Química. Electroforesis

1. Q U Í M I C A B I O L Ó G I C A .
D E P A R T A M E NT O D E B Q C A .
F C N Y C S .
U N P S J B
2 0 1 7
ELECTROFORESIS

2.  ¿ Que es la electroforesis?
 ¿Qué permite analizar?
 ¿ Que factores influyen ?

3. Separar y analizar moléculas: proteínas
ADN/ARN
... en función de su diferente movilidad al aplicar un campo eléctrico
(dependerá de su carga eléctrica)
* Moléc. (+)  polo (-) o cátodo
* Moléc. (-)  polo (+) o ánodo
ELECTROFORESIS LIBRE
 moléculas en disolución o suspensión:
poco resolutiva
ELECTROFORESIS DE ZONA
 SOPORTE que retiene las moléculas:
elevado poder de resolución
cátodo ánodo
ánodo
cátodo
SOPORTE

4. pH bajo:
carga neta positiva
pI: carga neta nula
pH alto: carga neta
negativa

5. EQUIPO ELECTROFORÉTICO
- +
muestra
muestra
+
-
fuente de
alimentación
fuente de
alimentación
cable
cable
cubeta
cubeta
tampón
tampón
gel
gel
electrodo
electrodo
cátodo ánodo
electrodo cátodo
ánodo
* Fuente de alimentación
* Cubeta
* Tampón de electroforesis
* Soporte electroforético
(gel)
* Dos electrodos
ánodo (+)
cátodo (-)
Componentes:
(E. horizontal)
(E. vertical)

6. FACTORES QUE AFECTAN A LA ELECTROFORESIS
1_ Campo eléctrico
*Diferencia de potencial (V-voltios): bajo voltaje (10-500 V)
alto voltaje (500-10000 V)
*Intensidad (A-amperios): flujo de carga eléctrica
depende de V y de R (Ley de Ohm V=RxI)
*Resistencia (R): determinada por el soporte y tampón electroforesis
*Temperatura: efecto Joule : El aumento de temperatura generado
puede dañar el soporte, el equipo electroforético y desnaturalización de las
proteinas refrigerantes
2_ Muestra
*Carga o densidad de carga: carga eléctrica/masa de la molécula
*Tamaño
*Forma: formas globulares avanzan más
3_ Tampón de electroforesis
*pH: determina el grado de solvatación y la carga de las moléculas
generalmente es ligeramente básico  moléculas (-)
*Fuerza iónica: generalmente 0.05 o 0.1 M para que no interfiera
4_ Soporte

7. SOPORTE ELECTROFORÉTICO
 No restrictivo (Tipo I): Tamaño poro >>> moléculas, no opone impedimento
a su paso  separación sólo por CARGA
* Electroforesis de proteínas: • Papel, almidón, agar, acetato de
celulosa
Gel poroso
Características
 Gel poroso (entramado tridimensional interno)
 Tiene que permitir el paso de moléculas
 Material inerte: NO puede estar cargado y no
debe adsorber las moléculas de la muestra
Tipos de Soporte
 Restrictivo (Tipo II): Tamaño poro ≈ moléculas, opone resistencia a su
paso  separación por tamaño (tamizado molecular)
* Electroforesis de proteínas: • Separación por CARGA y TAMAÑO
• Acrilamida
* Electroforesis de DNA/RNA: • Separación sólo por TAMAÑO
• Agarosa, acrilamida

8. EN ACETATO DE CELULOSA: PROTEINOGRAMA
+ -
Campo eléctrico (DV)
Soporte: (no restrictivo) Tiras de acetato de celulosa
Electroforesis horizontal
1. Aplicación de la muestra
2. Electroforesis
3. Detección por tinción:
Azul de Coomassie
Negro amido
4. Densitometría / Espectrofotometría
Aplicaciones diagnósticas en serología
(separación proteínas séricas).
muestra
Avance de las proteínas

9. EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE)
Electroforesis vertical
Soporte: (restrictivo) Gel de Poliacrilamida
* Polimerización de dos componentes: Acrilamida + Bisacrilamida
* Variación de la concentración  variación del tamaño de poro
[poliacrilamida] tamaño poro
1. Preparación del gel
2. Montaje de la cubeta
3. Aplicación de la muestra
4. Electroforesis
5. Detección por tinción:
Azul de Coomassie
Sales de plata

10. Aplicaciones:
* Separar proteínas
* Determinar peso molecular de una proteína
* Separar proteínas oligoméricas
* Separar proteínas en función de su pI
* Separar proteínas de mezclas muy complejas
* Ver si hay una proteína en concreto
EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE)
SDS-PAGE
Electroforesis 2D
Western Blot
Electroenfoque
Ventajas:
* Gran poder de separación por CARGA y por TAMAÑO
* Químicamente inertes
* Transparentes (permite densitometría)
* Estables (pH, fuerza iónica, temperatura)
* Versatilidad en cuanto al tamaño de poro y entramado uniforme

11. SDS-PAGE
Condiciones de la PAGE:
* No desnaturalizantes: separamos por CARGA y TAMAÑO  PAGE
S-S
S-S
-
-
-
-
-
-
- -
-
-
-
-
-
- -
+ SDS
+ DTT
25 kDa
S-S
+ SDS - -
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
- - -
-
-
-
-
-
-
-
-
- -
-
-
-
- - 44 kDa
S-S
S-S
50 kDa
* Desnaturalizantes: separamos sólo por TAMAÑO  SDS-PAGE
Agentes desnaturalizantes: SDS (dodecilsulfato sódico), urea,
reductores (DTT, b-mercaptoetanol)...
• SDS: detergente aniónico (-), dota a todas las proteínas de carga (-)
 todas migrarán hacia el ánodo (+), separándose sólo por tamaño

12. SDS-PAGE: determinación del peso molecular
Marcadores de peso molecular:
* Mezcla de diferentes proteínas
pre-teñidas de las que conocemos el
peso molecular.
* Por comparación podemos averiguar
el PM de nuestra proteína.

13. A trabajar se ha dicho……………… ajo Práctico
Electroforesis en tiras de acetato de celulosa
 Separar mediante electroforesis las proteínas
contenidas en el suero.
Electroforesis en gel de poliacrilamida
 Calcular gráficamente la masa molecular aparente de
proteínas por comparación con proteínas patrones
en un grafico de distancia vs Log PM aparente.

15. Electroforesis en tiras de acetato de
celulosa
 Tipo de electroforesis …………..
 Soporte: acetato de celulosa ( conservadas en metanol).
 Muestra: suero humano.
 pH de trabajo: 8, 5
 Buffer: Veronal Sódico.
 Siembra: con aplicador , en ¿ cátodo o ánodo?
 Voltaje: 2mA por tira.
 Tiempo de corrida: 45 minutos.
 Revelado: Amidoschwart o Ponceau.
 Solución decolorante: metanol, agua y acido acético ( 47,5:47,5: 5).
 Disolución de cada banda: Acido Acético al 80 %.
 Cuantificación espectrofotométrica a 495 nm.

17. Electroforesis en gel de
poliacrilamida