Los espermatozoides tienen unas características especiales para la congelación, en este trabajo se analizan estas características y su influencia en la supervivencia espermática aplicada a los bancos de semen. Entre ellas se encuentran factores propios del tipo celular a congelar y factores dependientes del protocolo de congelación. Dentro de los primeros podemos hablar del tamaño y la permeabilidad celular y entre los segundos nos encontramos la curva de congelación y la adicción de los crioprotectores. La curva de congelación se refiere a la respuesta celular a la congelación (shock por frío, formación de hielo y descongelación) que puede provocar lesiones crioinducidas como la formación de hielo intracelular, estrés osmótico o recristalización. Para evitar estos daños en todos los protocolos se describe como parte fundamental la adicción de agentes crioprotectores beneficiosos para la supervivencia celular aunque también recogen aspectos perjudiciales como su toxicidad. Por último se analizarán las bases y el papel de la vitrificación de espermatozoides en los bancos de semen.

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FUNDAMENTOS DE CRIOBIOLOGÍA ESPERMÁTICA PARA BANCOS
DE SEMEN
BASES OF SPERM CRYOBIOLOGY APPLIED FOR SPERM BANKS
Ana Fernández1, Maria del Carmen Gonzalvo1 Ana Clavero1, Rafael Ruiz de Assín1, Sandra Zamora1, María Roldán1, Belén Rabelo1, Juan Pablo
Ramírez2,3, Alberto Yoldi2, José Antonio Castilla1,2,3
1
Unidad de Reproducción Humana, Hospital Universitario “Virgen de las Nieves”, Granada.
2
Banco de Semen CEIFER, Granada.
3
Programa de Control de Calidad Externo para el Laboratorio de Reproducción de la Asociación para el Estudio de la Biología de la Reproducción
(ASEBIR), Madrid.
Para contacto: José Antonio Castilla Alcalá: Unidad de Reproducción. C/ Dr. Azpitarte S/N Edificio de consultas externas Hospital Materno-
Infantil CP.18014 josea.castilla.sspa@juntadeandalucia
RESUMEN
Los espermatozoides tienen unas características especiales para la congelación, en este trabajo se analizan estas características
y su influencia en la supervivencia espermática aplicada a los bancos de semen. Entre ellas se encuentran factores propios del
tipo celular a congelar y factores dependientes del protocolo de congelación. Dentro de los primeros podemos hablar del
tamaño y la permeabilidad celular y entre los segundos nos encontramos la curva de congelación y la adicción de los
crioprotectores.
La curva de congelación se refiere a la respuesta celular a la congelación (shock por frío, formación de hielo y descongelación)
que puede provocar lesiones crioinducidas como la formación de hielo intracelular, estrés osmótico o recristalización. Para
evitar estos daños en todos los protocolos se describe como parte fundamental la adicción de agentes crioprotectores
beneficiosos para la supervivencia celular aunque también recogen aspectos perjudiciales como su toxicidad. Por último se
analizarán las bases y el papel de la vitrificación de espermatozoides en los bancos de semen.
Palabras clave: banco de semen, criobiología, vitrificación
ABSTRACT
The spermatozoa have special freezing characteristics, these characteristics and influences on the spermatic survival applied
to the sperm banks are analyzed in this work. Among them we find particular freezing factors depending on cellular type and
freezing protocol. Among those we will begin with size and the cellular permeability and secondly we will look the freezing curve
and the addition of the cryoprotectors.
The freezing curve refers to the cellular response to freezing (cold shock, ice formation, and thawing) which could provoke
cryoinjuries such as intracellular ice formation, osmotic stress or re-crystallization. In order to avoid these damages all
protocols as a basic measure describe the addition of cryoprotecting agents as beneficial to the survival of the cell although
they also inflict detrimental aspects due to their toxicity. Finally the bases and the role of the vitrification of the spermatozoa
in the sperm banks will be analyzed.
Key words: sperm bank, cryobiology, vitrification
INTRODUCCIÓN cabo reacciones químicas. Por tanto, las número de moléculas que hay en ella y
dificultades de la congelación no no de la naturaleza de estas. Así, al
El objetivo principal de la derivan de la permanencia a bajas añadir un soluto a una disolución
criopreservación de espermatozoides es temperaturas sino de los procesos de disminuye el punto de congelación
mantener su viabilidad y funcionalidad a enfriamiento y calentamiento. (punto crioscópico) y la presión de vapor,
bajas temperaturas durante largos y aumenta la presión osmótica y el punto
periodos de tiempo. Las células Durante estos procesos las células se de ebullición. La ósmosis es el
criopreservados se almacenan a -196ºC encuentran en suspensión en una movimiento del agua desde soluciones
en nitrógeno líquido. A esta temperatura solución acuosa. Dicha solución tendrá con baja concentración de soluto hasta
no existen fenómenos ni de difusión ni unas propiedades coligativas que soluciones con alta concentración de
energía térmica suficiente para llevar a dependen fundamentalmente del soluto y la presión osmótica es la presión

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hidrostática que se genera a través de una cuanto menor es la temperatura del fase lipídica (Drobnis et al., 1993). El
membrana semipermeable con un sistema, menor es la permeabilidad de la daño de enfriamiento (chilling injury) es
gradiente de concentración. Estas membrana. De esta manera la membrana el daño debido a la sensibilidad frente a
propiedades deberemos tenerlas presentes celular pierde su carácter semipermeable una temperatura específica o un rango
cuando al disminuir la temperatura durante para pasar a tener un carácter de temperaturas.
el proceso de congelación empiece a impermeable, por debajo de una cierta
formarse hielo en el medio extracelular, temperatura crítica. Cuando enfriamos el Los ácidos grasos pueden existir en un
pues el agua que forma parte del hielo no sistema por debajo de dicha temperatura estado rígido ordenado (gel) o en
contiene los solutos que tenía disueltos, crítica, el proceso de deshidratación se uno más flexible y relativamente
aumentando la concentración de estos en detiene, esto se traduce en un aumento desordenado (fluido). La transición de
el medio extracelular (hiperosmótico) de la probabilidad de formación de hielo un estado al otro se da en un rango de
y modificando las propiedades coligativas intracelular. Experimentos de laboratorio temperaturas, la media de la cual se
de este. muestran que la permeabilidad de la conoce como temperatura de transición
membrana celular, además de variar con de fase (“melting temperature”, Tm).
Durante estos procesos las células la temperatura del sistema, también Esta temperatura de transición será
se comportan como osmómetros, depende de la concentración de soluto en mayor o menor dependiendo de la
variando su volumen en respuesta a los el medio extracelular. composición de los ácidos grasos de la
cambios osmóticos extracelulares, así membrana. La mayoría de las
las células pierden o captan agua El contenido de la “bolsa”, es decir, el membranas de células eucariotas tienen
según se expongan a medios medio intracelular estará constituido su Tm entre los 0ºC y los 20ºC.
extracelulares híper o hipo osmóticos, por dos regiones:
respectivamente; los movimientos de La transición de fase en una membrana
agua y crioprotectores a través de la VOLUMEN OSMÓTICAMENTE INACTIVO plasmática no se da simultáneamente en
membrana celular durante la todos sus fosfolípidos y por tanto se
criopreservación se rigen por diversos En esta región incluimos orgánulos espera la coexistencia de dominios en
parámetros biofísicos que deben ser internos de la célula, el núcleo celular, estado fluido y dominios en estado gel
definidos para cada tipo celular a macromoléculas como por ejemplo durante la transición. Esta situación
diferentes temperaturas, y en definitiva proteínas, etc. Son partes internas de produce defectos en el empaquetamiento
serán los responsables del daño celular. la célula que no van a intervenir en el de las membranas y está asociado a una
proceso del transporte del agua. Se mayor permeabilidad de solutos a través
CONCEPTOS GENERALES DEL TRASNPORTE define como el agua que nunca dejará de esta. Así, se ha demostrado que al
A TRAVÉS DE LAS MEMBRANAS DURANTE el interior celular en respuesta a un alcanzar la temperatura de transición en
LA CONGELACIÓN Y DESCONGELACIÓN aumento de concentración de solutos una bicapa determinada, se produce la
en el espacio extracelular por estar mayor pérdida de solutos a través de la
A modo de ejemplo, podemos considerar asociado a las macromoléculas y membrana.
una célula como una “bolsa” rellena de una estructuras intracelulares. Si una célula
solución salina sumergida en un medio de se deshidrata y reduce su tamaño Además esta alteración causa
congelación (medio extracelular). El más allá del volumen osmóticamente alteraciones físicas de la membrana
envoltorio de la bolsa, es decir, la inactivo puede comprometerse la plasmática por la inducción de fallos en
membrana celular tendrá propiedades de viabilidad de esta (Hipótesis de el empaquetamiento de lípidos, las
membrana semipermeable. volumen mínimo de Meryman para alteraciones transitorias de la fase
explicar el daño celular durante la lipídica causan respuestas cinéticas no
Las dos características principales que congelación) (Meryman, 1970). lineales en algunas enzimas, incluidas
van a definir el comportamiento de la algunas ATPasas de membrana. Es
membrana son: el tamaño y la VOLUMEN OSMÓTICAMENTE ACTIVO probable que tales efectos sean en parte
permeabilidad. responsables del mal control de la
En esta región incluimos la solución concentración del calcio celular lo que es
TAMAÑO intracelular en la que están flotando los evidente a temperaturas por debajo de
orgánulos internos, el núcleo, etc., y que los 17 ºC (Bailey et al., 1994).
Es el área de membrana disponible para si puede abandonar la célula.
intercambiar agua con el medio exterior.
RESPUESTA CELULAR A LA CONGELACIÓN El choque térmico puede ser mitigado
PERMEABILIDAD. por agentes crioprotectores, la
SHOCK POR FRÍO Y DAÑO DE ENFRIAMIENTO presencia de ciertos fosfolípidos
Este parámetro define la facilidad con la (DESDE 37ºC A 0ºC) (fosfatidil serina), una congelación
que el agua puede atravesar la lenta y pre acondicionamiento en un
membrana ante un gradiente de El shock por frío (cold shock) es el daño medio con un nivel elevado de sales. El
concentraciones. La permeabilidad de la celular debido a la sensibilidad frente a espermatozoide humano parece
membrana celular esta regulada por una la velocidad de enfriamiento, y es afectarse poco por el shock por frió y
ley que refleja el hecho empírico de que causada por efectos de transición en la daño por enfriamiento, probablemente

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gracias a la composición de su
membrana (Holt, 2000)
FORMACIÓN DE HIELO (0ºC A <-132ºC)
La respuesta de las células al
enfriamiento, depende del método de
enfriamiento. En particular la velocidad
de enfriamiento es el parámetro crítico
que determina los resultados del
protocolo de criopreservación. A
continuación vamos a describir los
procesos básicos que han sido
observados, cuando se induce hielo en
el medio extracelular, en función del
perfil de enfriamiento aplicado.
La existencia de solutos en el agua
produce un descenso del punto de Fig. 1 Curva de congelación.
congelación (punto crioscópico entre - (1)Nucleación: liberación de calor por formación de cristales, provocando ascenso de la temperatura.
5ºC y -10ºC) y en consecuencia la
(2) La Tª de la muestra no descienda en paralelo con la caída de la temperatura, pudiendo permanecer
cristalización del agua se produce a estática durante 2-3 min.
temperaturas menores a la del punto de
congelación del agua pura (0ºC). Esto temperatura inducido pretende evitar única razón: el agua que forma parte del
produce, al disminuir la temperatura, un fluctuaciones de temperatura sobre las hielo no contiene los solutos que tenía
sobreenfriamiento de la muestra (Mazur, membranas celulares. Esto es debido a disuelta cuando formaba parte de la
1977). En esta situación el comienzo del que al congelarse el medio de disolución acuosa del medio
proceso de formación de hielo es de congelación se libera calor por la extracelular. Por lo tanto, cuando
naturaleza aleatoria, y depende de la formación de cristales (calor latente de comienza a formarse hielo fuera de las
probabilidad de formación de un punto la fusión) que provoca un fuerte células, simultáneamente se está
de nucleación, punto de inicio de un aumento en la temperatura y como produciendo un aumento de la
frente de cristales de hielo que es consecuencia la temperatura de las concentración de los solutos disueltos
inversamente proporcional a la células no disminuye en paralelo con la en el medio extracelular.
temperatura. Cuanto mayor sea la caída de la temperatura del dispositivo de
diferencia entre la temperatura a la que congelación. De hecho, la temperatura de Mientras tanto, en el interior de las
comienza a formarse hielo y la la muestra puede permanecer estática células no se ha producido cambio
temperatura de cambio de fase, mayor durante 2-3 min antes de reanudarse el alguno. Debido a la naturaleza
será la velocidad de crecimiento de los enfriamiento. Varios estudios han semipermeable de la membrana celular,
cristales de hielo. En el peor de los demostrado que este período entre la este gradiente en la concentración de
casos, puede ocurrir que la temperatura formación de hielo y la reanudación de solutos entre el medio extra e
a la que comienza a formarse hielo sea enfriamiento, el punto de congelación intracelular origina una sobrepresión del
tan baja, que la velocidad de crecimiento meseta, es perjudicial para la lado de la disolución que tiene una
de los cristales resulta explosiva. En supervivencia celular (Fuller et al., 2004). concentración de solutos menor, que
estas condiciones los cristales de hielo En los protocolos habituales de desencadena un flujo de disolvente puro
actúan como lanzas que atraviesan las congelación de semen no se realiza el desde la región menos concentrada
células, destruyéndolas por completo. “seeding” o nucleación inducida pues no hacia la región de mayor concentración.
se ha visto que mejoren las tasas de Esta sobrepresión se puede interpretar
Para evitar este problema, en algunos supervivencia, lo cual puede ser debido a como la diferencia de presiones
protocolos, se induce la formación de que el espermatozoide humano contiene osmóticas que tienen las dos
hielo extracelular (nucleación ó una matriz intracelular altamente viscosa disoluciones.
seeding), mediante un descenso brusco gracias a la abundancia de proteínas y
de temperatura (fig.1) para garantizar azucares. Su pequeño tamaño, hace que Vemos por tanto que la formación de
que cuando la temperatura del sistema su contenido de agua sea bajo y su hielo extracelular, tiene como
sea la de cambio de fase, tengamos estructura compartimentalizada hace que consecuencia la evacuación de agua
hielo. Existen numerosas maneras de la formación de pequeños cristales desde el medio intracelular hacia el
inducir la formación de hielo. En el caso intracelulares no afecte a toda la célula medio extracelular, en un proceso que
de muestras de células aisladas se toca sino a zonas aisladas. llamaremos Deshidratación Celular.
la muestra con una aguja fría, a una
temperatura inferior a la de cambio de La formación de hielo extracelular En el espacio intracelular no tiene lugar
fase. Además este descenso de rompe el equilibrio isotónico por una la formación de hielo en estos momentos

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(<-10ºC) posiblemente por la barrera LESIONES CRIOINDUCIDAS de hielo en la solución extracelular
física que impone la membrana celular al superenfriada (Nei ,1978).
proceso de nucleación y al crecimiento de Cuando la temperatura del medio alcanza
los cristales de hielo. Además, la los -132ºC, el agua no existe en estado Por otra parte, observaciones
probabilidad de iniciar la nucleación en el líquido y los canales donde se encuentran experimentales muestran que cuando
medio intracelular es mucho menor que las células se encuentran en un estado enfriamos muestras a altas velocidades, la
en el medio extracelular ya que la vítreo (con una alta viscosidad) y sin supervivencia de las células al proceso de
nucleación está directamente relacionada cristalización, un estado en el que los criopreservación disminuye conforme
con el tamaño del compartimiento a fenómenos de difusión de las reacciones aumentamos la velocidad de
congelar (Mazur, 1963). bioquímicas no son posibles (Mazur, enfriamiento. Y que cuando enfriamos
1984) (Tabla 1). Por tanto parece claro muestras a muy bajas velocidades,
Paradójicamente la formación de hielo
extracelular, en principio podría evitar
que se formase hielo dentro de la célula,
ya que al aumentar la concentración de
solutos en la región intracelular, el punto
crioscópico disminuye. Por lo tanto
podemos tener una solución intracelular
líquida a temperaturas muy inferiores a
los cero grados centígrados, que es
aproximadamente el punto crioscópico
(temperatura en que se produce el cambio
de fase liquida a sólida) del medio
intracelular original, cuando existía
equilibrio isotónico natural. No obstante,
esto no llega a ocurrir debido a que la
velocidad con que la célula es capaz de
evacuar agua es muy pequeña comparada
con la velocidad con que disminuye la
temperatura.
DESCONGELACIÓN
Durante la descongelación se
reproducen los cambios osmóticos
inversos a los descritos para la
congelación. Así, cuando el agua Tabla 1. Daños espermáticos durante la crioconservación.
congelada cambia de estado (sólido a
líquido), la concentración de solutos en que la formación de hielo extracelular no la supervivencia de las células al proceso
el medio extracelular se reduce es la responsable del daño celular ya que de criopreservación disminuye conforme
progresivamente y la célula vuelve a las células criopreservadas se mantienen disminuimos la velocidad de enfriamiento
hidratarse para compensar esta en dichos canales de solución no (Fig. 2). Cuando la supervivencia celular
diferencia de concentraciones entre el congelada mientras crecen los cristales se dibuja en función de la velocidad de
exterior y el interior celular.
Generalmente se considera que para la
recuperación de las células son necesarias
tasas de recalentamiento rápidas. Esto se
ha atribuido a la posibilidad de que
pequeños cristales de hielo intracelular
formados en algunas células durante la
congelación podrían crecer durante un
proceso lento de recalentamiento,
produciéndose el concepto de
congelación durante el calentamiento,
también llamado recristalización. Sólo si
el calentamiento es tan rápido como para
evitar el crecimiento de los cristales de
hielo este fenómeno puede evitarse (Rall Fig.2: porcentaje de daño celular en relación a la velocidad de enfriamiento por efecto osmótico (----) ó por
et al., 1980). formación de cristales (——).

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enfriamiento, el resultado produce una proteínas. Lo que si se sabe es que desnaturalización de estas mediante la
curva característica “forma de U cuanto mayor sea la cantidad de hielo formación de puentes de disulfuro entre
invertida”(Fig. 3). formado dentro de la célula, menor es la aminoácidos (Lovelock, 1953; Karow, 1965)
esperanza de que la célula sobreviva.
La segunda hipótesis (hipótesis del
volumen celular mínimo) relaciona el
efecto de la deshidratación producida
durante la concentración de solutos y la
muerte celular con la vuelta a las
condiciones isotónicas después de la
congelación (choque osmótico)
(Merryman, 1970). Se basa en que el
volumen se reduce en relación al
aumento de la osmolaridad extracelular,
a medida que la célula pierde volumen
por la pérdida de agua, la compresión del
contenido citoplasmático aumenta la
resistencia de la célula a seguir
perdiendo volumen, y al excederse la
resistencia física de la membrana se
producirán lesiones irreversibles en su
permeabilidad y pérdida de lípidos de la
Fig. 3: Relación entre el porcentaje de supervivencia y la velocidad de enfriamiento. membrana celular. Esta perdida
afectaría a la integridad de la membrana
Para tratar de explicar este doble Podríamos pensar, llegados a este punto plasmática que perdería su capacidad de
comportamiento de la supervivencia que un buen protocolo de expansión durante la rehidratación al
frente a las velocidades de enfriamiento, criopreservación sería aquel en el que la volver a condiciones isotónicas.
se ha propuesto una teoría denominada velocidad de enfriamiento fuera tan
Hipótesis de los Dos Factores (Leibo, lenta que apenas formásemos hielo, En resumen, a velocidades de
1970). En ella se proponen dos pues permitirá la salida de todo el agua enfriamiento lentas el daño celular se
mecanismos distintos como causa de los intracelular. Sin embargo existe otro produce por la elevada concentración de
daños en las células, durante el protocolo mecanismo que provoca daños celulares solutos en el medio extra celular y a
de criopreservación (producción de y que precisamente actúa cuando las elevadas velocidades de enfriamiento
hielo y deshidratación celular o estrés velocidades de enfriamiento son muy por la formación de hielo intracelular.
osmótico). Siendo clave para determinar reducidas, lo que hace inviable este Existe una velocidad de enfriamiento
la importancia de cada factor la velocidad protocolo que acabamos de proponer. para cada célula en la cual estos dos
de congelación (Fig.2). daños son bajos denominándose,
ESTRÉS OSMÓTICO velocidad optima de enfriamiento,
FORMACIÓN DE HIELO INTRACELULAR alcanzándose un máximo en la
Este mecanismo, activo a bajas probabilidad de supervivencia de las
A partir de que se inicia la nucleación velocidades de enfriamiento, está células a la criopreservación.
extracelular y la correspondiente relacionado con la deformación
deshidratación celular lo que suceda en mecánica de la célula, debida a la A pesar de que se ha comprobado la
el espacio intracelular depende reducción de tamaño originada por el validez universal de la hipótesis
básicamente de la velocidad de proceso de deshidratación tan intenso, de los Dos Factores en todas las
enfriamiento (Mazur, 1963; Nei et al., y a la prolongada exposición de la célula células estudiadas, el protocolo de
1970). Si ésta es demasiado rápida, la a elevadas concentraciones de criopreservación que optimiza la
célula puede no ser capaz de electrolitos. Este mecanismo se conoce supervivencia no es universal, es decir,
deshidratarse suficientemente rápido y como “Efecto de Solución” ( Mazur et al., cada tipo de célula requiere su propio
al llegar a la temperatura de nucleación 1970) Existen básicamente dos teorías protocolo optimizado, de acuerdo con sus
intracelular, el agua remanente se complementarias para explicar el propiedades biofísicas (Nijs et al., 2001).
congela formando hielo intracelular. La fenómeno de estrés osmótico durante la
manera en la que este hielo daña a la criopreservación. RECRISTALIZACIÓN
célula, no es del todo conocido, pero se
piensa que es debido a una disfunción de La primera (hipótesis de altas El agua en estado líquido, al enfriarse va
origen mecánico de las propiedades de concentraciones de iones) achaca a las formando cristales y como hemos
la membrana celular y de otras interacciones de las altas concentraciones comentado esta formación no es
estructuras celulares suspendidas en su de iones alcanzadas en el medio homogénea, existiendo al mismo tiempo
interior, como pueden ser orgánulos extracelular con las proteínas de en estado líquido y sólido. El agua en
celulares o grandes macromoléculas de membrana, lo que provocaría la estado líquido se va haciendo cada vez

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mas viscosa, hasta que alcanza los -132º Los crioprotectores pueden clasificarse Existen dos formas diferentes de
C, en donde es tan viscosa que no puede en agentes penetrantes y no penetrantes, adicción o disminución gradual del CPA
convertirse en cristal, llamándose a esa de acuerdo a la permeabilidad a través de al medio. En la primera, la solución de
fase estado vítreo. la membrana celular. CPA (en el caso de adición) o un medio
de cultivo (en el caso de dilución) se
Todos los materiales biológicos deben CPA PENETRANTES añaden en distintos pasos pero con un
almacenarse por debajo de la temperatura “volumen fijo”. En la segunda, la adición
de transición de fase del agua de líquido a Son sustancias de bajo peso molecular y de CPA o diluyente varían en volumen
estado vítreo (aproximadamente-132ºC) permeables a través de la membrana, que para producir cambios equilibrados en la
para poner fin a toda actividad biológica. protegen a la célula de las lesiones molaridad del CPA. Esto ha sido
A temperaturas superiores a -132ºC se producidas por las congelaciones a denominado como “fixed molar step”
reduce la longevidad celular a cuestión de velocidad lenta. Los más utilizados son: (Gao et al., 1995; Gilmore et al., 1997).
semanas o meses, pues aun puede existir 1,2-Propanodiol (PROH), Dimetilsulfóxido
agua líquida y por lo tanto actividad (DMSO), Etilén-Glicol (EG), Glicerol. Aunque células pequeñas (como
celular. Todos estos compuestos tienen en espermatozoides) contienen muy poca
común que sus moléculas son pequeñas, agua, su cantidad corresponde en gran
La transición a estado vítreo de una es decir, tienen un peso molecular parte (45-75%) al volumen
solución acuosa congelada no ocurre relativamente bajo; así el glicerol tiene osmóticamente inactivo, y esto es lo que
repentinamente en -132ºC; sino que es 92.09 de peso molecular, lo que le hace que se deshidrate muy poco en
un fenómeno progresivo entre esta permite atravesar la membrana celular. comparación con otras células. Los
temperatura y -90ºC. En una célula Si bien la célula es permeable a estos espermatozoides humanos se pueden
congelada a -196ºC que pasa a -80ºC, agentes su permeabilidad nunca es de la hinchar sólo un 110% de su volumen
algunas moléculas de agua vuelven a misma magnitud que la del agua. Dentro isosmótico original mientras que pueden
estado líquido que pueden convertirse de este grupo el glicerol es el más usado disminuir un 75% de su volumen y
en cristales que provocan pequeños en la criopreservación espermática. retener ≥90% de su motilidad original
daños de recristalización. El problema es (Gao et al., 1995). Como vemos los
que los pequeños daños son CPA NO PENETRANTES espermatozoides toleran menos un
acumulativos; y cada incidente de fuerte hinchazón que un encogimiento,
calentamiento que se produzca por Son sustancias de alto peso molecular, y es por eso que la eliminación del CPA
encima de -132ºC (por Ej. El sacar un que son efectivas cuando se utilizan tras la descongelación puede tener un
canastier del nitrógeno líquido para velocidades altas de congelación. El efecto dramático sobre las tasas de
extraer otra pajuela) contribuirá a tamaño de estas moléculas es muy supervivencia espermática.
disminuir la supervivencia funcional de superior a las del grupo anterior. Así
las células criopreservadas. por ejemplo, el peso molecular de la Si la dilución del CPA se realiza en un
sacarosa es 342. No son crioprotectores solo paso, se obtiene un incremento del
AGENTES CRIOPROTECTORES propiamente dichos, ya que no volumen espermático del 160 % y una
penetran en la célula sino que ejercen pérdida de aproximadamente el 70% de
Además de una adecuada velocidad de su acción crioprotectora promoviendo la motilidad. Por el contrario, el máximo
enfriamiento, para mejorar la la rápida deshidratación celular y aumento del volumen de un célula
viabilidad celular es necesario alterar suelen usarse asociados a los agentes utilizando una dilución “fixer molar
el comportamiento físico-químico de penetrantes. Los más utilizados son: step” nunca supera el límite superior del
las soluciones acuosas en las cuales Sacarosa, Glucosa, Dextrosa, Polivinil- volumen celular y por consiguiente no
tiene lugar la criopreservación, para pirrolidona (PVP), Dextrano y tienen ningún efecto adverso sobre la
ello se añaden al medio de congelación Polietilen-glicol (PEG), (en congelación supervivencia espermática. Además la
los agentes crioprotectores (CPA). Los de semen humano las más usados son adición de CPA también parece causar
CPA son sustancias muy hidrosolubles los dos primeros). menor daño cuando se realiza
y de baja citotoxicidad que disminuyen gradualmente (Gilmore et al., 1997).
el punto eutéctico de una solución Dependiendo de la permeabilidad del Todo lo anterior obliga a cuidar al
determinada (temperatura mínima a la crioprotector utilizado y de su máximo el tiempo empleado en la
que una solución se encuentra en citotoxicidad, la adición se realiza a adición de los medios de congelación al
estado líquido). El descenso del punto distintas temperaturas. Los agentes semen y la dilución con medio de cultivo
eutéctico implica que se alcanzará una crioprotectores pueden añadirse y tras descongelación, siendo necesario
concentración dada de solutos a una extraerse en pasos, es decir aumentando invertir varios minutos en ello según
temperatura menor, de forma que en el o disminuyendo gradualmente la cada protocolo.
momento en el que se induce la concentración de crioprotector en el
nucleación en el espacio extracelular la medio, lo que reduce el stress osmótico BENEFICIOS DE LOS CPA
célula estará más hidratada y el sobre la célula a congelar; o bien
gradiente osmótico al que estará añadirse (o extraerse) en un solo paso, A pesar de que el uso de estas sustancias
sometida será menor en el momento en lo que reduce el tiempo de exposición en los protocolos de criopreservación es
que el espacio extracelular se congela. celular al crioprotector. una práctica habitual, los mecanismos

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de protección no son del todo conocidos. condiciones sin CPA. Este efecto ‘salt porque aumentan la osmolaridad del
Los mecanismos que con certeza se buffering’ podría impedir el medio. Las células inicialmente se
saben que actúan a favor de la establecimiento crítico de altas deshidratan para compensar la fuerza
supervivencia celular son mecanismos concentraciones de soluto en la fracción osmótica inducida por la presencia de los
físicos: residual de congelación hasta que el CPA y después se hidratan a la vez que el
sistema se enfría llegando a agua vuelve al interior celular junto con
-Dilución de los electrolitos: La alta temperaturas muy bajas donde toda la el CPA (permeable). Cuando el CPA
concentración de los electrolitos en las actividad molecular es inhibida permeable entra en la célula (lo hace
últimas etapas de la deshidratación (Lovelock et al., 1954). más lentamente que el agua, debido a un
celular, fue una de las hipótesis de los mayor coeficiente de permeabilidad de
mecanismos causantes de la muerte -Otros mecanismos de naturaleza la membrana al agua que al CPA), las
celular. Los CPA protegen a la célula de bioquímica, se sospecha que son células regresan a su volumen isotónico
los efectos de los solutos. Este objetivo también causantes de la elevada tasa de normal. Tras la eliminación del CPA
se logra porque las CPA diluyen la alta supervivencia que se alcanza al añadir permeable por dilución de la muestra
concentración de electrolitos. Este agentes crioprotectores. Tan sólo tras la descongelación, el agua entra en
efecto es descrito por la “regla de fases”, comentaremos a modo de ejemplo que las células rápidamente, debido al
que establece que en un sistema de dos ciertos agentes crioprotectores podrían gradiente osmótico que se genera, y
fases, como agua líquida y hielo a en una estabilizar la membrana celular entonces el CPA sale de las células más
presión dada, la concentración total de mediante interacciones electrostáticas lentamente; por lo tanto, las células se
soluto en la fase líquida es constante para con los fosfolípidos de ésta hinchan antes de alcanzar el equilibrio.
una determinada temperatura. Así, como (Hammerstedt et al., 1990). Estos cambios en el volumen de la célula
el agua se solidifica en hielo, la solución (contracción e hinchazón) pueden ser lo
restante contendrá progresivamente En resumen, los crioprotectores reducen suficientemente grandes como para
mayores concentraciones de CPA y la cantidad de hielo formado a una causar un daño celular irreversible. A la
electrolitos. Como la concentración total temperatura determinada y por tanto la presión osmótica a partir de la cual se
de CPA y electrolitos debe ser constante, concentración de soluto durante la producen estos daños se le denomina “
mayor es la concentración de CPA y congelación y así la deshidratación límite de tolerancia osmótica”. Estos
menor es la concentración de celular. Esta reducción en la límites son únicos no sólo para cada tipo
electrolitos. Así, la CPA efectivamente deshidratación celular hará que la célula de celular, sino también para cada
diluye la concentración de electrolitos no llegue nunca al volumen celular especie celular.
en la solución limitando así su toxicidad. mínimo durante el proceso de
congelación. -Cambios en la permeabilidad al agua de
-Disminución de la concentración de la membrana plasmática: diferentes
agua: El otro mecanismo que causaba ASPECTOS PERJUDICIALES DE LOS CPAS CPAs reducen la permeabilidad al agua
muerte celular era la formación de hielo en diversos grados, y así los
intracelular. Al introducir en el medio A pesar de los bien conocidos efectos espermatozoides se deshidratan más
más moléculas (de crioprotector), los beneficiosos de los agentes lentamente de lo esperado (Gilmore et
cristales de hielo en crecimiento tienen crioprotectores, éstos pueden ser muy al., 1995). El flujo de agua en la
una mayor dificultad para encontrar dañinos, especialmente cuando son membrana es realizado por dos vías, por
moléculas de agua y seguir así empleados en altas concentraciones. Los canales proteicos y a través de la bicapa
creciendo, reduciendo de esta manera el principales efectos dañinos son dos: lipídica. Por lo tanto, un CPA podría
riesgo de muerte celular. afectar la permeabilidad de la
-Toxicidad: Los agentes crioprotectores membrana en al menos tres maneras.
-Aumento de la viscosidad: Al añadir son sustancias químicas que en Primero, el CPA podría modificar la
sustancias crioprotectoras al medio condiciones normales no se encuentran bicapa lipídica, causando un cambio en
intracelular, la viscosidad de éste en el interior de las células. Por ello, su permeabilidad. Segundo, una
aumenta. Esto reduce la movilidad de las cuando atraviesan la membrana celular modificación de la bicapa lipídica podría
moléculas en su seno, por lo que la y se difunden por el medio intracelular, afectar indirectamente a la actividad
formación de cristales de hielo se ve lo que realmente estamos haciendo es trasportadora de las proteínas de
menguada, aumentando de esta manera envenenar a la célula (Fuller et al. 2004). membrana. Tercera, el CPA podría
la probabilidad de supervivencia. Sin embargo como el metabolismo interferir directamente con la función de
celular está muy ralentizado, la acción las proteínas transportadoras de
-Efecto coligativo: Al añadir un soluto tóxica de los crioprotectores se ve muy agua (principalmente a los canales
(CPA) a un disolvente (medio de disminuida, salvo que empleemos muy específicos para el transporte de agua,
congelación) el punto crioscópico de la altas concentraciones a temperaturas o secundariamente a canales que son
solución desciende, necesitándose una relativamente altas (en el entorno de los presumiblemente para transportar
temperatura más baja para el cambio de 0ºC). alguna otra molécula, como la glucosa,
fase. Por lo tanto, las células pero que además facilitan el trasporte de
experimentarían menos estrés salino -Ósmosis: La adición de CPA ejerce per se agua).
que si estuvieran bajo las mismas un estrés osmótico sobre las células

8. A R T Í C U L O I I I
Ana Fernández et al. Fundamentos de criobiología espermática para bancos de semen
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OTROS COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE resistencia a la congelación. Otras aquellas con alto contenido de azúcar,
CRIOCONSERVACIÓN sustancias con propiedades lipofílicas no contienen un buffer de pH por lo que
utilizadas para extraer colesterol de componentes como yema de huevo
AGENTES QUE INTERACTÚAN CON LA membranas, como el metil-beta- puede afectar el pH la solución. Muchos
MEMBRANA PLASMÁTICA ciclodextrina (un derivado de un medios incluyen citrato de sodio, TRIS
oligómero cíclico de la glucosa), (tr isfosfato-(hidroximetil)-
El shock por frío esta probablemente también han demostrado mejorar la aminometano) o buffers zwitterionicos
relacionado con la transición de fase de supervivencia espermática a la como TES (N-trisfosfato (hidroximetil)-
la membrana lípidica, cuyos resultados congelación. metil-2-aminoetanosulponico ácido).
son separación de las fases y la pérdida No se debe utilizar tampón fosfato salino
de permeabilidad selectiva. Diferentes QUELANTES (EDTA, CITRATO) (PBS) como buffer en la congelación
sustancias han demostrado que pueden espermática, pues sus elevadas
cambiar la composición lipídica de la Durante la criopreservación, existe un concentraciones de sodio, al alterarse
membrana celular mejorando su fluidez. descontrol de la concentración de las bombas Na-K durante el proceso de
La adicción de lecitina (de aceite de calcio intracelular. Este es congelación, pueden sen perjudiciales
soja) o yema de huevo (que contiene probablemente el motivo para la para el espermatozoide alcanzando
fosfolípidos y lecitina) protege a la inclusión del ácido etilendiaminotetra niveles tóxicos intracelulares.
membrana espermática del shock por acético (EDTA) y citrato en algunos
frío. diluyentes de semen; estos VITRIFICACIÓN
atraparían calcio y disminuirían
El mecanismo exacto por el cual estas el gradiente de concentración en La Vitrificación es la solidificación de una
sustancias protegen a la célula del shock toda la membrana plasmática del solución alcanzándose el estado vítreo
por frío es desconocido. Parece que el espermatozoide. Las concentraciones comentado anteriormente, sin formación
responsable del efecto de la yema de de calcio 0,1 mM. intracelulares son de cristales. En este estado el agua se
huevo es una lipoproteína de baja cuatro veces menores a las del solidifica pero no se expande, esto sucede
densidad (LDL). Esta LDL puede actuar ambiente exterior. El EDTA atrapa otros gracias a un rápido enfriamiento que
uniéndose directamente a la membrana iones metálicos y podría también actuar conduce a un aumento extremo de la
y modificando su permeabilidad o inhibiendo la peroxidación de lípidos. viscosidad sin formación de hielo
activando a enzimas de la membrana intracelular. Este proceso es alcanzado por
(adenilato ciclasa, bombas iónicas,..) AGENTES QUE EVITAN LA PEROXIDACIÓN aumento tanto de la tasa de enfriamiento
que mejorarían el comportamiento LIPÍDICA como de la concentración de la solución
osmótico de las célula y la respuesta a crioprotectora (Taylor et al., 2004).
crioprotectores permeables como el Una serie de estudios han implicado
glicerol. a la peroxidación de los lípidos de De hecho aunque introdujéramos
membrana como causa de la función directamente una pajuela de
Además, el posible efecto beneficioso defectuosa del espermatozoide después congelación en nitrógeno líquido y
de algún detergente durante la de la criopreservación del semen después lo sumergiéramos en agua para
congelación (SDS, etc.) se atribuye a (Salamon and Maxwell, 1995). Los calentarlo las tasas de enfriamiento y
que el detergente modifica las intentos de superar la peroxidación calentamiento serían del orden de
partículas de la yema de huevo (LDL) durante la criopreservación de semen >2500ºC/min., lo que podría formar
solubilizando lípidos, lo que facilita la han incluido la realización del proceso cristales de hielo intracelulares, y
interacción de éstos con la membrana bajo condiciones anaeróbicas, además provocar daños en el espermatozoide.
plasmática. de el uso antioxidantes y la inclusión de Para aumentar la velocidad de
agentes quelantes. Confirmar la eficacia congelación se han utilizado otros
Varios investigadores han proporcionado de estas estrategias ha sido algo dispositivos diferentes a la pajuela
evidencia directa de que la Albúmina, problemático. Butirato hidroxitolueno, clásica que permiten un mayor contacto
en el medio de congelación se adhiere Glutation y Ditiotreitol han entre la suspensión celular y el
rápidamente a la membrana sido descritos como agentes nitrógeno líquido como rejillas de
espermática en el momento de la protectores de la peroxidación durante microscopia electrónica, semipajuela,
dilución, modifica la composiciones criopreservación, con mejoras en la cryoloop, cryotop, cryotip y cryoleaf
lipídicas del espermatozoide mediante motilidad postdescongelación y la (Fuller et al., 2004). Las tasas de
intercambio lípidico o hidrólisis, integridad acrosomal. enfriamiento y calentamiento pueden
promueve la hidrólisis de las proteínas aumentar hasta 30000 ºC/min y
de membrana plasmática, causa la BUFFER 42000ºC/min respectivamente, y así
entrada de iones Ca2+ en el citoplasma, evitar con éxito la formación de hielo
y disminuye el colesterol y la cantidad Además de la elección del crioprotector intracelular. Para conseguir esta alta
de fosfolípidos en la membrana y varios posibles aditivos, los diluyentes tasa es necesario que el volumen donde
plasmática del espermatozoide. Esta de semen deben estar preparados en un están contenidos los espermatozoides
disminución del colesterol induce una medio acuoso. Algunas formulaciones sea muy pequeño (micras), lo que hace
mayor fluidez de membrana y por tanto comúnmente utilizadas, especialmente que el número de espermatozoides

9. A R T Í C U L O I I I
Junio 2009 Vol. 14 · Nº 1
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vitrificados sea muy escaso, no siendo suspension as a cause of freezing injury. In: G.E.W., O’Connor, M. Eds., The Frozen Cell,
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de deshidratar rápidamente el demonstration using sperm as a model. J theory for injury and survival. Cryobiology
espermatozoide y prevenir el hielo Exp Zool 1993; 265: 432–7. 1965; 2(3): 99-108.
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los crioprotectores debe ser considerada Relationships among in vivo fertility, Nijs M, Ombelet W. Cryopreservation of
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permeables son preferibles porque la Sci 1994; 74: 53–8. Gao D, Liu J, Liu C, et al. Prevention of
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están directamente expuestas a solución on line 2004; 9: 680-91. removal from human spermatozoa Hum
isotónica, existe un riesgo de hinchazón Reprod 1997; 12: 112–8.
osmótica, porque el agua difunde más Mazur P. Kinetics of water loss from cells at
rápido al interior de la célula que la subzero temperatures and the likelihood of Lovelock JE, Polge C. The immobilization of
difusión al exterior del crioprotector intracellular freezing. J Gen Physiol 1963; spermatozoa by freezing and thawing and
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más común para evitar este daño es Rall W, Reid D, Farrant J. Innocuous 1954; 58: 618–22.
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