En este informe de laboratorio se determinaron las condiciones óptimas para el análisis de dos antibióticos mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), concluyendo que las condiciones más efectivas fueron encontradas en la prueba número seis. Se seleccionaron la fase estacionaria y la fase móvil adecuadas, lo que resultó en una buena separación y resolución. La práctica cumplió con los objetivos establecidos y se realizó un análisis eficaz de cefalexina y fenilglicinametilester.

1. Universidad Católica de la Santísima Concepción
Facultad de Ciencias
Análisis Instrumental / Laboratorio
INFORME Nº 1
Cromatografía Liquida de Alta
Resolución (HPLC). Condiciones optimas
para el análisis de una muestra.
Nombre : Jonathan Troncoso
Profesor : Irene Concha
Fecha : 26 de mayo 2010

2. Resumen
En la práctica de laboratorio se determino las condiciones óptimas del equipo
HPLC para el análisis de dos antibióticos. Para ello en primera instancia se determino cual
será nuestra fase estacionaria adecuada y cual nuestra fase móvil, esta ultima debemos
tener en consideración que sea compatible con la fase estacionaria, pero a su vez que
disuelva los componentes a analizar y proporcione una buena separación de nuestra
muestra. Con esto finalizado se comenzó generar diversas condiciones de trabajo hasta
encontrar la optima para el análisis de una muestra que contenía cefalexina y
fenilglicinametilester.
Del practico se determino que las condiciones optimas de trabajo para estos
antibióticos fue a una longitud de onda de 220 nm, un flujo de 0,5, entro otras. También se
calculo la resolución de esta condición siendo el valor de este 2,00.
Introducción
La cromatografía agrupa un conjunto importante y diverso de métodos, que
permite a los científicos separar componentes estrechamente relacionados en mezclas
complejas (1). En todas las separaciones cromatográficas, la muestra se desplaza con
una fase móvil, que puede ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico. Esta fase móvil
se hace pasar a través de una fase estacionaria con la que es inmiscible, y que está fijada
a una columna o una superficie. Las dos fases se eligen de tal forma, que los
componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase
estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase
estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase móvil (1).
Los métodos cromatograficos se pueden clasificar de dos modos distintos. El
primero de ellos se basa en la forma en que las fases estacionaria y móvil se ponen en
contacto. Es por esto que tenemos la cromatografía en columna y en plano.
La cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) es la técnica analítica de
separación más ampliamente utilizada principalmente por la sensibilidad que este tipo de
cromatografía posee (2).
Esta técnica es usada para separar los componentes utilizando una variedad de
interacciones entre nuestro análito y la columna cromatográfica. Básicamente es un

3. sistema compuesto de un reservorio de fase móvil, bomba, inyector, columna de
separación y detector. El análito se pasa a través de una columna de la fase estacionaria
bombeando la fase móvil liquida con alta presión. La muestra se introduce en pequeños
volúmenes a la corriente de la fase móvil y allí se retarda por medio de interacciones
químicas con la fase estacionaria mientras atraviesa la columna (3).
El retardo es conocido como tiempo de retención, y este es único para cada
análito. Depende de la naturaleza del análito, de la fase estacionaria y de la composición
de la fase móvil.
Los solutos más comunes usados en la fase móvil son combinaciones de agua
purificada con líquidos orgánicos, los más comunes son Metanol y Acetonitrilo, también
suelen usarse sales y buffers para contribuir a la separación de componentes (4).
Metodología
Para poder seleccionar las condiciones optimas de trabajo de un HPLC y realizar
de mejor forma el análisis de dos antibióticos, se comenzó eligiendo en primer lugar la
fase estacionaria que se utilizara en el equipo como también la selección de una fase
móvil adecuada que cumpla con ciertas características, estas características son que
debe ser compatible con nuestra fase estacionaria, como también una fase móvil que
disuelva los componentes a analizar y produzca una buena separación de estos.
Para efecto de nuestra actividad se utiliza una fase estacionaria de y una fase
móvil que corresponde a una mezcla de CH3OH y KH2PO4.
Las condiciones de la inyección inicial de trabajando fue utilizando la fase móvil
con una proporción de 50% de CH3OH y 50% de KH2PO4, la detección se realizo a una
longitud de onda de 210 nm, el flujo de la fase móvil fue de 0,2, el volumen de la muestra
inyectado fue de 10 μL y en esta ocasión no se aplico gradiente. Con estas condiciones
se observo el resultado del cromatógrama y es desde ese punto que comenzamos a
variar las condiciones de trabajo hasta encontrar las optimas, todo esto determinado a
partir de nuestro cromatógrama obtenido al finalizar la cromatografía.
El equipo con el cual se trabajo fue un cromatógrafo de líquidos de alta resolución
de marca Agilen, modelo 1110 series.

4. Resultados
Datos del equipo utilizado:
· Cromatógrafo liquido de alta resolución, marca Agilent, modelo Series 1100.
· Detector de diodos y de longitud de onda múltiple, ultravioleta. REM (vis-uv)
· Columna Performance RP-18C, diámetro 4,6 mm. Largo 100 mm.
· Bomba cuaternaria, Agilent serie 1100. Desgacificador de vacío, detectores de
diodos y de longitud de onda múltiple.
· Inyector tipo automático.
Cromatógrama
Cromatógrama obtenidos en la práctica con sus respectivas condiciones.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min
1) Condiciones de trabajo:
λ = 210 nm
Flujo de fase móvil = 0,2
S/Gradiente
Fase Móvil = 50% CH3OH y 50% KH2PO4.
Volumen muestra inyectada = 10 μL.
mAU
800
700
600
500
400
300
200
100
0
DAD1 A, Sig=210,10 Ref=off (AFE000024.D)

5. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 min
2) Condiciones de trabajo:
λ = 210 nm
Flujo de fase móvil = 0,4
S/Gradiente
Fase Móvil = 50% CH3OH y 50% KH2PO4.
Volumen muestra inyectada = 10 μL.
3) Condiciones de trabajo:
mAU
600
500
400
300
200
100
0
DAD1 A, Sig=210,10 Ref=off (AFE000025.D)
0.075
0 1 2 3 4 5 6 min
mAU
1000
800
600
400
200
0
DAD1 A, Sig=210,10 Ref=off (AFE000026.D)

6. λ = 210 nm
Flujo de fase móvil = 0,4
S/Gradiente
Fase Móvil = 30% CH3OH y 70% KH2PO4.
Volumen muestra inyectada = 10 μL.
0 2 4 6 8 10 12 min
4) Condiciones de trabajo:
λ = 210 nm
Flujo de fase móvil = 0,4
S/Gradiente
Fase Móvil = 20% CH3OH y 80% KH2PO4.
Volumen muestra inyectada = 10 μL.
mAU
500
400
300
200
100
0
DAD1 A, Sig=210,10 Ref=off (AFE000027.D)

7. 0 2 4 6 8 10 12 14 min
5) Condiciones de trabajo:
λ = 210 nm
Flujo de fase móvil = 0,4
C/Gradiente
Fase Móvil = a los 3 min 40% CH3OH y 60% KH2PO4 a los 7 min 10% CH3OH y
90% KH2PO4. Estas variaciones significa que se aplico gradiente.
Volumen muestra inyectada = 10 μL.
mAU
300
250
200
150
100
50
0
DAD1 A, Sig=210,10 Ref=off (AFE000028.D)
0 2 4 6 8 10 12 min
mAU
500
400
300
200
100
0
DAD1 A, Sig=220,10 Ref=off (AFE000029.D)

8. 6) Condiciones de trabajo:
λ = 210 nm
Flujo de fase móvil = 0,5
C/Gradiente
Fase Móvil = entre 1 min y 3 min 5% CH3OH y 95% KH2PO4, entre los 3 min y 7
min 40% CH3OH y 60% KH2PO4 por ultimo entre los 7 min y 10 min 5% CH3OH y
95% KH2PO4. Estas variaciones significan que se aplico gradiente.
Volumen muestra inyectada = 20 μL.
Según la comparación de los 6 Cromatógramas podemos determinar que el
caso numero 6 posee las condiciones optimas de trabajo para la cuantificación de
cefalexina y fenilglicinametilester.
Datos experimentales:
· tr cefalexina = 9:20 min
· tr fenilglicinametilester = 11:40 min
· W cefalexina = 1:20 min
· W fenilglicinametilester = 1:00 min
· Largo de la columna L= 10 cm
Formulas:
· N = 16 (tr/W)2

9. · Rs = 2(trb – tra)/ Wa + Wb
· N= L/H
Cálculos:
N cefalexina = 16(9:20 min/ 1:20 min) 2 = 940
N fenilglicinametilester = 16(11:40/1:00 min) 2 = 2079,4
Nx= 1510
H = L/Nx
H = 10 cm/ 1510
H = 6,62 * 10-3 cm
Rs = 2 *(700s – 560s)/ 80s + 60s
Rs = 2 ,00
Discusión
Los Cromatógramas obtenidos no entregan diferentes tiempos de retención como
también resoluciones de los peak de ambos antibióticos. Es por esto que del trabajo
podemos concluir que la prueba de condiciones numero seis nos da un buen resultado

10. puesto que no existe superposición de los peak, así como también los tiempos de
retención de los análitos no son exageradamente largos.
En presencia de las condiciones de trabajo de la prueba numero uno podemos
observar que la cefalexina no entrega un muy buen peak no ocurriendo lo mismo con la
fenilglicinametilester en donde el peak observado no es más bien grueso y no agudo
como el primero, este fenómeno puede provocar posibles errores al determinar la altura
del peak y así no cuantificar de buena manera el dato que se nos entrega. En las
condiciones de trabajo de la segunda prueba observamos una superposición de los
análitos por lo cual podemos determinar que la resolución que entregan estas condiciones
no es el más adecuado por lo cual se descarta. En la cuarta prueba podemos observar
que solo se observo un peak debido a que el tiempo de retención de nuestro segundo
análito es muy extenso por ello no es observado en la grafica, estas condiciones también
se descartan debido a que hace que nuestro análisis cromatografico sea muy largo así
pasando a llevar uno de los principios de esta metodología la cual debe ser confiable los
resultados y también rápidos. Por último para las condiciones número cinco y seis, las
cuales en comparación a las anteriores son las mejor evaluadas, podemos determinar que
poseen una muy buena separación de nuestros análitos pero para el numero cinco los
tiempo de retención son muy diferente lo cual que al determinar su resolución esta podría
no ser muy buena. Con respecto a las condiciones de la prueba numero 6 podemos
determinar que el análisis es más corto que la del análisis número cinco y también los
tiempos de retención de uno y otro peak son relativamente cercanos, lo cual no hace
pensar que esta condición es la optima para este análisis, es por esto que se determino
tanto el numero de platos teóricos dando un valor de y el valor de la resolución dando
como resultado un valor de 2,00.
Conclusión
· Se comprendió la utilización de un HPLC.
· Se busco satisfactoriamente las condiciones óptimas de trabajo para poder
analizar de mejor manera la mezcla de antibióticos.

11. · Se determino que las condiciones de trabajo optimas fueron las propuestas en la
prueba número seis.
· Se determino la resolución de esta última prueba dando un valor de.
· Los Cromatógramas obtenidos fueron muy diversos por lo cual podemos decir que
ante una futura complicación podemos saber de antemano que valor variar para
obtener un mejor resultado, a modo de ejemplo, para el caso número cuatro que
se obtiene un tiempo de retención muy alto se puede variar el flujo de la fase móvil
y así disminuir este tiempo.
· El manejo del equipo no complico en demasía.
· La práctica del laboratorio resulto de buena manera y se cumplió el objetivo
principal de nuestra actividad.

12. Bibliografía
1- SKoog D. Holler F. & Nieman T. “Principios de Análisis Instrumental”. Quinta
edición. Pag. 785-791. Editorial Mc Graw Hill. España (2001).
2- Hernández L. & Gonzales C. “Introducción al Análisis instrumental”. Pag 407-412.
Primera edición. Editorial Ariel S.A. España (2002).
3- SKoog D. West R. & Holler F. “Fundamentos de Química Analítica”. Cuarte
Edición. Pag 718-730. Editorial Reverté S.A. Barcelona, España (1997).
4- http://www.profeonline.com/laboratorioquimico/mod_12/docs/cromatografia_funda
mentos_y_aplicaciones.pdf