme su cariño y respeto por el trabajo. A mi mamá por
ser tan dulce, atenta conmigo y con los demás, y un sol para mi vida. Gracias a
ambos por el enorme apoyo de siempre. Y gracias a Brisa por estar siempre a
mi lado.

· Finalmente agradezco a Agus, a quien dedico este trabajo, por ser mi amor,
porque somos un equipo, y por tu confianza en que todo va a salir bien.

iii

Publicaciones

Parte de los resultados presentados en esta tesis han sido publicados en

revistas internacionales y presentados como comunicaciones a congresos.

Revistas científicas:

§ Villarreal, N.M., Rosli, H.G., Martínez, G.A., Civello, P.M. 2008.

“Polygalacturonase activity and expression of related genes during

ripening of strawberry cultivars with contrasting fruit firmness”.

Postharvest Biology and Technology 47, 141-150.

§ Villarreal, N.M., Martínez, G.A., Civello, P.M. 2009. “Influence of plant

growth regulators on polygalacturonase expression in strawberry fruit”.

Plant Science 176, 749-757.

§ Villarreal, N.M., Bustamante, C.A., Civello, P.M., Martínez, G.A. 2009.

“Effect of ethylene and 1-MCP treatments on strawberry fruit ripening”.

Journal of the Science of Food and Agriculture (Enviado, los dos

primeros autores contribuyeron de igual manera a este trabajo).

Congresos:

§ Segundas Jornadas de Biología y Tecnología de Post-Cosecha. 26-27

de agosto de 2004. Chascomús. “Estudio comparativo del metabolismo

iv

de pectinas durante la maduración de variedades de frutilla con

diferentes niveles de firmeza”. Rosli, H.G., Villarreal, N.M., Martínez,

G.A., Civello, P.M.

§ XXV Reunión Argentina de Fisiología Vegetal (RAFV). 22-24 de

septiembre de 2004. Santa Rosa. “Metabolismo de pectinas durante la

maduración de frutillas”. Rosli, H., Villarreal, N., Martínez, G., Civello, M.

§ Congreso Internacional “Post Harvest Fruit: the path to success”. 7-11

de noviembre de 2004. Talca, Chile. “Differential expression of genes

and enzymes involved in cell wall degradation during ripening of

strawberry cultivars”. Martínez G.A., Rosli H.G., Villarreal N.M.,

Bustamante C., Dotto M.C., Civello P.M.

§ XLI reunión anual de la Sociedad Argentina de Investigación Bioquímica

y Biología Molecular (SAIB). 3-6 de diciembre de 2005. Pinamar.

“Cloning of two putative polygalacturonase genes and analysis of their

expression during rimpening of strawberry cultivars with contrasting

firmness fruits”. Villarreal, N.M.; Martínez, G.A., Civello, P.M.

§ XXVI Reunión de la Asociación Argentina de Fisiología Vegetal (RAFV).

4-6 de octubre de 2006. Chascomús. “Efecto de reguladores del

crecimiento en la expresión de genes de poligalacturonasa de frutilla y

caracterización de la actividad enzimática correspondiente”. Villarreal,

N.M., Martínez G.A., Civello, P.M.

v

§ IV Jornadas de Biología y Tecnología de Postcosecha y Primeras

Jornadas de Postcosecha del Cono Sur. 5-6 de julio de 2007. Buenos

Aires. “Análisis del efecto de diferentes reguladores del crecimiento

sobre la expresión de genes de poligalacturonasa de frutilla”. Villarreal,

N.M., Martínez, G.A., Civello, P.M.

§ XXVII reunión Argentina de Fisiología Vegetal (RAFV). 21-24 de

septiembre de 2008. Rosario. “Influencia del etileno el contenido de

pigmentos, azúcares y compuestos fenólicos, y actividad de enzimas de

degradación de pared celular de frutilla”. Bustamante, C.A., Villarreal,

N.M., Civello, P.M., Martínez, G.A.

§ XLIV reunión anual de la Sociedad Argentina de Investigación

Bioquímica y Biología Molecular (SAIB). 8-11 de noviembre de 2008.

Córdoba. “Polygalacturonase on strawberry fruit ripening. Effects of plant

growth regulators”. Villarreal, N.M., Martínez, G.A., Civello, P.M.

vi

Índice

Índice

Índice 1
Abreviaturas 5
Neologismos y términos tomados del inglés 7
1. Resumen 9
2. Introducción general 12
2.1. El fruto de frutilla 13
2.1.1. Crecimiento 15
2.1.2. Desarrollo y maduración 15
2.1.3. Cambios en la estructura y composición durante la maduración 16
2.1.3.1. Azúcares 16
2.1.3.2. Ácidos 17
2.1.3.3. Fenoles y pigmentación 18
2.1.4. Actividad respiratoria y acción hormonal 20
2.2. Pared celular vegetal 22
2.2.1. Componentes principales de la pared celular vegetal 23
2.2.2. Metabolismo de la pared celular durante la maduración de frutos 27
2.2.2.1. Principales proteínas con o sin actividad enzimática que modifican
polímeros de la pared celular 29
2.2.2.1.1. Proteínas sin actividad enzimática conocida 29
2.2.2.1.2. Enzimas que actúan sobre hemicelulosas 30
2.2.2.1.3. Enzimas que actúan sobre cadenas laterales 31
2.2.2.1.4. Enzimas que actúan sobre pectinas 32
2.3. Características generales de las poligalacturonasas 33
2.3.1. Familias génicas 34
2.3.2. Poligalacturonasas y maduración de frutos 35
2.3.2.1. Poligalacturonasas y maduración de frutilla 39
3. Hipótesis de trabajo y objetivos 41
3.1. Hipótesis de trabajo 41
3.2. Objetivo general 41
3.3. Objetivos particulares 41
4. Materiales y Métodos 42
4.1. Material Vegetal 42
4.2. Determinación de la actividad poligalacturonasa (PG) 42
4.3. Extracción de ADN genómico 44
4.4. Extracción de ARN total 45

1

Índice

4.5. Cuantificación de ARN 47
4.6. Análisis de ARN total 47
4.7. Transcripción reversa 48
4.8. Reacciones de RT-PCR 49
4.9. Visualización de los productos de PCR 49
4.10. Purificación de los productos amplificados y cuantificación de ADN 50
4.11. Ligación de los productos de PCR 50
4.12. Obtención de células competentes 51
4.13. Transformación de células competentes 52
4.14. Extracción de ADN plasmídico 52
4.15. Reacciones empleando enzimas de restricción 54
4.16. Ensayos de Northern-blot 54
4.16.1. Transferencia de ARN a membranas de nailon 54
4.16.2. Preparación de las sondas a utilizar 55
4.16.2.1. Sonda para poligalacturonasas 55
4.16.2.2. Sonda para ARNr 18s 55
4.16.2.3. Marcado de sondas 56
4.16.3. Hibridación de membranas 57
4.17. Ensayos de RT-PCR semicuantitativa 57
4.18. Obtención de las secuencias completas de FaPG1 y T-PG 59
4.19. Secuenciación y análisis bioinformático de los clones obtenidos 60
4.20. Construcción de un árbol filogenético 60
4.21. Números de acceso 61
4.22. Expresión heteróloga 62
4.22.1. Purificación de la proteína recombinante FaPG1 62
4.22.2. Producción del antisuero anti-FaPG1 y purificación del anticuerpo 63
4.22.3. Western-blot 64
4.22.4. Ensayo de deglicosilación 65
4.23. Cuantificación de proteínas 66
4.24. Tratamientos con reguladores del crecimiento vegetal 66
4.25. Antocianinas 68
4.26. Clorofilas 69
4.27. Contenido de azúcares reductores y totales 69
4.28. Compuestos fenólicos totales 70
4.29. Actividad fenilalanina amonio liasa (PAL) 70
4.30. Análisis estadístico 71
4.31. Composición de buffers y soluciones utilizadas 71

2

Índice

5. Capítulo I. Análisis de la expresión y actividad poligalacturonasa durante la
maduración de cultivares de frutilla con niveles de firmeza contrastantes 73
5.1. Introducción 73
5.2. Resultados 75
5.2.1. Actividad Poligalacturonasa 75
5.2.2. Análisis de la expresión poligalacturonasa durante la maduración de
frutilla 77
5.2.2.1 Clonado de los ADNc completos de FaPG1 y T-PG 77
5.2.2.2. Obtención de sondas para poligalacturonasa 81
5.2.2.3. Ensayos de Northern-blot 82
5.2.2.4. Ensayos de RT-PCR semicuantitativa 83
5.2.3. Acumulación de la proteína FaPG1 durante la maduración de frutilla 86
5.2.4. Análisis filogenético 90
5.3 Discusión 93
5.4. Conclusiones 100
6. Capítulo II. Análisis del posible fenómeno de splicing alternativo en el gen
FaPG1 101
6.1.1. Corte y empalme del ARNm precursor (pre ARNm) 101
6.1.2. Propiedades de los intrones de plantas 103
6.2. Resultados 113
6.2.1. Comparación de las secuencias no traducidas 5´ y 3´ de FaPG1 y T-
PG 113
6.2.2. Acumulación de los transcriptos FaPG1 y T-PG durante la maduración
de cultivares de frutilla con diferente velocidad de ablandamiento. 117
6.2.3. Análisis del intrón II de FaPG1 en cultivares con niveles de firmeza
contrastantes 119
6.3. Discusión 122
7. Capítulo III. Influencia de reguladores del crecimiento vegetal en la
expresión poligalacturonasa de frutilla. 128
7.2. Resultados 130
7.2.1. Tratamiento con auxinas y giberelinas 130
7.2.2. Tratamiento con ácido abscícico 134
7.2.3. Tratamiento con óxido nítrico 135

3

Índice

7.2.4. Tratamiento con etileno 137
7.2.4.1. Efecto del etileno sobre la expresión PG 137
7.2.4.2. Efecto del etileno sobre parámetros de la calidad del fruto 140
7.2.4.2.1. Antocianinas, clorofilas y actividad PAL 141
7.3. Discusión 145
8. Conclusión general 153
9. Referencias 154

4

Abreviaturas

Abreviaturas

1-MCP: 1-metilciclopropeno

32
P-dATP: desoxiadenosina trifosfato marcada con 32
P

α-ara: α-arabinofuranosidasa

β-xil: β-xilosidasa

ABA: ácido abscísico

AcH/NaAc: ácido acético/acetato de sodio

ADN: ácido desoxirribonucleico

ADNc: ácido desoxirribonucleico complementario

ARN: ácido ribonucleico

ARNm: ácido ribonucleico mensajero

ASB: albúmina sérica bovina

ATP: adenosina trifosfato

cps: cantidad suficiente para

CTAB: bromuro de hexadeciltrimetilamonio

DEPC: dietil pirocarbonato

DMF: dimetilformamida

DMSO: dimetilsulfóxido

DO: densidad óptica

DTT: ditiotreitol

EDTA: ácido etilendiaminotetracético

ETEFÓN: ácido 2-cloroetilfosfónico

GA3: ácido giberélico

IAA: ácido 3-indol acético

IPTG: isopropil-tio-β-D-galactopiranósido

5

Abreviaturas

LB: medio Luria Bertani

NAA: ácido naftalén acético

PAL: fenilalanina amonio-liasa

pb: pares de bases

PCR: reacción en cadena de la polimerasa (polimerase chain reaction)

PEG: polietilenglicol

PG: poligalacturonasa

PL: pectato liasa

PME: pectin metilesterasa

PMSF: fluoruro de fenilmetil sulfonilo

ppm: parte por millón

PVP: polivinil pirrolidona

PVPP: polivinil polipirrolidona

RT-PCR: transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa (reverse

transcription and polimerase chain reaction)

SDS: dodecil sulfato de sodio

SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS

(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)

UV: ultravioleta

6

Neologismos y términos tomados del inglés


Buffer: solución reguladora de pH, constituida por un par ácido-base

conjugados.

Contig: secuencia de ADN resultante del solapamiento de fragmentos

contiguos provenientes de un mismo gen.

Enhancer: potenciador.

ESTs (expressed sequences tag): secuencias de ADN expresadas.

Non-sense mediated decay (NMD): decaimiento sin sentido del ARNm.

Northern-blot: técnica para medir cantidad y tamaño aproximado de un

transcripto específico en una mezcla compleja mediante hibridación a una

sonda complementaria de ADN o ARN marcada.

RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends): amplificación rápida de los

extremos de ADNc.

Spliceosoma: complejo macromolecular responsable del corte y empalme del

pre ARNm.

Splicing: corte y empalme.

7


Southern-blot: técnica para detectar uno o varios fragmentos específicos de

ADN en una población mediante hibridación a una sonda complementaria de

ácido nucleico marcado.

UTR (untranslated region): region no traducida.

Western-blot: técnica para detectar proteínas específicas de una mezcla
mediante reconocimiento con un anticuerpo específico.

8

Resumen

1. Resumen

La pared celular vegetal es una estructura dinámica que presenta

cambios durante la diferenciación y el desarrollo de los diferentes órganos de

las plantas. El ablandamiento que tiene lugar durante la maduración de los

frutos carnosos se encuentra asociado con la degradación de los diferentes

componentes de la pared.

Los frutos de frutilla (Fragaria x ananassa, Duch) poseen una elevada

velocidad de ablandamiento, la cual contribuye a su rápido decaimiento post-

cosecha. Las bases bioquímicas de la degradación de la pared celular de

estos frutos no se encuentran claramente establecidas aun, y se han

informado resultados contradictorios en diferentes cultivares. Es probable que

la mayor contribución al proceso de ablandamiento, y a las diferencias de

textura observadas entre variedades, provenga de la expresión y actividad

diferencial de genes y proteínas asociados con la degradación de la pared,

tales como poligalacturonasas (PGs), β-xilosidasas, expansinas, pectato liasas,

etc.

Un mecanismo importante de regulación de la expresión génica, es el

fenómeno de corte y empalme alternativo del pre-ARN mensajero (splicing

alternativo). En plantas, dicho proceso se encuentra asociado a funciones

biológicas, tales como crecimiento y desarrollo, respuestas a estrés biótico y

abiótico, resistencia a enfermedades, tiempo de floración, etc. Con respecto al

rol del splicing alternativo en el desarrollo y maduración de frutos, se reportó

la presencia de variantes de splicing en manzana, durazno, y papaya.

En este trabajo de tesis se aislaron dos ADNc completos a partir de

frutos de frutilla. Dichos clones, denominados FaPG1 y T-PG, son homólogos

9

Resumen

a genes de poligalacturonasas de plantas. De acuerdo a nuestras

observaciones, la expresión diferencial de ambos clones estaría asociada al

ablandamiento de frutillas, y a las diferencias de textura observadas entre

cultivares. Se determinó que el gen FaPG1 sufre un evento de splicing

alternativo que conduce a la formación de las variantes FaPG1 y T-PG

(números de acceso DQ458990 y DQ458991, respectivamente). La variante

FaPG1 codifica una proteína funcional (FaPG1), y tanto la acumulación del

mensajero como de la proteína fue mayor, y mas temprana, durante la

maduración de un cultivar que produce frutos blandos con respecto a un

cultivar que produce frutos más firmes. Asimismo, la variante T-PG codificaría

una proteína más corta que FaPG1, la cual carecería del sitio catalítico y los

sitios de N-glicosilación predichos para PGs de plantas. Esta variante de

splicing se acumula en mayor medida durante la maduración de cultivares que

producen frutos mas firmes.

Por otra parte, se observó que la expresión y actividad

poligalacturonasa podría encontrarse bajo la influencia de reguladores del

crecimiento vegetal. El tratamiento con ácido naftalén acético (NAA) redujo la

expresión de FaPG1 y T-PG, la acumulación de la proteína FaPG1, y

disminuyó la actividad PG. El tratamiento con ácido giberélico (GA3) produjo

efectos similares al NAA, si bien no fueron tan marcados. La aplicación de

ácido abscísico (ABA) incrementó ligeramente la expresión de PG, pero no

modificó significativamente la actividad enzimática. Por otra parte, la

acumulación de los transcriptos FaPG1 y T-PG se incrementó

considerablemente en respuesta a los tratamientos con etileno y NO. Los

datos de Western-blot confirmaron estas tendencias, si bien la actividad PG

10

Resumen

total no se modificó significativamente por estos tratamientos. Sin embargo, la

aplicación de 1-MCP (un inhibidor de la percepción del etileno) redujo la

actividad y expresión PG, sugiriendo que el etileno podría desempeñar un rol

en la regulación de la expresión poligalacturonasa durante la maduración de

frutilla.

11

Introducción general

2. Introducción general

Los frutos son de vital importancia para la mayoría de las plantas ya

que protegen a las semillas durante su desarrollo, y posteriormente facilitan la

dispersión de las mismas. Son importantes además para la alimentación de

los animales en general, y constituyen un componente esencial de la dieta de

los seres humanos.

Mientras que la relevancia de los frutos secos radica mayormente en

las semillas que contienen, en el caso de los frutos carnosos son los frutos

en sí mismos los que poseen un valor nutricional y económico intrínseco.

La maduración de los frutos puede definirse como un conjunto de

procesos físico-químicos que ocurren entre la finalización del desarrollo y el

principio de la senescencia, los cuales conducen a cambios en la textura,

aroma, sabor y color de los mismos. Este es el caso de frutos como tomate,

sin embargo en frutos como frutilla, la división entre desarrollo y maduración

no se encuentra claramente definida. Por lo tanto, la maduración puede

considerarse como un proceso de desarrollo continuo, en el cual varias etapas

fisiológicas pueden estar solapadas (Manning, 1993).

Los frutos carnosos son susceptibles al deterioro postcosecha (ya sea

por un ablandamiento excesivo o por el ataque de patógenos), lo que dificulta

el almacenamiento de los mismos y conduce a importantes pérdidas

económicas. Por esta razón, se realiza un gran esfuerzo para intentar

comprender los mecanismos moleculares y bioquímicos que regulan la

maduración de los frutos carnosos. Tal conocimiento se considera

particularmente útil para retrasar o, posiblemente, controlar este importante

proceso fisiológico.

12


2.1. El fruto de frutilla

La frutilla (género Fragaria, familia Rosacea) es un fruto carnoso que

suele agruparse dentro de los denominados frutos blandos, junto con las

moras, arándanos, frambuesas y grosellas. En general, dichos frutos son de

tamaño pequeño, tienen una textura delicada y poseen un tiempo de vida

post-cosecha corto. Desde el punto de vista botánico, la frutilla es un fruto

agregado o fruto falso, originado a partir de la expansión y desarrollo del

tejido denominado receptáculo (Coombe, 1976). Un número variable de

aquenios o frutos verdaderos se encuentran ubicados en la capa epidermal del

receptáculo y se conectan con el interior del mismo a través de fibras

vasculares (Lis y Antoszewski, 1979). Los aquenios son considerados una

combinación de tejido ovárico y semilla (Darrow, 1966). La parte comestible de

la frutilla es el receptáculo, el cual se desarrolla a partir de la base de la flor

(Perkins-Veazie, 1995) (Figura 1).

(A) (B)
Receptáculo

Aquenio
Haz vascular

Figura 1: (A) fruto de frutilla (Fragaria x ananassa, Duch) entero donde se señala el tejido

correspondiente al receptáculo y el aquenio; (B) corte longitudinal de un fruto en el que se

indica el tejido vascular y el aquenio.

13


En la actualidad se cree que existen en el mundo alrededor de 20

especies del género Fragaria, las cuales se agrupan de acuerdo a su ploidía

en: diploide (2n= 14), tetraploide (4n= 28), hexaploide (6n= 42) y octaploide

(8n= 56) (Staudt, 1989). Entre las especies más importantes puede

mencionarse:

- Fragaria vesca, especie diploide nativa de las regiones templadas de

Eurasia y Norteamérica. Posee frutos pequeños y aromáticos.

- Fragaria virginiana, especie octaploide nativa de Norteamérica. Por el

tamaño y sabor de sus frutos se hizo popular entre las tribus nativas y

entre los colonos europeos. A partir del año 1620 comenzó a ser

cultivada en Europa.

- Fragaria chiloensis, especie octaploide nativa de Alaska y California.

Posteriormente comenzó a colonizar ciertas áreas de Hawai, Chile y

Argentina. Las tribus araucanas de Chile domesticaron esta especie

antes de la llegada de los colonos españoles, seleccionando las

variedades que presentaran frutos de mayor tamaño. Los españoles

introdujeron esta especie en Europa en 1700.

- Fragaria x ananassa (o frutilla moderna), es una especie octaploide, y

un híbrido entre Fragaria virginiana (seleccionada por sus frutos

sabrosos) y Fragaria chiloensis (seleccionada por el gran tamaño de

sus frutos). Por la calidad y tamaño superior de sus frutos, es en la

actualidad la principal especie cultivada y comercializada. Existe una

gran cantidad de variedades de frutilla, entre las que podemos

14


mencionar: Camarosa, Pájaro, Toyonoka, Aroma, Selva, Cal Giant 3,

Cal Giant 4, Chandler, Elsanta, etc.

2.1.1. Crecimiento

Durante el desarrollo, los frutos presentan cinéticas de crecimiento

variables entre distintos cultivares de frutilla. En algunos casos son sigmoideas

simples, caracterizadas por un crecimiento inicial lento seguido por una fase

exponencial y luego un periodo en el que la velocidad de crecimiento declina

(Bollard, 1970; Woodward, 1972), y en otros casos son doble sigmoideas,

caracterizadas por dos periodos de crecimiento rápido con una fase intermedia

de crecimiento lento (Coombe, 1976; Perkins-Veazie y Huber, 1987). En

ambos casos, el desarrollo del fruto ocurre rápidamente y llega al tamaño

máximo aproximadamente 30 días después de la antesis (Manning, 1993).

2.1.2. Desarrollo y maduración

En frutilla, el crecimiento del receptáculo luego de la caída de los

pétalos se produce inicialmente debido a una combinación de división y

expansión celular. La proliferación de las células se completa

aproximadamente a los 7 días y posteriormente el crecimiento se produce por

un incremento en el volumen celular, el cual aumenta alrededor de 1000

veces durante el desarrollo (Knee y col., 1977).

Los diferentes estadios de desarrollo y maduración suelen clasificarse

según el tamaño y color superficial del fruto. De esta forma, se denominan

verde pequeño (VP), verde grande (VG), blanco (B), 25% rojo (25% R), 50%

15


rojo (50% R), 75% rojo (75% R), 100% rojo (100% R) y sobremaduro. Estos

últimos cinco estadios se refieren al porcentaje aproximado de superficie del

fruto que presenta coloración roja (Figura 2).

VP VG B 25% R

50% R 75% R 100% R Sobremaduro

Figura 2: Clasificación de los estadios de desarrollo y maduración de frutos de frutilla

de acuerdo al tamaño y color superficial de los mismos.

2.1.3. Cambios en la estructura y composición durante la maduración

2.1.3.1. Azúcares

Al igual que otros frutos, las frutillas actúan como un sumidero para la

acumulación de los productos fotosintéticos generados en las hojas (Lis y

Antoszewski, 1979). Durante el desarrollo del fruto, una gran proporción de

fotosintatos es exportada desde las hojas hacia el receptáculo y una

proporción menor es dirigida hacia los aquenios (Nishizawa y Hori, 1988).

La sacarosa es el principal carbohidrato transportado al fruto (Forney y

16


Breen, 1985a) y, en general, las velocidades de crecimiento se correlacionan

con las velocidades de captura de sacarosa (Forney y Breen, 1985b). En

frutos maduros, sacarosa, glucosa y fructosa constituyen más del 99% de los

azúcares totales solubles, mientras que sorbitol, xilitol y xilosa se encuentran

en muy bajos niveles (Manning, 1993; Cordenunsi y col., 2002). Se reportó

que el almidón se acumula durante las etapas muy tempranas del desarrollo

del fruto (7 días después de la caída de los pétalos), y que la degradación de

los gránulos de almidón predomina fuertemente durante el crecimiento del

receptáculo y en la maduración del mismo (Knee y col., 1977; Souleyre y col.,

2004). Se cree que el almidón es utilizado en las primeras etapas del

crecimiento del fruto hasta que los aquenios estén desarrollados.

Posteriormente, éstos inducen la rápida asimilación de nutrientes desde la

planta (Perkins-Veazie, 1995). Se observó que los frutos no acumulan

cantidades apreciables de azúcares después de la cosecha, ya que en frutos

maduros la degradación de almidón solo aportaría alrededor del 3% del azúcar

total (Cordenunsi y col., 2003; Souleyre y col., 2004). Por otra parte, si bien

los frutos verdes poseen la capacidad de realizar fotosíntesis, aún no se

determinó si este proceso contribuye a la acumulación de carbohidratos

(Perkins-Veazie, 1995).

2.1.3.2. Ácidos

Los ácidos orgánicos determinan el pH del fruto y contribuyen a la

estabilidad del color del mismo. Al igual que los azúcares, son componentes

importantes del sabor, y la relación ácido/azúcar es usada frecuentemente

17


como un índice de la calidad del fruto (Manning, 1993).

En frutilla, los ácidos principales son cítrico, málico y ascórbico, los

cuales son secuestrados en vacuolas y pueden ser utilizados en el proceso de

respiración o convertidos en azúcares (Perkins-Veazie, 1995). La acidez total

se incrementa durante el desarrollo hasta el estadio verde grande y luego

disminuye hasta un mínimo en el estadio sobremaduro, debido principalmente

a una reducción en el contenido de ácido málico (Manning, 1993). El pH de

los frutos maduros varía entre cultivares, en un rango de 3,6 a 4,1

(Cordenunsi y col., 2003).

2.1.3.3. Fenoles y pigmentación

En la actualidad se considera que una dieta rica en frutas y vegetales

está asociada con un menor riesgo de sufrir enfermedades mediadas por un

estrés oxidativo tales como cáncer, enfermedades cardiovasculares y

neurodegenerativas (Lampe, 1999; Zern y Fernández, 2005; Yeh y col., 2009).

Los efectos beneficiosos de las frutas y verduras para la salud son atribuidos,

en gran medida, a los elevados niveles de compuestos fenólicos, los cuales

comprenden un grupo diverso de sustancias, incluyendo entre otros a

polifenoles (taninos), pro-antocianinas (taninos condensados) y ésteres de

ácidos hidrobenzoico e hidroxicinámico (Manning, 1993). Frutos como frutilla,

frambuesa y arándano, contienen en general niveles elevados de compuestos

fenólicos (Kahkonen y col., 2001), y en el caso particular de frutilla, los

principales compuestos fenólicos identificados son: ácido elágico, ácido gálico,

flavonoides y ácido hidroxicinámico (Seeram y col., 2006). Se reportó que las

18


frutillas poseen propiedades antioxidantes, anticancerígenas, antiinflamatorias y

antineurodegenerativas (Hannum, 2004), si bien el contenido de antioxidantes y

la calidad nutricional de los frutos (aporte de vitaminas y minerales)

dependería de cada cultivar (da Silva Pinto y col., 2008; Tulipani y col., 2008).

El contenido total de compuestos fenólicos decrece continuamente durante la

maduración de frutilla, y la disminución más significativa se reportó desde el

estadio verde pequeño al blanco (Spayd y Morris, 1981; Martínez y col.,

2001).

Con respeto a los flavonoides, estos constituyen un grupo de

metabolitos secundarios sintetizados a partir de una molécula de fenilalanina y

tres moléculas de malonil-CoA, a través de lo que se conoce como "vía

biosintética de los flavonoides". La unidad estructural de los flavonoides es

una chalcona, y la acción de la enzima isomerasa la convierte en una

flavanona. El esqueleto básico C6-C3-C6, puede sufrir posteriormente muchas

modificaciones y adiciones de grupos funcionales, por lo que los flavonoides

son una familia muy diversa de compuestos, aunque todos los productos

finales se caracterizan por ser polifenólicos y solubles en agua (Winkel-Shirley,

2001).

Los principales flavonoides presentes en frutilla son las antocianinas,

pigmentos hidrosolubles de localización vacuolar, responsables del color rojo

de los frutos (Woodward, 1972). Las antocianinas actúan además como

agentes antioxidantes, y la cuantificación de las mismas se utiliza

habitualmente como un parámetro para evaluar el progreso de la maduración

de los frutos. Las antocianinas son sintetizadas por la ruta de los

fenilpropanoides, siendo la conversión de L-fenilalanina en ácido trans-cinámico

19


la etapa inicial y una de las etapas reguladoras en la vía de los

fenilpropanoides. Esta reacción implica la eliminación de un grupo amino

catalizada por L-fenilalanina-amonio-liasa (PAL), una enzima clave en la

biosíntesis de compuestos fenólicos (Jones, 1984). La acumulación de

antocianinas en frutos maduros de frutilla se correlaciona con una elevada

actividad PAL (Given y col., 1988a). La síntesis de antocianinas comienza en

el estadio blanco y alcanza su máximo aproximadamente 30 días después de

la antesis (Cheng y Breen, 1991).

2.1.4. Actividad respiratoria y acción hormonal

Los frutos pueden ser clasificados como climatéricos y no-climatéricos

de acuerdo a su actividad respiratoria y producción de etileno. Los frutos

climatéricos (tomate, banana, manzana, etc.) presentan una gran actividad

respiratoria y un pico en la producción de etileno durante su maduración (Fan

y col., 1998; Liu y col., 1999; Alexander y Grierson, 2002). El etileno es una

hormona que desempeña un papel esencial en la regulación de la maduración

de los frutos climatéricos (Giovannoni, 2001). En tomate, la aplicación exógena

de etileno acelera el inicio de la maduración, induciendo un aumento tanto en

la síntesis de pigmentos como en la actividad de enzimas asociadas con la

maduración (Grierson y Tucker, 1983), mientras que la aplicación de

inhibidores de la percepción de dicha hormona (como el tiosulfato de plata o

el 1-MCP), produce el efecto contrario (Hobson y col., 1984, Hobson y

Grierson, 1993, Mostolfi y col., 2003).

La frutilla es clasificada como un fruto no-climatérico (al igual que, por

20


ejemplo, cítricos, uvas y pimientos) debido a que no presenta un incremento

notorio en la producción de etileno y prácticamente no muestra cambios en la

actividad respiratoria a medida que el fruto madura (Abeles y Takeda, 1990).

Sin bien las auxinas son importantes para el crecimiento y la expansión

del receptáculo, son también las hormonas claves que regulan la maduración

de frutilla ejerciendo un efecto inhibitorio (Given y col., 1988b). Estas

hormonas son producidas en los aquenios, y transportadas al receptáculo a

través de la extensa red de haces vasculares. Se reportó que la expresión de

muchos genes específicos de la maduración puede ser regulada negativamente

mediante la aplicación exógena de auxinas (Manning, 1994; Aharoni, 2002). La

auxina de mayor importancia biológica detectada en frutillas es el ácido 3-

indol-acético (IAA), si bien existen derivados del mismo tanto en los aquenios

como en el receptáculo. El contenido de la forma libre del IAA alcanza un

máximo 14 días después de la antesis y luego disminuye marcadamente a

partir del día 17 (Archbold y Dennis, 1984). Se comprobó que cuando los

aquenios son removidos de la mitad de un fruto verde, se produce un

aumento en la velocidad de maduración en la mitad deaquenada, que se

manifiesta a través de un incremento en la velocidad de degradación de

clorofilas, acumulación de antocianinas e inducción de PAL (Given y col.,

1988b, Manning, 1994). Este efecto puede ser revertido mediante la aplicación

de auxinas sintéticas, como el ácido 1-naftalen-acético (NAA), sobre la

superficie sin aquenios del fruto (Given y col., 1988b).

La información respecto a la regulación de la maduración de frutos no

climatéricos es escasa, pero los datos disponibles indicarían que no existe un

único modelo de regulación hormonal para todos estos frutos. En el caso de

21


frutilla, no parece haber un único regulador que desempeñe un papel positivo

análogo al desempeñado por el etileno en los frutos climatéricos. Inclusive, no

se descarta la influencia del etileno en la maduración de este fruto, y se

sugirió que una pequeña cantidad de etileno producida por los frutos de

frutilla, podría ser suficiente para disparar respuestas fisiológicas relacionadas

con la maduración (Tian y col., 1997; Trainotti y col., 2005).

Otros reguladores del crecimiento vegetal son el ácido giberélico y el

ácido abscísico. Se ha reportado que el ácido giberélico tiene un efecto

inhibitorio en la maduración de frutilla, evidenciado por un retraso en la

síntesis de antocianinas y en la degradación de clorofilas (Martínez y col.,

1994). Con respecto al ácido abscísico (ABA), se sugirió que el ABA

endógeno podría jugar un papel en el desarrollo de color de frutilla a través

de la regulación positiva de la síntesis de etileno y la actividad PAL (Jiang y

Joyce, 2003). Por otro lado, la aplicación de óxido nítrico (NO), una molécula

involucrada en diversos procesos fisiológicos (Leshem y Haramaty, 1996;

Leshem y Pinchasov, 2000; Neill y col., 2002; Gniazdowska y col., 2007),

podría extender la vida postcosecha de frutos de frutilla maduros (Wills y col.,

2000; Zhu y Zhou, 2007).

2.2. Pared celular vegetal

La pared celular de las plantas es una estructura que determina la

forma de las células y las mantiene unidas, provee fuerza mecánica y rigidez,

y actúa como una barrera contra el ataque de patógenos. La pared celular

primaria (característica de células en crecimiento) es una red de microfibrillas

22


de celulosa (donde regiones altamente cristalinas alternan con regiones menos

organizadas) embebida en una matriz hidrofílica de hemicelulosas y pectinas

(Cosgrove, 1998). En plantas dicotiledóneas, la composición general de la

pared celular primaria es aproximadamente: 30% de celulosa, 30% de

hemicelulosas, 35% de pectinas y 5% de proteínas estructurales, aunque en

paredes celulares de frutos el contenido de pectinas puede ser

sustancialmente mayor y el de proteínas menor (Knee y Bartley, 1981; Fry,

1988).

2.2.1. Componentes principales de la pared celular vegetal

Celulosa: es un polímero lineal formado por residuos de D-glucosa

unidos por enlaces glicosídicos b-(1®4). Estos glucanos lineales se asocian

entre sí mediante enlaces por puente de hidrógeno para formar microfibrillas

de al menos 36 cadenas de glucano. La celulosa otorga resistencia mecánica

a la pared celular vegetal (Carpita, 1987).

Hemicelulosas: constituyen un grupo heterogéneo de polisacáridos

flexibles y fuertemente unidos a través de enlaces por puente de hidrógeno a

la superficie de las microfibrillas de celulosa (Varner y Lin, 1989). Las

hemicelulosas pueden unirse a dos microfibrillas de celulosa adyacentes de tal

manera de formar una red y evitar, por otro lado, contactos directos entre las

mismas.

Algunas hemicelulosas pueden quedar atrapadas dentro de las

microfibrillas de celulosa, disminuyendo el ordenamiento cristalino de las

23


mismas (Hayashi, 1989).

En paredes celulares primarias de plantas dicotiledóneas, la principal

hemicelulosa es el xiloglucano, un polímero formado por un esqueleto de

residuos de D-glucosa en uniones b-(1®4), al igual que la celulosa, pero

sustituido de forma regular por cadenas cortas de a-D-xilosa, b-D-galactosa y

a-L-fucosa en el carbono 6 de los residuos de glucosa del esqueleto de

glucano (Fry, 1988). En una proporción mucho menor se encuentran presentes

otras hemicelulosas que incluyen: xilanos (formados por un esqueleto de D-

xilosa en uniones b-(1®4), el cual puede contener ramificaciones de arabinosa

u otros azúcares), glucomananos y galactomananos (Fischer y Bennet, 1991).

Pectinas: constituyen un grupo heterogéneo de polisacáridos que se

caracterizan por contener azúcares acídicos, tales como ácido galacturónico, y

azúcares neutros, tales como ramnosa, galactosa y arabinosa. Las pectinas

son los polisacáridos más solubles de la pared celular, y pueden ser extraídas

con agua caliente, agentes quelantes o ácidos diluidos (Fischer y Bennett,

1991).

Las pectinas más importantes de la pared celular vegetal son:

- Homogalacturonanos: son polímeros lineales formados por residuos de

ácido D-galacturónico en uniones a-(1®4). El grupo carboxilo del C6 puede

estar esterificado con un grupo metilo. El proceso de de-esterificación permite

que las pectinas formen geles hidratados, en los cuales los grupos

carboxilatos de moléculas de homogalacturonanos vecinas se unen

iónicamente a través de puentes de Ca2+ en intervalos regulares (Fry, 1988).

- Ramnogalacturonanos I (RG I): son pectinas muy abundantes

24


constituidas por un largo esqueleto de subunidades repetidas de disacáridos

(1®2)-a-L-ramnosil-(1®4)-a-D-galacturónico, con largas cadenas laterales de

arabinanos y arabinogalactanos unidas a los residuos de ramnosa (Brummell y

Harpster, 2001).

- Ramnogalacturonanos II (RG II): son heteropolímeros altamente

complejos formados por un esqueto de (1®4)-a-D-galacturónico, como los

homogalacturonanos, pero con complejas cadenas laterales integradas por

varios tipos de azúcares neutros. Los RG II son componentes minoritarios de

la pared celular vegetal, pero la complejidad de los mismos sugiere que éstos

podrían tener otras funciones además de la estructural, pudiendo actuar como

moléculas de señalización celular (Brummell y Harpster, 2001; Cosgrove,

1998).

Proteínas estructurales: la pared celular vegetal contiene varios tipos de

proteínas estructurales, las cuales son clasificadas usualmente por su

composición predominante de aminoácidos en, por ejemplo, glicoproteínas ricas

en hidroxiprolina, proteínas ricas en glicina, proteínas ricas en prolina, etc.

Estas proteínas presentan grandes variaciones en su abundancia dependiendo

del tipo celular, del estadio de desarrollo y de la estimulación previa que haya

recibido la planta (heridas, ataque por patógenos, etc.) (Cosgrove, 1998).

El modelo de arreglo tridimensional de pared celular vegetal primaria

actualmente más aceptado se representa en la figura 3. Este modelo postula

que la pared está formada por microfibrillas de celulosa recubiertas y

entrecruzadas por las hemicelulosas de la matriz, principalmente por

25


xiloglucano, el cual se une fuertemente a la celulosa a través de enlaces de

hidrógeno. Las moléculas de hemicelulosas pueden unir distintas microfibrillas

de celulosa adyacentes, actuando como puente y contribuyendo a que las

mismas se mantengan unidas. Las otras hemicelulosas, como xilanos,

glucomananos y galactomananos están presentes en cantidades menores y

entrecruzan a las microfibrillas mediante puentes de hidrógeno, aunque de

forma más débil que el xiloglucano. Los espacios en la red de celulosa/matriz

de glicano están rellenos por pectinas altamente hidratadas, las cuales

también forman una red que se mantiene unida por enlaces covalentes del

tipo éster, por enlaces por puente de hidrógeno y por interacciones de tipo

iónico. Las redes de celulosa/matriz de glicano y de pectinas podrían

mantenerse unidas por enlaces covalentes entre algunas moléculas de

xiloglucano y pectinas. Adicionalmente, las proteínas estructurales podrían

formar otra red (Carpita y McCann, 2000).

26


Microfibrilla de celulosa Hemicelulosas Pectinas

Proteínas estructurales

Figura 3: Diagrama de la pared celular vegetal primaria. Se señalan las microfibrillas de

celulosa recubiertas y entrelazadas por las moléculas de hemicelulosa (principalmente por

xiloglucano). Las pectinas forman una red altamente hidratada a través de los diferentes

enlaces químicos mencionados en el texto. Se indican, además, las proteínas estructurales.

Adaptado de Carpita y McCann (2000).

2.2.2. Metabolismo de la pared celular durante la maduración de frutos

Durante la maduración de los frutos carnosos, los polímeros que

componen la pared celular sufren modificaciones progresivas, detectándose

tanto solubilización como depolimerización de los diferentes componentes. La

naturaleza y extensión de estos cambios varía entre las distintas especies y

aún entre variedades de una misma especie. El ablandamiento que sufren los

frutos durante la maduración está caracterizado por una disminución en la

firmeza de los tejidos (Wakabayashi, 2000). El proceso de ablandamiento de

la mayoría de los frutos es acompañado por la pérdida de adhesión celular, la

cual es producida por la degradación de la lámina media. Los polisacáridos

pécticos, y en particular los poliurónidos, son los constituyentes principales de

27


la lámina media (figura 4). Actualmente se propone que la degradación de

xiloglucanos iniciaría el proceso de ablandamiento de los frutos, mientras que

la degradación de las pectinas contribuiría principalmente al ablandamiento

hacia el final de la maduración y en los estadios sobremaduros (Wakabayashi,

2000).

Pared celular primaria

Lámina Media
Zona rica en
pectinas

Figura 4: Vista de la pared celular mediante microscopía electrónica de transmisión. La lámina

media se forma durante la división celular y crece coordinadamente a medida que la célula se

expande. Las células se mantienen en contacto a través de la lámina media, y las zonas de

confluencia de células de tejido jóvenes se encuentran ocupadas por polisacáridos ricos en

pectinas. Adaptado de Carpita y McCann (2000).

La velocidad de ablandamiento de los frutos es el principal factor que

determina el deterioro post-cosecha, el cual influencia la susceptibilidad al

ataque por patógenos, la frecuencia de cosecha y la vida útil de los frutos

una vez cosechados. El proceso de ablandamiento limita, además, el

transporte y almacenamiento de los frutos (Fischer y Bennett, 1991, Brummell

y Harpster, 2001).

28


2.2.2.1. Principales proteínas con o sin actividad enzimática que modifican

polímeros de la pared celular

Durante la maduración de los frutos, los cambios producidos en la

solubilidad y el tamaño molecular de los polímeros de la pared celular

implican la acción coordinada de distintas proteínas y enzimas con la

capacidad de degradar componentes específicos de la pared (Fischer y

Bennett, 1991; Brummell y Harpster, 2001).

2.2.2.1.1. Proteínas sin actividad enzimática conocida

Expansinas: estas proteínas, de actividad enzimática desconocida,

provocarían la ruptura reversible de los enlaces por puente de hidrógeno que

unen las microfibrillas de celulosa con las hemicelulosas de la pared celular

vegetal (McQueen-Mason y Cosgrove, 1994, Cosgrove, 2000). De esta

manera, las expansinas serían importantes en los procesos que requieren

desmantelamiento de la pared celular, tales como el crecimiento de la raíz y

el tallo, la abscición de hojas, la germinación de las semillas y la maduración

de los frutos (Rose y col., 1997; Cosgrove, 2000). Se sugirió que la

acumulación de expansinas relacionadas con la maduración es un rasgo

común de este proceso en la mayoría de los frutos (Civello y col., 1999; Rose

y col., 2000).

29


2.2.2.1.2. Enzimas que actúan sobre hemicelulosas

Endo-(1®4)b-D-glucanasas (EGasas, EC 3.2.1.4): catalizan la hidrólisis

de los enlaces internos de cadenas de glucanos unidos por enlaces b-(1®4),

adyacentes a residuos de D-glucosa no sustituidos. Es frecuente que se haga

referencia a estas enzimas como celulasas, sin embargo la mayoría de las

endoglucanasas de plantas superiores carecen del dominio de unión a

celulosa encontrado en celulasas microbianas, y por lo tanto no pueden

degradar microfibrillas cristalinas de celulosa (Brummell y col, 1994). De esta

forma, se sugiere que los sustratos naturales de estas enzimas son el

xiloglucano y las regiones no cristalinas de las microfibrillas de celulosa

(Brummell y Harpster, 2001). La actividad endoglucanasa aumenta durante la

maduración de frutilla y manzana (Abeles y Takeda, 1990). En el caso de

frutilla, se detectó una elevada expresión de genes que codifican endo-(1®4)b-

D-glucanasas putativas (Llop-Tous y col., 1999).

Xiloglucano endotransglicosilasas (XETs, EC 2.4.1.207): catalizan la

hidrólisis de los enlaces internos de los esqueletos b-(1®4)-D-glucano del

xiloglucano, transfiriendo el extremo reductor recién formado a la posición C-4

del extremo no reductor de otra cadena de xiloglucano (Brummell y Harpster,

2001).

Endo-(1®4)b-mananasas (EC 3.2.1.78): catalizan la hidrólisis de los

enlaces glicosídicos b-(1®4) de glucomananos, galactoglucomananos y

galactomananos. La actividad de estas enzimas aumenta durante la

30


maduración de diversos frutos, tales como tomate, durazno y mandarina

(Bourgault y col., 2001). Se sugirió que las endo-b-mananasas desempeñan un

papel importante en el proceso de ablandamiento del fruto en tomate (Bewley

y col., 2000).

Endo-xilanasas (EC 3.2.1.8): catalizan la hidrólisis de los enlaces b-

(1®4) internos del esqueleto de los xilanos, generando xilo-oligosacáridos. En

general, actúan en sitios donde la cadena principal no se encuentra sustituida

(Cleemput y col., 1997).

b-D-Xilosidasas (EC 3.2.1.37): catalizan la liberación de xilosas a partir

de los extremos no reductores de los xilo-oligosacáridos generados por las

endo-xilanasas (Cleemput y col., 1997). En frutilla, se reportó actividad b-D-

xilosidasa y se sugirió que la misma tendría relación con las diferencias en la

velocidad de ablandamiento observadas entre cultivares (Martínez y col., 2004;

Bustamante y col., 2006).

2.2.2.1.3. Enzimas que actúan sobre cadenas laterales

b-D-galactosidasas (b-Gal, EC 3.2.1.23): en plantas superiores son del

tipo exo y remueven los residuos b-D-galactosilos a partir de los extremos no-

reductores de las cadenas laterales de los RG I, los cuales poseen la mayor

parte de los residuos de galactosa de la pared celular vegetal. Posiblemente

actúan de la misma forma sobre las cadenas laterales de los xiloglucanos. Se

ha sugerido que la actividad b-Gal produce un incremento en la solubilización

31


de las pectinas durante la maduración, la cual conduce a un mayor

ablandamiento de los frutos. Dicho efecto es producido de forma directa,

aumentando la solubilidad de los RG I, e indirecta, mediante el incremento de

la porosidad de la pared celular, facilitando el acceso de PME y PG a sus

sustratos (Brummell y Harpster, 2001).

α-L-arabinofuranosidasas (α-Ara, EC 3.2.1.55): actúan sobre diferentes

fracciones pécticas y hemicelulósicas liberando residuos de arabinosa a partir

del extremo no reductor (Tateishi y col., 1996). En frutilla, se reportó que

tanto la expresión como la actividad α-Ara, estarían asociadas a las

diferencias de textura observadas entre cultivares de frutilla (Rosli y col.,

2009).

2.2.2.1.4. Enzimas que actúan sobre pectinas

Pectato liasas (PLs, EC 4.2.2.2): catalizan la ruptura de pectinas de-

esterificadas a través de un mecanismo de eliminación beta. Las PLs requieren

la presencia de Ca2+ para ejercer su acción, y producen oligosacáridos con

residuos de ácido galacturónico no-saturados en el extremo no-reductor de los

mismos (Charnock y col., 2002). Se hallaron secuencias nucleotídicas

correspondientes a pectato liasas, tanto en frutos de banana como de frutilla

(Medina-Suarez y col., 1997; Medina-Escobar y col., 1997). En el caso de

frutilla se observó un aumento de la expresión del gen correspondiente

durante la maduración de los frutos (Medina-Escobar y col., 1997). La

supresión de la expresión de este gen en frutillas transgénicas resultó en una

32


menor degradación de pectinas y un mayor mantenimiento de la firmeza

respecto a los frutos control (Jiménez-Bermúdez y col., 2002).

Poligalacturonasas (PGs): catalizan la hidrólisis de las uniones a-(1®4)

que mantienen unidos a los residuos de ácido galacturónico. Estas enzimas

pueden ser de acción exo o endo. Las exo-poligalacturonasas (EC 3.2.1.67)

remueven unidades simples de ácido galacturónico a partir del extremo no-

reductor del ácido poligalacturónico. En cambio, las endo-poligalacturonasas

(EC 3.2.1.15) rompen dicho polímero en posiciones internas al azar (Brummell

y Harpster, 2001). Se ha determinado que las PGs muestran una mayor

afinidad por la forma de-esterificada de las pectinas, por lo tanto se postula

que estas últimas serían primeramente de-metiladas de modo de convertirse

en un sustrato adecuado para la acción de las PGs (Brummell y Harpster,

2001).

Pectin metil esterasas (PME, EC 3.1.1.11): catalizan la de-metilación del

grupo carboxilo en la posición C-6 de los residuos de ácido galacturónico de

las pectinas de alta masa molecular. Esta de-metilación cambia el pH y la

carga de la pared celular, permitiendo la agregación de los poliurónidos a

través de puentes de Ca2+ y tornándolos más susceptibles a la degradación

por poligalacturonasas (Brummell y Harpster, 2001).

2.3. Características generales de las poligalacturonasas

Las poligalacturonasas se encuentran involucradas en el desensamblaje

33


de las pectinas de la pared celular que caracteriza distintos procesos del

desarrollo de las plantas. La actividad poligalacturonasa fue asociada a

procesos tales como la abscisión de órganos (Bonghi y col., 1992),

dehiscencia de vainas y anteras (Meakin y Roberts, 1991), maduración del

grano de polen y crecimiento del tubo polínico (Pressey y Reger, 1989,

Pressey, 1991), y especialmente con la maduración de los frutos (DellaPenna

y col., 1987; Hadfield y col., 1998; Brummell y Harpster, 2001; Asif y Nath,

2005).

2.3.1. Familias génicas

Si bien muchas de las secuencias aminoacídicas de PG muestran un

nivel relativamente elevado de divergencia, existen regiones que están

altamente conservadas entre todos los genes clonados de plantas y fuentes

microbianas. Estas similitudes se observan particularmente en la porción

carboxilo terminal de la enzima, dentro de la cual se encuentra un conjunto

de residuos de aminoácidos altamente conservados, los cuales determinan las

funciones catalíticas (Scott-Craig y col., 1990; Caprari y col., 1996).

Todas las PGs clonadas hasta el momento poseen una secuencia señal

N-terminal hidrofóbica (péptido señal) la cual dirige la proteína hacia el lumen

del retículo endoplasmático y probablemente hacia la pared celular. Sin

embargo, aparentemente sólo un subgrupo de PGs presenta una pre-

secuencia N-terminal a continuación del péptido señal. La función de la pre-

secuencia no es conocida, pero podría mantener a la proteína en un estado

inactivo hasta que ésta sea transportada hacia su destino final, o podría dirigir

34


a la misma hacia una posición específica dentro de la pared celular (Della

Penna y Bennett, 1988).

Las poligalacturonasas de plantas son agrupadas en tres clados, A, B y

C, de acuerdo a la comparación de sus secuencias de aminoácidos (Hadfield

y col., 1998). Sin embargo, esta clasificación no es absoluta, y podría no ser

suficiente, considerando el número creciente de secuencias de PGs en las

bases de datos. El clado A comprende genes que se expresan en frutos y

zonas de abscisión y dehiscencia, y los mismos codifican endo-PGs sin pre-

secuencia predicha. El clado B está formado por genes que codifican endo- y

exo-PGs con pre-secuencia y que actúan en los mismos tejidos y zonas de la

plantas que las proteínas del clado A. Finalmente, el clado C, comprende

genes que se sólo se expresarían en polen y aparentemente codifican para

exo-poligalacturonasas sin pre-secuencia predicha (Hadfield y col., 1998). Sin

embargo, es de destacar que existen reportes donde se detectó actividad exo-

poligalacturonasa asociada con la maduración de frutos (Pressey y Avants,

1978; Nogata y col., 1993; Brummell y col., 2004).

2.3.2. Poligalacturonasas y maduración de frutos

Las pectinas de la pared celular de frutos sufren un desensamblaje

particularmente extensivo durante los últimos estadios de maduración. Esta

importante depolimerización y degradación de pectinas está asociada con el

deterioro que sufren los frutos en los estadios sobremaduros (Huber y

O’Donoghue, 1993). Por otra parte, el desensamblaje de pectinas puede

incrementar la porosidad de la red de polisacáridos, dando lugar al

35


hinchamiento de la pared celular, fenómeno observado en numerosos frutos

durante el ablandamiento (Redgwell y col., 1997). Cabe destacar que, si bien

los cambios en la composición de los polisacáridos de pared son importantes

para las variaciones de textura observadas durante la maduración, no son los

únicos factores determinantes de la firmeza del fruto. Otros factores

contribuyentes deben ser tenidos en cuenta, particularmente la integridad de la

cutícula (Saladié y col., 2007) y la turgencia del fruto (Shackel y col., 1991,

Shiota y col., 2006).

El desensamblaje de pectinas dependiente de PG se estudió

principalmente durante la maduración de tomate, estableciéndose la

contribución de la actividad poligalacturonasa al ablandamiento asociado con la

maduración de este fruto. Si bien las PGs de plantas pueden ser parte de

grandes familias génicas (Hadfield y Bennett, 1998), en fruto de tomate el

ARNm de un solo miembro de la familia génica (PG2, número de acceso

P05117) se acumula durante la maduración. El aumento de la expresión de

dicho gen es paralelo al incremento de los niveles y actividad de la enzima

(Della Penna y col., 1986).

La poligalacturonasa de tomate fue la primera hidrolasa de pared

celular en ser examinada utilizando métodos transgénicos. En frutos en los

cuales la actividad PG fue suprimida mediante la expresión de un transgen

anti-sentido a niveles por debajo del 1% del valor presente en frutos salvajes,

la solubilidad de las pectinas no resultó afectada, pero no se observó

depolimerización de las pectinas solubilizadas (Smith y col., 1988). Estos frutos

transgénicos maduran normalmente, lo cual demuestra que no es necesaria

una actividad PG elevada para que se produzca la maduración del fruto. Por

36


otra parte, solo se observó una ligera disminución del ablandamiento de los

frutos transgénicos con respecto a los de tipo salvaje. A pesar de estos

resultados, se obtuvieron mejoras significativas en frutos transgénicos

procesados, y se observó un aumento en la viscosidad del jugo o de la pasta

preparada a partir de los mismos (Brummell y Labavitch, 1997).

En otros estudios orientados a determinar el papel de PG en el

metabolismo de la pared celular durante la maduración, se utilizaron tomates

rin (ripening inhibitor). Estas plantas presentan una mutación en un gen

MADS-box (LeMADS-RIN), el cual se encuentra corriente arriba del control de

la maduración por etileno. Dicha mutación es responsable de que los frutos

fallen en la producción autocatalítica de etileno, tanto en la maduración como

en respuesta a la aplicación de etileno exógeno (Vrebalov y col., 2002). En

rin, el ARNm del gen endógeno de PG se acumula en niveles muy reducidos.

El tratamiento de frutos rin con etileno, no incrementa la acumulación de los

ARNm de PG, como ocurre normalmente en frutos de tomate del tipo salvaje

(Della Penna y col., 1987). Por otro lado, estos mismos frutos se

transformaron con una construcción génica formada por el gen de PG

fusionado al promotor del gen E8, el cual responde a etileno y propileno

(Giovannoni y col., 1989). En los frutos rin-transgénicos, tanto la expresión

génica de PG, como la actividad enzimática y la solubilización y

depolimerización de pectinas fueron restauradas hasta alcanzar valores

cercanos a los de frutos salvajes. Sin embargo, estos frutos no se ablandaron

ni presentaron alteraciones en otros parámetros de maduración, tales como la

acumulación de pigmentos o la producción de etileno.

La supresión de la depolimerización de pectinas pero no de la solubilización

37


de las mismas en frutos transgénicos con PG antisentido, indica que estos

dos procesos poseen determinantes enzimáticos diferentes, siendo la

depolimerización, pero no la solubilización, debida principalmente a la acción

de PG. En contraste, en mutantes rin complementados con PG, las pectinas

fueron tanto solubilizadas como depolimerizadas. Estos datos sugieren que en

tomate, la actividad PG es necesaria y suficiente para la depolimerización de

pectinas, pero que puede ser solo una de múltiples y redundantes actividades

enzimáticas que solubilizan pectinas, y que el resto de ellas podría estar

ausente en los mutantes rin (Hadfield y Bennett, 1998). En un trabajo reciente,

se demostró que la supresión simultánea de PG y expansina en tomate,

redujo el desensamblaje de la pared celular, retrasó el ablandamiento, y

disminuyó la susceptibilidad de los frutos transgénicos al hongo patógeno

Botrytis cinerea (Cantu y col., 2008).

En frutos de banana, se detectó un incremento en la actividad y

expresión poligalacturonasa durante la maduración y la senescencia de los

frutos (Asif y Nath, 2005). En el caso de melón, se sugirió que la expresión

poligalacturonasa podría estar asociada con el desensamblaje de pectinas

asociado con la maduración (Hadfield y col., 1998). Por otra parte, en

duraznos se observó una actividad poligalacturonasa diferencial entre frutos de

textura denominada “no-melting” (de textura firme, utilizados para conserva) y

frutos de textura “melting” (de textura suave o blanda, destinados al consumo

en fresco) (Pressey y Avants, 1978). En un trabajo posterior, Callahan y col.

(2004) observaron que deleciones en un grupo de genes de poligalacturonasa

se correlacionan con la textura característica de los duraznos tipo “no-melting”.

La hipótesis actual acerca del papel de las poligalacturonasas en la

38


maduración de frutos señala que el desensamblaje de pectinas mediado por

PG no contribuye al ablandamiento temprano del fruto, pero cumple un rol

importante en la degradación de los tejidos durante los últimos estadios de

maduración y en los estadios sobremaduros.

2.3.2.1. Poligalacturonasas y maduración de frutilla

En frutilla, los primeros estudios para detectar actividad

poligalacturonasa arrojaron resultados negativos (Barnes y Patchett, 1976;

Huber, 1984). Sin embargo, en un trabajo posterior se logró detectar actividad

PG en frutos rojos del cultivar Toyonoka (Nogata y col, 1993). Los autores de

este trabajo señalaron que la actividad PG se debía a tres enzimas que

pudieron distinguirse mediante cromatografía de intercambio catiónico. Una de

las enzimas (PG1) tendría una baja actividad endo-poligalacturonasa, mientras

PG2 y PG3 presentaron actividad exo-poligalacturonasa. Nogata y col. (1993)

señalaron además que la actividad exo-PG disminuye durante el desarrollo y

maduración de los frutos, resultado que contradice al papel sugerido para PG

en la maduración y ablandamiento de los frutos.

Posteriormente, se clonaron tres genes putativos de PG: spG (Redondo-

Nevado y col., 2001), D15 y B4 (Salentijn y col., 2003). Dos de estos clones,

spG y D15, corresponden al mismo gen (Salentijn y col., 2003), si bien se

reportaron datos contradictorios acerca de su expresión. Redondo-Nevado y

col. (2001) detectaron expresión poligalacturonasa sólo al comienzo de la

maduración de frutos del cultivar Chandler, y reportaron que la expresión de

sPG es regulada negativamente por auxinas. Los autores propusieron que la

39


enzima sPG tendría un papel en la liberación de oligosacarinas al comienzo

de la maduración del fruto, y que no desempeñaría un papel importante en el

ablandamiento del fruto durante la maduración. Sin embargo, en un trabajo

posterior, Salentijn y col. (2003) detectaron expresión de sPG (D15) en frutos

rojos pertenecientes a cultivares con diferentes niveles de firmeza. Mediante

ensayos de Northern-blot, observaron una elevada expresión de spG en frutos

pertenecientes a la variedad Gorella (firmeza baja); frutos pertenecientes al

cultivar Holliday (firmeza elevada) presentaron la menor expresión de sPG,

mientras que frutos de la variedad Elsanta (firmeza intermedia), presentaron un

nivel de expresión intermedio. Estos resultados, opuestos a los obtenidos por

Redondo-Nevado y col. (2001), sugieren un rol de sPG en las diferencias de

textura observadas entre cultivares. Por otro lado, Salentijn y col. (2003)

observaron un patrón de expresión similar para el gen B4 en los tres

cultivares analizados. Sin embargo, a diferencia de la proteína codificada por

sPG, en la proteína deducida a partir de B4 el sitio activo difiere del presente

en las proteínas PGs conocidas, por lo cual existen dudas acerca de si

realmente se trata de una poligalacturonasa.

Como se mencionó anteriormente, las PGs de plantas son agrupadas

en tres clados. En el caso de frutilla, Redondo-Nevado y col. (2001) ubican a

spG dentro del Clado A, sugiriendo que spG codificaría una endo-

poligalacturonasa (Redondo-Nevado y col., 2001), mientras Salejtijn y col.

(2003) clasifican a sPG como una exo-poligalacturonasa perteneciente al Clado

C.

40

Hipótesis de trabajo y objetivos

3. Hipótesis de trabajo y objetivos

3.1. Hipótesis de trabajo

“Existe una correlación entre la expresión y actividad poligalacturonasa y el

ablandamiento del fruto durante la maduración de frutilla”.

3.2. Objetivo general

Contribuir al conocimiento de los mecanismos moleculares y bioquímicos que

determinan el ablandamiento de frutilla.

3.3. Objetivos particulares

· Analizar la actividad PG total durante la maduración de variedades de

frutilla con diferente velocidad de ablandamiento.

· Caracterizar la expresión de genes de PGs durante la maduración de

variedades de frutilla con niveles de firmeza contrastantes.

· Obtener y clonar las secuencias completas de genes de PG de frutilla.

· Estudiar la acumulación de proteínas PGs durante la maduración de

variedades de frutilla con firmezas contrastantes.

· Evaluar el efecto de diferentes reguladores del crecimiento vegetal

sobre la expresión de genes de PGs de frutilla.

· Analizar la existencia del fenómeno de splicing alternativo en genes de

PGs de frutilla.

41

Materiales y Métodos

4. Materiales y Métodos

4.1. Material Vegetal

Se utilizaron plantas de frutilla (Fragaria x ananassa, Duch.) de distintas

variedades cuyos frutos presentan diferentes niveles de firmeza. Se emplearon

los cultivares Camarosa (firmeza elevada), Pájaro (firmeza intermedia) y

Toyonoka (firmeza baja). Los datos de firmeza de las tres variedades se

tomaron de estudios previos a la realización de este trabajo de Tesis (Rosli y

col., 2004). Los frutos se obtuvieron de productores locales (La Plata,

Provincia de Buenos Aires) a partir de plantas cultivadas de acuerdo a

prácticas convencionales. Los frutos se recolectaron en distintos estadios de

desarrollo y maduración. Los estadios empleados fueron: verde grande (VG),

blanco (B), 25% rojo (25% R), 50% rojo (50% R) y 100% rojo (100% R) para

Camarosa, Pájaro y Toyonoka. Las muestras se lavaron, secaron, cortaron,

congelaron en N2(l) y se almacenaron a -80 °C hasta su utilización.

Para los ensayos con reguladores del crecimiento vegetal, se utilizaron

frutos de Camarosa y Toyonoka en el estadio blanco.

4.2. Determinación de la actividad poligalacturonasa (PG)

La metodología que se utilizó para la obtención de extractos proteicos y

la medición de actividad PG se adaptó de Nogata y col. (1993). Para la

preparación de los extractos, se utilizaron frutos de frutilla de las variedades

Camarosa, Pájaro y Toyonoka de los estadios VG, B, 50% R y 100% R, y

42


frutos blancos de Camarosa sometidos a diferentes tratamientos con

reguladores del crecimiento vegetal. Los frutos congelados se cortaron en

trozos y se homogeneizaron en una licuadora (OCI Instruments, Modelo OMNI-

MIXER 17106) empleando 3 volúmenes del siguiente buffer de extracción:

AcH/NaAc 50 mM, pH 6,0 y PVPP 1% p/v. Luego se centrifugó a 12000 x g

durante 30 min a 4 °C, se descartó el sobrenadante y el precipitado se lavó

con 3 volúmenes de buffer AcH/NaAc pH 6,0 (esta operación se realizó 2

veces). Posteriormente se centrifugó a 12000 x g durante 30 min a 4 °C, se

descartó el sobrenadante y se realizó una extracción sobre el precipitado con

3 volúmenes del siguiente buffer: AcH/NaAc 50 mM y NaCl 1 M pH 6,0,

agitando durante 2,5 h a 4 °C. Esta suspensión se centrigugó a 12000 x g

durante 30 min a 4 °C, y el sobrenadante se separó para medir la actividad

de la enzima. Previamente a la medida de la actividad poligalacturonasa total,

se dializó durante toda la noche para eliminar el NaCl contra buffer AcH/NaAc

50 mM pH 6,0, a 4 °C con agitación suave.

La actividad poligalacturonasa se determinó utilizando ácido

poligalacturónico como sustrato. Para la realización de las cinéticas de

reacción, se incubaron 700 ml de cada uno de los extractos a 37 °C con 700

ml de ácido poligalacturónico 0,3% p/v en buffer AcH/NaAc 50 mM, pH 6,0. De

cada una de las mezclas de reacción se tomaron 300 ml a los tiempos: 0, 6,

12 y 24 h. Inmediatamente se congeló en N2(l) y se mantuvo a -20 °C hasta

la determinación colorimétrica. Como blanco de reacción se utilizaron 700 ml

de ácido poligalacturónico 0,3% p/v y 700 ml de buffer AcH/NaAc 50 mM, pH

6,0.

La determinación del ácido galacturónico liberado por la acción

43


enzimática se realizó utilizando el método de la 2-cianoacetamida (Gross,

1982). Este método permite medir colorimétricamente el ácido galacturónico a

través de la formación de un compuesto luego de la reacción con la 2-

cianoacetamida, el cual absorbe a 270 nm. Se prepararon dos extractos para

cada estadio de maduración y cultivar analizado, y tanto las cinéticas como

las colorimetrías se realizaron por duplicado.

4.3. Extracción de ADN genómico

La metodología que se empleó para la extracción de ADN genómico se

adaptó de Kiefer y col. (2000). Como material vegetal se usaron 0,5 g de

hojas jóvenes de plantas de Toyonoka y Camarosa, las cuales se congelaron

en N2(l) y se molieron con pilón y mortero hasta obtener un fino polvo.

Inmediatamente después, se adicionaron 10 ml de buffer de extracción (CTAB

3% p/v, PVP 2% p/v, Tris HCl 1 M pH 8,0, EDTA 20 mM, NaCl 1,4 M), se

agregó b-mercaptoetanol (concentración final 2% v/v) y se incubó durante 30

min a 65 °C, mezclando por inversión cada 5 min. Luego se tomaron

alícuotas de 750 µl de las muestras y se repartieron en tubos de

microcentrífuga de 1,5 ml. Se agregó un volumen (750 µl) de

cloroformo:alcohol isoamílico en partes iguales, se mezcló por inversión, se

centrifugó a 10000 x g durante 10 min a temperatura ambiente y se recolectó

cuidadosamente el sobrenadante. Se agregó igual volumen de isopropanol a -

20 °C y se dejó precipitar a –20 °C por 2 h. Luego se centrifugó a 10000 x g

por 10 min a temperatura ambiente, se eliminó el sobrenadante y el pellet se

dejó secar durante 10 min. Se resuspendió el pellet en 100 µl de agua

44


destilada estéril a 65 °C, se agregó 1 µl de RNAasa A (10 mg/ml, Promega)

y se incubó a 37 °C por 15 min. La reacción se detuvo agregando 100 µl de

cloroformo:alcohol isoamílico en partes iguales y 100 µl de fenol equilibrado

(pH 7,6) para limpiar las muestras. Luego se centrifugó a 10000 x g por 10

min a temperatura ambiente, se recuperó el sobrenadante y se agregaron 2,5

volúmenes de etanol a –20 °C. El ADN se precipitó a -20 °C por 2 h.

Posteriormente se centrifugaron las muestras a 10000 x g durante 20 min a

temperatura ambiente, se eliminó el sobrenadante y el pellet se dejó secar a

temperatura ambiente. Finalmente el pellet se disolvió en 35 µl de agua

destilada estéril a 65 °C.

La integridad de las muestras de ADN se verificó en un gel de agarosa

al 0,8% p/v (en buffer TBE 0,5X) y la concentración de cada muestra se

determinó como se describe en el punto 4.10. Sobre cada muestra se realizó

una reacción de PCR utilizando los oligonucleótidos 5-TPG y 3-TPG (con las

condiciones del punto 4.8), los productos amplificados se purificaron de un gel

de agarosa 1% p/v (en buffer TBE 0,5X), se ligaron en el vector de pGEM-T

Easy (Promega) y se enviaron a secuenciar (puntos 4.9., 4.14. y 4.19.,

respectivamente).

4.4. Extracción de ARN total

El ARN total se aisló utilizando el método de extracción del borato

sódico en caliente (Wan y Wilkins, 1994). Se utilizaron frutos de las

variedades Camarosa, Pájaro y Toyonoka en los estadios de maduración VG,

B, 25% R, 50% R y 100% R, y frutos blancos de Camarosa sometidos a

45


diferentes tratamientos con reguladores del crecimiento vegetal. Se trituró cada

muestra (aproximadamente 5 g de tejido) con pilón y mortero en N2(l) y se

homogenizó con 3,5 volúmenes de buffer de extracción (Bórax

(Na2B4O7.10H2O) 0,2 M, EDTA 30 mM, SDS 1% p/v, deoxicolato de sodio 1%

p/v, DEPC 0,1% v/v, pH 9,0) a una temperatura de 80 °C. Inmediatamente

antes de usar se agregó: DTT 10 mM, nonidet P-40 1% v/v y PVP-40 2%

p/v. Posteriormente se agregó a cada muestra 150 μl de proteinasa K (20

mg/ml) y se incubó a 42 °C con agitación constante durante 90 min. Luego

se adicionó 1 ml de KCl 2 M por cada 10 ml de buffer de extracción y se

incubó en hielo durante 60 min. Se centrifugó a 12000 x g durante 20 min a

4 °C, al sobrenadante se le adicionó 1/3 del volumen de LiCl 8 M y se

incubó a 4 °C durante toda la noche. Las muestras se centrifugaron a 12000

x g durante 20 min a 4 °C y se descartó el sobrenadante. El precipitado se

lavó dos veces con 5 ml de LiCl 2 M a 4°C, se centrifugó a 12000 x g

durante 10 min a 4 °C y se descartó el sobrenadante (estos pasos se

repitieron dos veces). El precipitado se resuspendió en 2 ml de Tris-HCl 10

mM (pH 7,5) y se centrifugó a 12000 x g durante 10 min a 4 °C. El

sobrenadante se trató con 200 μl de acetato de potasio 2 M (pH 5,5) y se

incubó durante 15 min a 0 °C. Posteriormente, se centrifugó a 12000 x g

durante 10 min a 4 °C para remover polisacáridos y al sobrenadante se le

adicionaron 2,5 volúmenes de etanol 100% v/v frío para precipitar el ARN. Se

incubó a –80 °C durante 2 h. Luego se centrifugó a 9700 x g durante 30 min

a 4 °C y se descartó el sobrenadante. El ARN se lavó con 2 ml de etanol

70% v/v frío. Se centrifugó a 9700 x g durante 10 min a 4 °C y se descartó

el sobrenadante. El etanol residual se eliminó mediante vacío y el precipitado

46


se resuspendió en 200 μl de agua destilada tratada con DEPC 0,1% v/v. A

continuación se precipitó nuevamente el ARN con 1/10 volúmenes de acetato

de sodio 3 M, pH 6,0 y 2,5 volúmenes de etanol 100% v/v frío. Se incubó a –

20 °C durante toda la noche y posteriormente se centrifugó a 16100 x g

durante 20 min a 4 °C, se eliminó el sobrenadante y se lavó el precipitado

con 1 ml de etanol 70% v/v frío. Finalmente, luego de centrifugar a 16100 x g

durante 5 min a 4 °C, se eliminó el sobrenadante, el exceso de etanol se

extrajo mediante vacío y el ARN total se disolvió en agua destilada tratada

con DEPC 0,1% v/v. Las muestras se almacenaron a -80°C hasta su uso.

4.5. Cuantificación de ARN

La concentración del ARN total extraído se determinó

espectrofotométricamente midiendo absorbancia a una longitud de onda de 260

nm utilizando la conversión: 1 unidad de absorbancia= 40 mg ARN/ml.

4.6. Análisis de ARN total

Con el objeto de verificar la integridad del ARN total extraído, se

prepararon geles de agarosa 1,2% p/v en condiciones desnaturalizantes. Para

ello se disolvieron 0,5 g de agarosa en 43 ml de agua destilada tratada con

DEPC 0,1% v/v y luego se agregaron 5 ml de buffer MOPS 10X (MOPS 0,2

M pH 7,0, acetato de sodio 20 mM, EDTA 10 mM pH 8,0) y 1,5 ml de

formaldehído (37% p/v). La presencia de bandas discretas correspondientes a

los ARN ribosomales permite determinar que el ARN total extraído no sufrió

degradación durante el proceso de extracción. Cada una de las muestras de

47


ARN total analizadas se procesaron de la siguiente manera: 3 μl de solución

conteniendo ARN total se mezclaron con 18 μl de una mezcla compuesta por

2,5 μl de buffer MOPS 10X, 12,5 μl de formamida, 5,0 μl de formaldehído

(37% p/v) y 3,0 μl de bromuro de etidio (10 mg/ml). Se incubó a 65 °C

durante 10 min y se agregaron 2 μl de colorante de muestra 6X para ARN

(glicerol 50% p/v, EDTA 1 mM, azul de bromofenol 0,4% p/v, xilencianol 0,4%

p/v). Finalmente, las muestras se sembraron en el gel y la electroforesis se

realizó a 70 V durante 2 h en buffer MOPS 1X. Las bandas correspondientes

a los ARN ribosomales se visualizaron utilizando un transiluminador-UV.

4.7. Transcripción reversa

La síntesis de la primera hebra de ADNc se realizó sobre ARN total

obtenido a partir de las siguientes variedades y estadios de maduración:

Camarosa y Toyonoka, VG, B, 25% R, 50% R y 100% R, y frutos blancos de

Camarosa sometidos a diferentes tratamientos con reguladores del crecimiento

vegetal. Se utilizó 1 μg de ARN total, 0,03 mM de dNTPs, 1 μl de

transcriptasa reversa M-MLV (200 U/ml; Promega), 5 μl de buffer de reacción

M-MLV 5X (250 mM Tris-HCl, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2, 50 mM DTT, pH

8,3), 330 pmoles de hexámeros (Biodynamics S.R.L., Buenos Aires, Argentina)

y agua destilada en cantidad suficiente para un volumen final de 25 μl. El

ARN, el agua y los hexámeros se incubaron durante 10 min en un baño a 70

°C e inmediatamente se incubó a 4 °C durante 2 min. Luego de una

incubación a temperatura ambiente durante 10 min se agregaron los dNTPs, el

buffer de reacción 5X y la transcriptasa reversa M-MLV (Promega). La mezcla

48


de reacción se incubó a 38 °C durante 1 h y luego a 95 °C durante 5 min

para inactivar la enzima.

4.8. Reacciones de RT-PCR

Dos secuencias parciales, FaPG1 (1008 pb) y T-PG (535 pb),

homólogas a genes de poligalacturonasa habían sido aisladas previamente en

nuestro laboratorio. A partir del alineamiento de estas dos secuencias y de

spG (Redondo-Nevado y col., 2001) se diseñó un par de cebadores

específicos, denominados 5T-PG (5’ ATACTGCAGGCGCCACCAATTG 3’) y 3T-

PG (5’ CATGACCTGGTCCACAACTTAC 3’). Por otro lado, en base a un

fragmento del gen correspondiente a ARNr 18s de frutilla clonado durante este

trabajo de tesis, se diseñó un par de cebadores específicos, denominados

Rib5 (5´ ACCGTAGTAATTCTAGAGCT 3´) y Rib3 (5´

CCACTATCCTACCATCGAAA 3´). Se realizó la reacción de PCR utilizando 1,5

ml de reacción de transcripción reversa para frutos 100% R de la variedad

Camarosa, 12,5 pmoles de cada cebador, 2,5 ml de buffer de reacción 10X

Taq polimerasa, 1 U de Taq polimerasa (Promega), 0,05 mM de dNTPs, 1,5

mM de MgCl2 y agua destilada estéril para un volumen final de 25 ml. El

programa de PCR empleado fue el siguiente: desnaturalización inicial a 94 °C,

4 min; 35 ciclos (94 °C, 1 min; 64 °C, 1 min; 72 °C, 1 min) y 72 °C, 7 min.

4.9. Visualización de los productos de PCR

Los productos de amplificación utilizando los cebadores específicos (5T-

49


PG y 3T-PG, Rib5 y Rib3) se visualizaron en un gel de agarosa de alto poder

de separación, de concentración 1,5% p/v, teñidos con bromuro de etidio

(concentración final 0,5 mg/ml) y preparados en buffer TBE 0,5X (Tris Base 54

g, ácido bórico 27,5 g, EDTA 0,5 M 20 ml, pH 8,0, cantidad suficiente de

agua destilada para 1 l). Se sembraron 24 ml de los productos de PCR a los

que se les agregó previamente 4 ml de buffer de muestra 6X ADN (azul de

bromofenol 0,25% p/v, xilen-cianol 0,25% p/v, glicerol 30% v/v). En la corrida

electroforética se utilizó buffer TBE 0,5X y un voltaje constante de 80 V.

4.10. Purificación de los productos amplificados y cuantificación de ADN

Las bandas de interés se cortaron de los geles de agarosa y se

purificaron utilizando columnas de purificación GFXTM (Amersham Biosciences).

La concentración de ADN se determinó espectrofotométricamente midiendo

absorbancia a 260 nm y empleando la conversión de 1 unidad de

absorbancia= 50 mg ADN/ml.

4.11. Ligación de los productos de PCR

La ligación de los productos purificados se realizó empleando el sistema

del vector pGEM-T Easy (Promega). En cada caso se utilizó una relación

inserto/vector de 5:1, 25 ng de vector, 1 ml de buffer de ligación 10X (Tris-HCl

300 mM, pH 7,8; MgCl2 100 mM; DTT 100 mM; ATP 10 mM), 3 U de T4

DNA Ligasa (Promega) y cantidad suficiente de agua destilada estéril para un

volumen final de 10 ml. Cada mezcla de ligación se incubó a 6 °C durante

toda la noche.

50


4.12. Obtención de células competentes

Se utilizó el método descrito por Inoue y col. (1990), que permite

obtener células bacterianas competentes con una eficiencia de transformación

de 1-3 x 109 UFC/μg de ADN plasmídico. Se tomaron células de Escherichia

coli pertenecientes a la cepa XL-1 Blue, congeladas a -80 °C y se sembraron

por agotamiento en placas de Petri con medio LB-agar (triptona 10 g, extracto

de levadura 5 g, NaCl 5 g, NaOH 1 N 1 ml, agar 15 g, agua destilada en

csp 1 l) más tetraciclina (concentración final= 12 μg/ml). La placa se incubó

durante toda la noche a una temperatura de 37 °C. Posteriormente se

tomaron 6 colonias que se inocularon en 100 ml de medio SOB (triptona 20

g, extracto de levadura 5 g, NaCl 0,5 g, KCl 250 mM 10 ml, MgCl2 2 M 5

ml, agua destilada en csp 1000 ml, pH 7,0) y se las creció a 18 °C, con

agitación vigorosa hasta alcanzar una densidad óptica de 0,6 (medida a una

longitud de onda de 600 nm). La suspensión celular se incubó a 4 °C durante

10 min y se centrifugó a 2500 x g durante 10 min a 4 °C. El precipitado se

resuspendió en 32 ml de solución TB (pipes 10 mM, MnCl2 55 mM, CaCl2 15

mM, KCl 250 mM) fría y se incubó a 4 °C durante 10 min. Se centrifugó a

2500 x g durante 10 min a 4 °C y el precipitado se resuspendió en 8 ml de

solución TB, a la cual se adicionó DMSO hasta una concentración final de 7%

v/v. Se incubó a 4 °C durante 10 min y la suspensión celular se dividió en

alícuotas de 200 μl, las cuales se congelaron en N2(l) y se almacenaron a -80

°C hasta su utilización.

51


4.13. Transformación de células competentes

Una alícuota de 200 μl de células competentes se incubó a 4 °C

durante 30 min con 5 μl de mezcla de ligación. Posteriormente, la suspensión

se incubó 30 s a 42 °C y luego 10 min a 4 °C. Se agregó 1 ml de medio de

cultivo líquido LB (triptona 10 g, extracto de levadura 5 g, NaCl 5 g, NaOH 1

N 1 ml, agua destilada en csp 1 l) y se incubó a 37 °C con agitación durante

1 h. Por otro lado, se prepararon medios de cultivo sólidos en placas de Petri

conteniendo LB-agar con ampicilina (concentración final= 100 μg/ml). En cada

placa se sembraron 200 μl de la suspensión de células transformadas y se

incubaron a 37 °C durante toda la noche. Se seleccionaron colonias positivas

(con el fragmento de interés) mediante la técnica de PCR en colonia. A partir

de estas colonias se realizó la extracción de ADN plasmídico, para verificar

posteriormente la presencia del inserto de interés mediante cortes con enzimas

de restricción.

4.14. Extracción de ADN plasmídico

Para la extracción de ADN plasmídico se utilizó la técnica de lisis

alcalina (Ausubel y col., 1995). Se inocularon 3 ml de medio de cultivo LB

más el antibiótico adecuado con la colonia bacteriana de interés y se incubó a

37 °C con agitación constante durante toda la noche. La suspensión resultante

se centrifugó durante 1 min a 16000 x g, se descartó el sobrenadante y se

resuspendió el precipitado bacteriano en 200 μl de solución P1 (Tris-HCl 25

mM pH 8,0, EDTA 10 mM). Se agregaron 200 μl de solución desnaturalizante

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