Universidad de Carabobo - Facultad de Ciencias de la Salud sede Carabobo - Bioanálisis. Técnicas en Biología Molecular. Unidad 2: Electroforesis.

1. Universidad de Carabobo
Facultad de Ciencias de la Salud
Escuela de Bioanálisis
Asignatura Técnicas en Biología Molecular
FACULTAD DE CIENCIAS
DE LA SALUD
ESCUELA DE
BIOANÁLISIS

2. • Electroforesis
• Electroforesis de Proteínas:
en geles de poliacrilamida,
bidimensional
• Electroforesis de Ácidos
Nucleicos: en geles de agarosa
• Aplicaciones
MSc. Diana Graterol
Electroforesis de proteínas
y Ácidos Nucleicos

3. Electroforesis
Migración de
partículas
cargadas
bajo la acción
de un
campo eléctrico
“Electro” se refiere a la electricidad y “foresis” (del griego
phoros) significa “trasladar”
La electroforesis es un método analítico semipreparativo, en el que
se separan biomoléculas, en dependencia entre otros factores de su
carga y bajo la acción de un campo eléctrico.
Polo Positivo
Ánodo (+)
Polo Negativo
Cátodo (-)
Estas partículas migran
hacia el cátodo o ánodo
(electrodos - y +)
En dependencia de una: (1) Combinación de su carga
(2) Tamaño molecular
(3) Estructura tridimensional
3

4. Movilidad Electroforética
Me = V x q
f
Me = movilidad electroforética de la molécula
V = voltaje aplicado
q = carga neta de la molécula
f = coeficiente de fricción de la molécula
La movilidad electroforética de una macromolécula dada depende del tamaño
molecular y la forma molecular (dependiendo del coeficiente de fricción f) y a la vez
de su carga neta (q).
4

5. Historia de la Electroforesis
•Empleada por
primera vez por
Tiselius en el año
1937.
•Raymond y
Weintraub en 1959
emplearon como
soporte para la
electroforesis un
gel de PAGE.
• Posteriormente el
método fue
perfeccionado por
varios investigadores
como Davis y
Ornstein, y se logró
un aumento en la
resolución
El dodecil sulfato de sodio (SDS) se introduce en esta técnica en 1970, y ya en 1972 se emplean
agentes reductores y SDS en la determinación del peso molecular de proteínas en lo que se
denominó electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE).
5

6. Electroforesis de Zona
La muestra esta
obligada a
desplazarse sobre
un soporte sólido
tal como el papel
o ciertos geles
Tipos de Soporte Sólido:
Grupo A: sílica gel, alúmina o celulosa
sobre placas de vidrio o de plástico.
Papel filtro. Acetato de celulosa.
Grupo B (Geles): agarosa, almidón y
poliacrilamida
Son útiles para lograr la separación de componentes de mezclas
complejas
6

7. Fundamentos de Electroforesis
La mayoría de las biomacromoléculas (proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos)
poseen determinada carga eléctrica con grupos aniónicos y catiónicos capaces de
disociarse
¿Por qué podemos separar biomoléculas por esta técnica?
Carga Neta de la
partícula
(1) pH del medio
(2) Interacción con pequeñas
moléculas, iones o
macromoléculas
En el punto
isoeléctrico
(pH al cual la
carga neta es
cero), esta no
migra.
Por debajo del
punto
isoeléctrico
tiene carga
neta positiva y
migra hacia el
cátodo
Por encima del
punto
isoeléctrico
tienen carga
negativa y
migra hacia el
ánodo
pH
Influye
sobre
Velocidad de
migración de las
moléculas
7

8. Fundamentos de Electroforesis
¿Por qué
podemos separar
biomoléculas por
esta técnica?
Estructura proteínas:
Estruct. cuaternaria
8

9. Fundamentos de Electroforesis
Grupos “R” no polares (alifáticos)
Glicina Alanina Valina
Leucina Metionina Isoleucina
Grupos “R” aromáticos
Fenilalanina Tirosina Triptófano
Grupos “R” polares (no cargados)
Serina Treonina Cisteína
Prolina Asparagina Glutamina
Lisina Arginina Histidina
Grupos “R” cargados positivamente
Grupos “R” cargados negativamente
Aspartato Glutamato
Clasificación Aminoácidos:
9

10. Fundamentos de Electroforesis
¿Por qué
podemos separar
biomoléculas por
esta técnica?
Estructura ácidos nucleicos:
10

11. Ventajas y Desventajas
Ventajas:
Desventajas:
Separación, visualización y cuantificación del
número de proteínas de una solución.
Aportan un potente criterio de pureza.
Se puede conocer las características ácido-básicas de
las proteínas presentes en un extracto crudo.
Afecta la estructura de las proteínas por lo tanto,
también afecta a la función de la misma.
11

12. Modos de disposición del Soporte
Horizontal:
En gel de almidón o de agarosa, para
proteínas y ácidos nucleicos. Casi siempre
el tampón cubre el gel (para evitar que se
seque debido al calentamiento sufrido al
pasar la corriente), denominándose por ello
“electroforesis submarina” .
Vertical:
Se usa casi exclusivamente con gel de
poliacrilamida (más resistente físicamente,
no se desliza), para proteínas o para ácidos
nucleicos de pequeño tamaño.
12

13. Electroforesis en geles de poliacrilamida
➢ Polímero sintético químicamente inerte.
➢ Propiedades uniformes.
➢ Gel transparente con estabilidad mecánica.
➢ Insoluble en agua.
➢ Permite buena visualización de bandas.
➢ Manipulando su síntesis se puede controlar el
tamaño del poro obtenido.
Poliacrilamida
(PAGE)
Acrilamida Bisacrilamida
Bisacrilamida
Catalizador: N,N,N,N´-tetrametiléndiamina
(TEMED) (agente reductor)
Iniciador: Persulfato de amonio (agente oxidante)
Reacción de polimerización por adición vía radical libre a pH básico 13

14. Electroforesis en geles de poliacrilamida
Efecto tamiz molecular Gel en gradiente
7%
15%
Tamaño de los poros del gel
14

15. Electroforesis en geles de poliacrilamida
Selección del tamaño de los poros
KR
% T
% T = porcentaje acrilamida
KR = coeficiente retención (dificultad
de esa proteína para atravesar los poros)
Rf = 4 cms
10 cms
Rf = 0.4
10 cms
4 cms
Movilidad
Relativa
(Rf)
Rf = distancia recorrida proteína
tamaño del gel
15

16. Cálculo del porcentaje de acrilamida
log
10
Rf
KR
% T
log
10
Rf
% T
log
10
Rf
% T
log
10
Rf
% T
A
C
B
D
Electroforesis en geles de poliacrilamida
16

17. Preparación muestra: electroforesis nativa y desnaturante
Somete a las proteínas a migración
asegurando su desnaturalización completa
(pérdida de la estructura tridimensional). La
migración es proporcional a la carga y al
tamaño de la molécula pero no a su forma.
Nativa (No disociante) Disociante o desnaturante
Permite separar complejos proteicos como
una unidad. Las proteínas siguen siendo
funcionales y mantienen las interacciones
entre subunidades. Migran en función de su
carga, de su tamaño y de su forma.
Electroforesis en geles de poliacrilamida
17

18. Electroforesis desnaturante
Agentes disociantes
Urea 8 M
Dodecil sulfato sodio (SDS)
β-mercaptoetanol
Tampón muestra
Tris-HCl 0.5 M pH 6.8
SDS
β-mercaptoetanol
Glicerol
Azul bromofenol
El dodecil sulfato de sodio (SDS) es el agente desnaturalizante
más empleado. Desnaturaliza y recubre a la proteína y se
separan como cadenas polipeptídicas aisladas.
Electroforesis en geles
de poliacrilamida con
SDS (SDS-PAGE)
18

19. Tipos de tampón de corrida: continua o discontinua
Tienen diferencias no solo en la composición
de los tampones sino también en sus pH. Los
geles suelen estar divididos en dos regiones:
un gel concentrador y uno separador.
Tampón continuo Tampón discontinuo
Son aquellos en los cuales los iones presentes
en los tampones son los mismos a un mismo
pH, tanto en la muestra como en el gel y los
reservorios que contienen los electrodos.
-
+
Gel
resolución
(pH 8.8)
Tris-
glicina
pH 8.3
Tris-
glicina
pH 8.3
-
+
Gel
resolución
(pH 8.8)
Gel
apilamiento
pH 6.8
Tris-
glicina
pH 8.3
Electroforesis en geles de poliacrilamida
19

20. Partes del Gel discontinuo
Tampón de corrida
Tris-glicina, pH 8.3
Muestra
Tris-HCl, pH 6.8
Zona apilamiento
Tris-HCl 0.5 M,
pH 6.8
Zona separación
Tris-HCl 1.5 M,
pH 8.8
Tampón de corrida
Tris-glicina, pH 8.3
stacking gel
resolving gel
3 - 4,5%
7,5-20%
+
Al inicio de la
electroforesis, las
muestras se
colocan en un
pozo. El volumen
puede ser variable
en cada muestra
aunque la cantidad
de proteína debe
ser constante.
-
20

21. Zona de apilamiento
Las proteínas
se focalizan
(compactan)
formando una
banda delgada
A pH 6.7-6.8:
La glicina está parcialmente
disociada. Se crea una zona
de baja conductividad y, por
tanto de elevado voltaje
Gly
Cl-
Proteínas
Los iones cloruro se
desplazan a mayor velocidad
y crean una zona de alta
conductividad y, por tanto, de
bajo voltaje
Se origina una gran
diferencia de potencial en
un espacio muy reducido
21

22. Zona de separación
A pH 8.8:
La glicina está altamente
disociada. Se crea una zona
de alta conductividad y, por
tanto de bajo voltaje
El efecto del ion cloro y el
ion glicina: permiten que las
proteínas se amontonen en la
parte inferior del gel de
apilamiento y todas empiecen
a entrar en el gel separador
prácticamente al mismo
tiempo
Frontera
Glicina/cloruro
Proteínas
fraccionadas en el
gel de separación
Proteínas
Gly
Cl-
22

23. Fijación y Tinción de las Proteínas
Tinción:
Amidoblack
Azul de Coomassie
Plata metálica
Secado
Fijación:
Alcohol
Metanol 50%
Ácidos
Ácido tricloroacético 10%
Alcohol-ácido
Metanol 50%-Ácido acético 10%
23

24. Determinación del Peso Molecular
24
Mezcla de
diferentes proteínas
preteñidas de las
que conocemos el
peso molecular.
Por comparación
podemos averiguar
el PM aparente de
nuestra proteína.
Marcadores de Peso Molecular:
Tamaño de una proteína
se expresa en Daltons
(Da)
Migración relativa
Proteína
desconocida

25. Software Molecular Analyst
25

26. Aplicaciones Electroforesis
Por medio de la
electroforesis
podemos detectar
diferentes tipos de
agentes patógenos
y enfermedades
➢ Caracterización cualitativa de una
sustancia o mezcla de sustancias.
➢ Control de pureza.
➢ Estimar la masa relativa de una
proteína.
➢ Detección de modificaciones en las proteínas.
➢ Determinación cuantitativa (Inmunotransferencia).
➢ Propósitos preparativos (síntesis de proteínas, fosforilación,
acción de enzimas proteolíticas)
26

27. Montaje de la Electroforesis
Desarrollo de la práctica. Material de electroforesis vertical (a); montaje del sistema
(b); Preparación del gel separador (c,d) y concentrador (e-g); electroforesis (h-ñ);
tinción del gel (o-t) 27

28. Montaje de la Electroforesis
Desarrollo de la práctica. Material de electroforesis vertical (a); montaje del sistema
(b); Preparación del gel separador (c,d) y concentrador (e-g); electroforesis (h-ñ);
tinción del gel (o-t) 28

29. Montaje de la Electroforesis
Desarrollo de la práctica. Material de electroforesis vertical (a); montaje del sistema
(b); Preparación del gel separador (c,d) y concentrador (e-g); electroforesis (h-ñ);
tinción del gel (o-t) 29

30. Electroforesis Bidimensional
Separación de
proteínas por pI y
masa molecular
mediante la
aplicación de
corriente eléctrica
Las moléculas son separadas por su carga o punto isoeléctrico
(pI) por la técnica de enfoque isoeléctrico o IEF (Isoelectric
Focusing).
Luego, las proteínas son separadas de acuerdo a su tamaño o
peso molecular por electroforesis en SDS PAGE.
A diferencia de la electroforesis en una dimensión en el que se
puede resolver cerca de 50 bandas, la electroferesis de dos
dimensiones permite resolver 2500 manchas de polipéptidos 30

31. Electroforesis Bidimensional
Es un proceso de
separación e
identificación de
proteínas en dos
dimensiones,
orientando los
frentes de corrida
en ángulo recto
uno de otro
La primera dimensión es la Isoelectrofocalización (IEF)
El punto isoeléctrico es el pH al cual una proteína tiene carga neta cero. A
este pH la proteína tiene una solubilidad mínima y su movilidad en un
sistema de isoelectroenfoque es cero.
Anfolitos
Inmobilinas
Ácidos oligoamino-oligocarboxílicos
31

32. Aplicaciones Electroforesis Bidimensional
La 2-D permite la
separación,
detección y
purificación de
proteínas
expresadas bajo
diferentes
condiciones de
estudio
Obtención de un mapa génico con fines
comparativos:
➢ Cambios en la expresión proteica ante
un determinado estímulo.
➢ Comparación de diversos aislados de
un mismo organismo o célula.
➢ Análisis del proteoma completo de alguna célula u
organelo.
➢ Análisis de diferencias en el proteoma en diferentes
condiciones.
➢ Análisis de diferencias de proteínas específicas tales como
glicoproteínas y/o fosfoproteínas en el proteoma.
32

33. Electroforesis de Ácidos Nucleicos
La electroforesis
de ácidos
nucleicos es el
método habitual
para separar,
identificar y
purificar
moléculas o
fragmentos de
DNA y RNA
La agarosa, fracción gelificante, es una molécula lineal neutra,
esencialmente libre de sulfatos, que consiste en cadenas repetidas de
unidades alternadas β-1,3 D-galactosa y α-1,4 3,6-anhidro-L-galactosa
33

34. Electroforesis de Ácidos Nucleicos
Tipos de Soporte:
Geles de poliacrilamida (en cubetas verticales) se emplean para
fragmentos pequeños de DNA (5-500pb), así como para la mayoría
de los RNA.
Geles de agarosa (en cubetas horizontales) se utilizan para
fragmentos grandes de DNA (500pb-10Mb); utilizando agarosas de
distintas concentraciones (distinto grado de reticulación) pueden
separarse fragmentos de hasta 50kb aplicando un campo eléctrico
constante.
34

35. Electroforesis DNA geles agarosa
35

36. Diagnóstico de patologías mediante
Electroforesis de proteínas
Equipos automatizados electroforesis de proteínas:
Empleo electroforesis diagnóstico patologías:
Suero (proteínas séricas, lipoproteínas, isoenzimas)
Orina
Líquido cefalorraquídeo
Hemoglobina
36

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Bibliografía
37