1. RESUMEN TESIS DOCTORAL
UNIVERSIDAD DE BARCELONA
FACULTAD
DE FARMACIA
DEPARTAMENTO
DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
CARACTERIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS P1 Y HCPRO DEL
IPOMOVIRUS DEL MOTEADO SUAVE DE LA BATATA (SWEET
POTATO MILD MOTTLE VIRUS, SPMMV) EN SUPRESIÓN DE
SILENCIAMIENTO GÉNICO
ANA GINER RUBIO
2010

2. RESUMEN
El virus del moteado suave de la batata, Sweet potato mild mottle virus SPMMV, es el
miembro tipo del género Ipomovirus dentro de la familia Potyviridae. Es un virus con genoma
de RNA de cadena sencilla y sentido mensajero, que se encuentra ampliamente distribuido en
las regiones donde se cultivan batatas, siendo un componente frecuente de las asociaciones
virales que causan graves enfermedades en este cultivo. En el presente trabajo se ha estudiado
un aislado africano de SPMMV, abordando el análisis de la estructura genómica de la región 5'
de su genoma, con especial atención a dos funciones esenciales en el ciclo del virus como son la
posible dispersión mediada por insectos vectores y la capacidad de suprimir defensas basadas
en silenciamiento génico postranscripcional en las plantas huéspedes. Se han identificado dos
proteínas, P1 y HCPro, en el extremo amino de la poliproteína viral, y la proteína CP en su
extremo carboxilo, obteniéndose sus secuencias. En relación a la capacidad de transmisión por
insectos, los intentos de reproducir en condiciones experimentales el proceso utilizando
moscas blancas de la especie Bemisia tabaci como organismos vectores han sido infructuosos. El
análisis de interacciones entre genes virales empleando el sistema de dos híbridos de levaduras
ha identificado las uniones de HCPro y de CP consigo mismas, pero no la interacción entre ellas
que se considera esencial en el caso de potyvirus transmitidos por pulgones, lo que podría
explicar la no transmisbilidad del aislado estudiado. En cuanto a la capacidad de suprimir
silenciamiento, se ha identificado P1 como el supresor de SPMMV, con únicamente un posible
papel subalterno en incrementar la duración del efecto en el caso de HCPro expresado en cis
junto a P1. Se ha investigado el mecanismo de acción de la proteína P1 de SPMMV en supresión
de silenciamiento, encontrando que no impide la aparición de pequeños RNAs ni bloquea la
dispersión sistémica de la señal de silenciamiento, pero en cambio es capaz de interferir en la
actividad de complejos RISC activados por miRNAs o siRNAs, tratándose del primer supresor
viral para el que se ha demostrado esta capacidad. Se ha comprobado tambien la existencia de
interacción entre P1 y la proteína Argonauta 1 (AGO1), componente esencial del complejo
efector del silenciamiento génico con actividad antiviral en plantas. La interacción se localiza
en la región N-terminal de P1 donde se encuentran presentes tres elementos de secuencia tipo
WG/GW característicos de proteínas celulares capaces de interaccionar con AGO1. Mediante
análisis mutacional de deleciones y modificaciones puntuales de los elementos WG/WG se ha
encontrado que se necesitan al menos dos de ellos para mantener la actividad en supresión de
silenciamiento, y que existe una correlación entre actividad y la capacidad de unión a AGO1.

3. SUMMARY
Sweet potato mild mottle virus, SPMMV, is the type member of the genus Ipomovirus
within the family Potyviridae. SPMMV is a virus with a single-stranded, positive-sense RNA
genome, broadly distributed in sweet potato growing areas, being a common component of the
viral asociations which cause severe diseases in this crop. In the present work, an african isolate
of SPMMV has been studied, addressing the analysis of its genomic structure in the 5' region,
focusing into two essential functions of the virus cycle as the insect-mediated virus dispersion,
and the ability to suppress RNA-silencing mediated defense reactions in the host plant. Two
proteins have been identified in the N-terminal part of the viral polyprotein, P1 and HCPro, and
the viral CP was also found in the C-terminal part, and their sequences have been determined.
Regarding insect-transmission functions, attempts to reproduce the process under experimental
conditions using Bemisia tabaci whiteflies have failed. The analysis of binding between viral
products using the two-hybrids yeast-based system has shown self-interactions of HCPro and
CP, while an interaction among them both has not been observed, a fact which might help to
explain the failure of insect transmission of this SPMMV isolate, since this interaction is known
to be essential for the process in the case of aphid-transmitted potyviruses. Concerning the
ability of RNA silencing suppressin, the P1 protein has been identified as the suppressor of
SPMMV, only finding a surrogate role for HCPro in extending the duration of the effect when
expressed in cis along with P1. The mechanism of action of P1 in RNA silencing suppression has
been investigated, finding no effects in the production of small RNAs nor in blocking the
systemic dispersion of the silencing signal, but a effective interference with miRNA- or siRNA-
activated RISC complexes, thus being the first silencing suppressor with such a capacity.
Existance of an interaction between P1 and Argonaute 1 (AGO1), an essential component of the
RNA silencing effector complex with antiviral activity in plants, has been observed. The
interaction is located in the P1 N-terminal region where three WG/GW sequence elements can
be found, being characteristic elements of AGO1-interacting cellular proteins. Throughout
mutational analysis using deletions and point modifications of these WG/WG elements it has
been shown that presence of at least two of them is required to maintain the activity on RNA
silencing suppression, and that a correlation between activity and AGO1-binding capacity
existed.