hplc

1. I n s t i t u to P o l i t é c n i c o N a c i o n a l
E s c u e l a N a c i o n a l D e C i e n c i a s B i o l ó g i c a s
Q u í m i c o Fa r m a c é u t i c o I n d u s t r i a l
Lab. De Métodos de Separación e Instrumentación Analítica
Castillo Plata Alejandra Ivonne
Castro Loa Fernando Adrian
6FM1 - QFI
H i g h P e r f o r m a n c e L i q u i d
C h r o m a t o g r a p h y .

2. F u n d a m e n t o s T e ó r i c o s
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H i g h P e r f o r m a n c e L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y
Es un método de separación analítica, que se lleva a cabo gracias a la afinidad que tiene un compuesto (analíto),
por una fase fija o estacionaria, o por una fase móvil.
Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución, Eficiencia, o Rendimiento.
Fenómenos por los cuales ocurre una separación en HPLC.
1. Adsorción. Fenómeno de superficie que ocurre por la interacción
física o química de un adsorbente de un adsorbato.
2. Partición. Es el fenómeno de reparto de un soluto en 2 fases
distintas.
3. Intercambio Iónico. Es un fenómeno generado por la interacción
electrostática entre moléculas cargadas eléctricamente.
4. Exclusión. Es un fenómeno físico que consiste más que nada en
separar moléculas en base a su tamaño molecular.
5. Afinidad. Se combina la alta especificidad de ciertas moléculas
por un sustrato, tales como Ab, Enzimas, Receptores, etc.

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Cromatografía por Partición
1. Fase Estacionaria [FE]. Su naturaleza química debe ser no polar. La fase estacionaria a base de Sílice (SiO2)
debe estar recubierta con C6, C8, C12, C18 , y además puede tener un segundo recubrimiento con grupos
Fenilo, Ciano, u otros que hacen a la FE más resistente a solventes polares como H2O, Metanol, etc. (Fase
enlazada).
2. Fase Móvil [FM]. Su naturaleza química debe ser polar o más polar que la FE, los disolventes pueden ser H2O,
Metanol, Etanol, etc.
3. Analíto. Debe ser no polar o no tan polar como la FM para poder ser retenido por la FE.
O
I
O-Si O
l
O
R
I
- Si - C18
l
R’
O
O - Si O
/
O
R
I
- Si - C18
l
R’
O - Si O - Y
/
O
Silación con C18 Fase Enlazada

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Instrumentación
1. Reservorio. Contiene a la Fase Móvil.
2. Bomba. Impulsa a la Fase Móvil dentro del sistema de elución
de HPLC.
3. Inyector (Automuestrador o Manual). Permite introducir la
muestra al sistema.
4. Columna (Precolumna, Guardacolumna y Horno). Sistema de
análisis.
5. Detector. Es un transductor que tiene como función el registro
del paso de componentes de una muestra en el orden en el
que eluyen.
6. Colector de Fracciones. Sirve para recibir o contener por
separado los componentes que ya eluyeron por si se requiere
un análisis posterior de alguno de ellos.
7. Computador. Sistema de almacenamiento.
Columna Microboro o “Brownlee microbore”

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1) Consideraciones del Reservorio
• Frasco cerrado de vidrio o de algún polímero resistente al
disolvente con paredes homogéneas.
• Contiene un filtro de metal poroso que ayuda a retener
partículas de tamaño mayor a 10μm.
• Previo al bombeo del disolvente hacia el sistema de HPLC, se
realiza un tratamiento por desgasificación por ultrasonicación o
un burbujeo con un gas inerte (He excelencia).
Consideraciones del Disolvente
• El disolvente debe ser de alta pureza (grado HPLC).
• Disolver el analíto.
• Tener baja viscosidad.
• No debe reaccionar con el empaque de la columna.
• Debe ser volátil.
• Polaridad adecuada para el tipo de análisis que se lleve a cabo.
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2) Bombas
• Impulsan a la FM hacia el sistema de HPLC.
• Generan presiones de hasta 6000 psi (lb/in2).
• Tienen flujo libre de pulsaciones, evitando así la variación de
presión dentro del sistema.
• Tienen intervalos caudal de 0.1 a 10 ml/min.
Tipos de bombas
• Binarias: Impulsan un solo disolvente hacia el sistema.
• Secundarias: Impulsan 2 disolventes hacia el sistema.
• Terciarias: Impulsan 3 disolventes hacia el sistema.
• Secundarias: Impulsan 4 disolventes hacia el sistema.

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Elución Isocrática
Se mantiene la misma proporción de disolventes durante todo el proceso.
Elución en gradiente
La proporción de la mezcla de disolventes cambia en algún punto del proceso.
Este tipo de elución se utiliza cuando se tiene una mezcla compleja de componentes con polaridad diferente.
UMA
t(min)10 40
70% H2O
30% MetOH
UMA
t(min)10
70% H2O
30% MetOH
80% H2O
20% MetOH
5 min
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Método Isocrático Método en Gradiente

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3) Inyector
• Permite introducir la muestra al sistema de HPLC para su análisis sin despresurizar el sistema y sin interrumpir
el caudal.
• La muestra se introduce en el “Loop”, el cual se encarga de introducir la muestra al sistema.
• Tiene una posición de carga y otra de inyección.
Septum Microjeringas de Inyección
Sistema de Inyección

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3) Columnas y Precolumnas
• Es el medio donde se lleva a cabo la separación y es el contenedor de la
FE.
• Las precolumnas deben contener la misma FE que el empaque de la
columna, este evita el posible ingreso de partículas contaminantes y en
general prolonga la vida media de la columna.
Tipos de columnas
Columna de vidrio
Precolumnas

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Características de las columnas
• Diámetro interno 3.9 - 4.6 mm
• Longitud de 10, 15, 25, 30 cm
• Tamaño de partícula de 3.5, 5, 10 μm
Variación de Longitud (Same Particle Size)
Variación del tamaño de partícula (Same Lenght)

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3) Detector UV/VIS
• Se encarga de transducir la energía emitida de un
compuesto.
• Funciona únicamente para compuestos que absorban
en UV/VIS.
• Puede utilizarse en gradiente de elución.
• Es altamente selectivo sobre compuestos que posean
dobles enlaces.
Regiones de absorción de luz

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t(min)
tr1
tr2
t0
Cima del pico
Inicio de Pico
Fin del pico
ABC
w1
w2
Tiempo muerto
Tiempo trascurrido
desde que se
introduce la muestra
hasta la aparición de
un pico no retenido
Tiempo de retención
Tiempo trascurrido
desde que se
introduce la muestra
hasta la aparición de
un pico retenido
Tiempo relativo de
retención
Es la diferencia del tr de
un compuesto y t0
Partes principales de un cromatograma.
UMA