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1. Electroforesis

2. INTRODUCCIÓN
Separar y analizar moléculas: proteínas
ADN/ARN
ELECTROFORESIS
... en función de su diferente movilidad al aplicar un campo eléctrico
(dependerá de su carga eléctrica)
cátodo ánodo * Moléc. (+)  polo (-) o cátodo
* Moléc. (-)  polo (+) o ánodo
ELECTROFORESIS LIBRE
 moléculas en disolución o suspensión:
poco resolutiva
Arne Tiselius
1937
(Nobel 1948)
ELECTROFORESIS DE ZONA
 SOPORTE que retiene las moléculas:
elevado poder de resolución
ánodo
cátodo
SOPORTE

3. EQUIPO ELECTROFORÉTICO
- +
muestra
muestra
+
fuente de
alimentación
fuente de
alimentación
cable
cable
-
tampón
tampón
cubeta
cubeta
gel
gel
electrodo
electrodo
cátodo ánodo
electrodo cátodo
ánodo
* Fuente de alimentación
* Cubeta
* Tampón de electroforesis
* Soporte electroforético
(gel)
* Dos electrodos
ánodo (+)
cátodo (-)
Componentes:
(E. horizontal)
(E. vertical)

4. FACTORES QUE AFECTAN A LA ELECTROFORESIS
1_ Campo eléctrico
*Diferencia de potencial: voltaje (V-voltios)
*Intensidad (A-amperios): flujo de carga eléctrica
depende de V y de R (Ley de Ohm V=RxI)
*Resistencia (R-ohmios): determinada por el soporte y tampón
electroforesis
*Temperatura: efecto Joule  refrigerantes
2_ Muestra
*Carga o densidad de carga: carga eléctrica/masa de la molécula
*Tamaño
*Forma: formas globulares avanzan más
3_ Tampón de electroforesis
*pH: determina la carga de las moléculas
generalmente es ligeramente básico  moléculas (-)
*Fuerza iónica: moderada (0.05 o 0.1 M) para que no interfiera
4_ Soporte

5.  No restrictivo (Tipo I): Tamaño poro >>> moléculas, no opone impedimento
a su paso  separación sólo por CARGA
* Electroforesis de proteínas: • Acetato de celulosa, papel, almidón,
agar
Tipos de Soporte
 Restrictivo (Tipo II): Tamaño poro ≈ moléculas, opone resistencia a su
paso  separación por tamaño (tamizado molecular)
* Electroforesis de proteínas: • Separación por CARGA y TAMAÑO
• Acrilamida
* Electroforesis de DNA/RNA: • Separación sólo por TAMAÑO
• Agarosa, acrilamida
SOPORTE ELECTROFORÉTICO
Gel poroso
Características
 Gel poroso (entramado tridimensional interno)
 Tiene que permitir el paso de moléculas
 Material inerte: NO puede estar cargado y no
debe adsorber las moléculas de la muestra

6. EN ACETATO DE CELULOSA: PROTEINOGRAMA
+ -
Campo eléctrico (DV)
Soporte: (no restrictivo) Tiras de acetato de celulosa
Electroforesis horizontal
1. Aplicación de la muestra
2. Electroforesis
3. Detección por tinción:
Azul de Coomassie
Negro amido
4. Densitometría
Aplicaciones diagnósticas en serología
(separación proteínas séricas)
muestra
Avance de las proteínas
Strip

7. EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE)
Electroforesis vertical
Soporte: (restrictivo) Gel de Poliacrilamida
* Polimerización de dos componentes: Acrilamida + Bisacrilamida
* Variación de la concentración  variación del tamaño de poro
[poliacrilamida] tamaño poro
1. Preparación del gel
2. Montaje de la cubeta
3. Aplicación de la muestra
4. Electroforesis
5. Detección por tinción:
Azul de Coomassie
Sales de plata

8. Aplicaciones:
* Separar proteínas
* Determinar peso molecular de una proteína
* Separar proteínas oligoméricas
* Separar proteínas en función de su pI
* Separar proteínas de mezclas muy complejas
* Ver si hay una proteína en concreto
EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE)
SDS-PAGE
Electroforesis 2D
Western Blot
Isoelectroenfoque
Ventajas:
* Gran poder de separación por CARGA y por TAMAÑO
* Químicamente inertes
* Transparentes (permite densitometría)
* Estables (pH, fuerza iónica, temperatura)
* Versatilidad en cuanto al tamaño de poro y entramado uniforme

9. SDS-PAGE
Condiciones de la PAGE:
* No desnaturalizantes: separamos por CARGA y TAMAÑO  PAGE
S-S
S-S
-
-
-
--
-
- -
-
-
--
-
- -
+ SDS
+ DTT
25 kDa
+ SDS
S-S
- -
-
-
-
-
-
-
-
-
-
--
-
- - -
-
-
-
-
-
-
-
-
- -
-
-
-
- - 44 kDa
* Desnaturalizantes: separamos sólo por TAMAÑO  SDS-PAGE
Agentes desnaturalizantes: SDS (dodecilsulfato sódico), urea,
reductores (DTT, b-mercaptoetanol)...
• SDS: detergente aniónico (-), dota a todas las proteínas de carga (-)
 todas migrarán hacia el ánodo (+), separándose sólo por tamaño
PM = 50 kDa

10. SDS-PAGE: determinación del peso molecular
Marcadores de peso molecular:
* Mezcla de diferentes proteínas
pre-teñidas de las que conocemos el
peso molecular.
* Por comparación podemos averiguar
el PM de nuestra proteína.

11. ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Soporte: (restrictivo)
* Gel de Agarosa  moléculas grandes (0.1-60 kpb)
* Gel de Poliacrilamida  moléculas pequeñas (6-2000 pb)
Electroforesis horizontal (agarosa) o vertical (poliacrilamida)
Separación sólo por TAMAÑO
Densidad de carga igual para todas las
moléculas por los grupos fosfato
Ácidos nucleicos = carga (-)

12. Aplicaciones:
* Separar, identificar y purificar fragmentos
de DNA o RNA
* Determinar tamaño de un fragmento de DNA
* Separación de cromosomas enteros
* Secuenciación de DNA
* Identificación de regiones de unión a
proteínas
* Detectar la presencia de un gen (o secuencia
específica de DNA) en una muestra
* Determinar si se expresa un gen específico
ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Gel de poliacrilamida
Gel de agarosa
Southern Blot
Northern Blot

13. EN GEL DE AGAROSA
muestra (-)
+ -
Campo eléctrico (DV)
1. Preparación del gel
2. Aplicación de la muestra
3. Electroforesis
4. Detección por tinción con Bromuro
de Etidio (BrEt): se intercala en el
DNA y al irradiarlo con luz UV
emite fluorescencia
Electroforesis horizontal
Soporte: (restrictivo) Gel de agarosa

14. EN GEL DE AGAROSA
muestra (-)
+ -
Campo eléctrico (DV)
1. Preparación del gel
2. Aplicación de la muestra
3. Electroforesis
4. Detección por tinción con Bromuro
de Etidio (BrEt): se intercala en el
DNA y al irradiarlo con luz UV
emite fluorescencia
Electroforesis horizontal
Soporte: (restrictivo) Gel de agarosa