Cesar david puentes florez union de peptidos al complejo mayor de histocompatibilidad

Simulación del proceso de unión de péptidos al complejo mayor de histocompatibilidad
clase II -DR (CMH-DR) usando métodos computacionales estructurales
Trabajo de grado para optar por el título de Biólogo
César David Puentes Flórez
Director
Carlos Fernando Suárez Martínez
Dr. Sc. en Ciencias Biomédicas y Biológicas.
Fundación instituto de inmunología de Colombia
Universidad INCCA de Colombia
Facultad de Ingeniería, Administración y Ciencias Básicas
Programa de Biología
Bogotá, D.C.
2018

2
Simulación del proceso de unión pCMH-DR
La totalidad de los contenidos e ideas expuestas en el presente trabajo de grado son de mí (nuestra)
completa autoría y no corresponden a conceptos emitidos por la Universidad INCCA de Colombia.

3
Dedicatoria
A mi padre, quien me dio su apoyo incondicional durante este largo proceso.
A mis hermanos Edwin, Mayra, Juan y María por su invaluable compañía y afecto.
A ellos quiero ofrecer este humilde logro.

4
Agradecimientos
Le agradezco a mi señor padre Sigifredo Puentes como también a mis hermanos Edwin, Mayra,
Juan y María por su apoyo incondicional durante todos estos años y por darme un propósito de
vida.
También le doy un gran agradecimiento a mí director, Carlos Fernando Suárez Martínez, por su
instrucción, paciencia, diligencia y amabilidad durante todo el tiempo que estuvimos desarrollando
este trabajo. Estos meses han sido todo un viaje en el que he aprendido mucho, permitiéndome
comprender la importancia de la disciplina, del mejoramiento constante y del trabajo en equipo.
En verdad le agradezco mucho.
También quiero aprovechar este espacio para agradecerle a mis compañeros Ricardo de León
Montero, Mauricio Molina, Carlos Pérez, Jonathan Correa y Jorge Perilla como también a mis
compañeras Elizabeth Gutiérrez y Raksha Villamil, quienes me acompañaron y ofrecieron su
amistad, compartiendo juntos una gran cantidad de buenos momentos.
Por último, agradezco a los profesores Edisson Chavarro, Julián Martínez, Saul Serna, Helver
Lesmes, Cecilia Gonzales y Julio Giraldo por todas las enseñanzas que me dieron durante estos
años formativos.

5
Resumen
La unión de péptidos antigénicos (o epítopos) a las moléculas CMH y el reconocimiento
de estos antígenos por parte de las células T es un paso esencial para la respuesta inmune. Si este
proceso falla, no puede haber respuesta inmune viable. Por esta razón, la predicción de afinidades
de unión en pCMH es central en el diseño de péptidos candidatos a vacuna, así como en el
entendimiento del proceso de inmune de reconocimiento patógeno-hospedero.
Los métodos basados en secuencias usan algoritmos de inteligencia artificial, siendo
eficientes para realizar predicciones de afinidad en pCMH, sin embargo, son muy dependientes en
la disponibilidad y calidad de datos experimentales, los cuales pueden escasear debido a la
dificultad para realizar los ensayos de unión pCMH experimentales. En cambio, los métodos
estructurales no dependen directamente de datos experimentales para simular el proceso de unión,
siendo ideales para estudiar la unión en alelos de pALH-DR que no tienen datos de unión
experimentales (siendo este el caso de la mayoría de moléculas conocidas). En este trabajo se
aplicaron métodos clásicos de química computacional para generar por homología estructuras de
varios alelos ALH-DR con los programas UCSF Chimera y SCWRL 4.0, comparando la precisión
de cada programa en la generación de estructuras con alta similitud geométrica a sus plantillas
cristalográficas de proteínas homologas. Estas estructuras fueron refinadas con NAMD para
corregir los defectos estructurales que son resultado del proceso de modelamiento homologo. La
calidad de las estructuras resultantes fue evaluada con MolProbity, Qmean y Prosa-Web.
Luego se evaluó como el refinamiento con NAMD de una estructura ALH-DR2 (1BX2)
podía afectar los cálculos de acoplamiento molecular comparando los resultados de acoplamiento
molecular obtenidos con los programas Autodock Vina y Quick Vina 2, encontrando que refinar
la estructura puede en efecto incrementar la precisión del acoplamiento molecular.

6
Seguido, se evaluó como el refinamiento del ligando junto a su estructura afectaba el
acoplamiento molecular, encontrando que esto disminuye su precisión, pero aumenta la afinidad
de las uniones calculadas. Todos ensayos fueron validados con datos CI50 de 1BX2 utilizando los
estadísticos del coeficiente de determinación (R2
) y el área bajo la curva (COR-ABC), obteniendo
una correlación moderada. Para finalizar se ilustraron las interacciones moleculares pALH-DR en
modelos “all-atom” analizados por el servidor Arpeggio, logrando una representación gráfica de
como son las uniones de alta y baja afinidad y sus diferencias en las interacciones ligando-receptor.
En este trabajo se demostró que es posible generar un estudio computacional completo de
moléculas pALH-DR, utilizando técnicas de modelamiento por homología y acoplamiento
molecular.
Palabras clave: 1BX2, acoplamiento molecular, ALH-DR2, AMBER, área bajo la curva,
Arpeggio, ABC, Autodock, Vina, Autodock, CI50, coeficiente de determinación, docking,
modelamiento por homología, Molprobity, NAMD, pALH-DR, Prosa-Web, Qmean, Quick Vina 2,
R2
, refinamiento.

7
Abstract
Antigenic peptide binding (or epitope binding) to MHC molecules and their recognition by T-cells
is a key step in the immune response. Should this process fail, there can be no viable immune
response. For this reason, binding affinity prediction for pMHC complexes is very important in
designing candidate peptides for vaccine development so as in understanding the process of host-
pathogen immune recognition.
Sequence-based methods use artificial intelligence algorithms with high efficiency in the binding
affinity prediction of pMHC complexes, however, they rely too much on experimental data which
can be scarce due the difficulties presented by pMHC binding assays. Instead, structure-based
methods don’t have to rely on experimental data to simulate the binding process, being therefore
ideal to study the binding process in pHLA-DR alleles with little to no experimental data. In this
work we applied classic computational chemistry methods for the homology modelling of various
HLA-DR alleles using the programs UCSF Chimera and SCWRL 4.0, comparing the performance
of both programs in the modeling of structures with high geometrical similitude to the template
structures. Then, these structures were refined with NAMD to correct structural errors resulting of
the homology modelling process. The structural quality of the resulting structures was evaluated
with MolProbity, Qmean and Prosa-Web.
Next, the structural refinement of an HLA-DR2 (1BX2) structure was evaluated to determine how
this could affect docking performance, comparing the results obtained with Autodock Vina and
Quick Vina 2, finding that refining the structure can indeed increase docking precision. Then,
ligand refinement along the receptor structure as evaluated to determine its effects on the docking
process, finding that it greatly reduces docking performance, but at the same time, increases the
calculated binding affinities. All they assay were validated with 1BX2-IC50 experimental data,
using the determination coefficient (R2
) and the area under the curve (ROC-AUC) obtaining

8
moderate to high correlations with experimental assays. Lastly, the molecular interactions in
pHLA-DR were illustrated with “all-atom” models analyzed in the Arpeggio’s server, achieving a
graphic representation of complexes with high and low binding affinities, showing their
differences in the ligand-receptor interaction. In this work demonstrated that is possible to generate
a complete computational study of pALH-DR molecules, using homology modeling and docking.
Keywords: 1BX2, ALH-DR2, AMBER, Area under the curve, Arpeggio, AUC, Autodock
Vina, Autodock, Determination coefficient, Docking, Homology modeling, IC50, MolProbity,
NAMD, pALH-DR, Prosa-Web, Qmean, Quick Vina 2, R2
, structure refinement.

9
Índice
Glosario......................................................................................................................................22
Introducción ..............................................................................................................................25
Planteamiento del problema ....................................................................................................35
Justificación...............................................................................................................................36
Objetivos....................................................................................................................................39
Objetivo general ........................................................................................................................ 39
Objetivos específicos ................................................................................................................. 39
Marco Teórico...........................................................................................................................40
Polimorfismo en el CMH, mecanismos e importancia........................................................... 40
Selección natural y polimorfismo trans-especies........................................................... 41
Organización genómica del CMH............................................................................................ 41
Las moléculas de clase I................................................................................................. 42
Las moléculas de clase II. .............................................................................................. 43
Las moléculas de clase III. ............................................................................................. 45
La Región de unión a péptidos (RUP)..................................................................................... 47
Presentación y reconocimiento de antígeno............................................................................ 48
La importancia de ALH-DR en la inmunidad adaptativa..................................................... 49
Vacunología tradicional y vacunología reversa...................................................................... 50
Identificación de epítopos potenciales ..................................................................................... 52
Métodos in-vitro para medir la afinidad de unión en CMH.................................................. 53
Métodos in-silico para predecir la afinidad de unión en CMH............................................. 55
Métodos basados en secuencias. .................................................................................... 55
Métodos basados en estructuras .............................................................................................. 58

10
Estudio de la unión en pCMH-I. .................................................................................... 58
Estudio de la unión en pCMH-II.................................................................................... 58
Disponibilidad de modelos cristalográficos para ALH-DR................................................... 59
Modelamiento proteico computacional................................................................................... 60
Modelamiento ab-initio.................................................................................................. 61
Modelamiento por enhebrado......................................................................................... 62
Modelamiento por homología. ....................................................................................... 62
Refinamiento estructural.......................................................................................................... 63
Solvatación y simulación de ambiente acuoso............................................................... 63
Minimización energética................................................................................................ 64
Dinámica molecular. ...................................................................................................... 65
Validación estructural de los modelos proteicos .................................................................... 66
Alineamientos RMSD. ................................................................................................... 66
Evaluación de parámetros de calidad estructural con MolProbity. ................................ 67
Evaluación de parámetros de calidad estructural con QMEAN4................................... 68
Evaluación de parámetros de calidad estructural con ProSA......................................... 69
Anclaje molecular...................................................................................................................... 69
Ensayos de unión con anclaje molecular para ALH-DR................................................ 70
Metodología ...............................................................................................................................74
Determinación de la información experimental disponible para ALH-DR......................... 74
Búsqueda de secuencias y BLAST contra la base de estructura de proteínas (PDB) ......... 75
Alineamientos de secuencias objetivos y estructurales .......................................................... 75
Visualización y estandarización de las estructuras del ALH-DR ......................................... 76
Incorporación de aguas estructurales ..................................................................................... 76

11
Evaluación de parámetros relacionados con la calidad estructural..................................... 81
Configuración para anclaje molecular.................................................................................... 81
Estimación de la afinidad de unión pALH-DR usando anclaje molecular .......................... 83
Primera simulación......................................................................................................... 83
Segunda simulación........................................................................................................ 85
Tercera simulación......................................................................................................... 85
Cuarta simulación........................................................................................................... 86
Visualización de interacciones pCMH..................................................................................... 86
Resultados..................................................................................................................................89
Refinamiento estructural de las estructuras generadas por homología............................... 92
Evaluación de calidad estructural ........................................................................................... 94
MolProbity. .................................................................................................................... 94
QMEAN4. ...................................................................................................................... 95
ProSa-Web. .................................................................................................................. 102
Estructuras generadas................................................................................................... 103
Resultados de anclaje en la estructura 1BX2........................................................................ 103
Primera simulación....................................................................................................... 104
Segunda simulación...................................................................................................... 111
Tercera simulación....................................................................................................... 117
Cuarta simulación......................................................................................................... 122
Comparación de simulaciones...................................................................................... 127
Discusión de resultados...........................................................................................................129
Búsqueda de secuencias, selección de cristales y modelamiento homologo ....................... 129
Modelamiento por homología ................................................................................................ 130

12
Solvatación, refinamiento y evaluación estructural............................................................. 131
Configuración para acoplamiento molecular ....................................................................... 132
Preparación del ligando................................................................................................ 132
Preparación del receptor............................................................................................... 133
Preparación del área de búsqueda. ............................................................................... 134
Acoplamiento molecular......................................................................................................... 134
Primera simulación....................................................................................................... 135
Segunda simulación...................................................................................................... 137
Tercera simulación....................................................................................................... 138
Cuarta simulación......................................................................................................... 139
Modelos estructurales................................................................................................... 140
Conclusiones............................................................................................................................143
Recomendaciones....................................................................................................................146
Perspectivas .............................................................................................................................147
Bibliografía..............................................................................................................................147

13
Lista de figuras
Figura 1. (A) Presentación de antígeno por parte del CMH-I a la izquierda y por parte del
CMH-II a la derecha (Parham, 2014). (B) Vista estructural de los perfiles estructurales para CMH-
I y II (Cole, 2013). ........................................................................................................................ 46
Figura 2. Representación de la región genómica del antígeno leucocitario humano (ALH)
(Stern & Calvo-Calle, 2009)......................................................................................................... 46
Figura 3. Comparación entre el perfil de bolsillos de CMH-I y CMH-II. (A) Bolsillos en
CMH-I. (B) Bolsillos en CMH-II. (C) Longitud de aminoácidos para CMH-I. (D) Longitud
frecuente de aminoácidos para CMH-II (Cole, 2013). ................................................................. 48
Figura 4. Ensayo de competición de unión y determinación diferencial CI50 con marcadores
lumínicos para CMH..................................................................................................................... 54
Figura 5. Representación de la solvatación de un complejo proteína-ligando en una
molécula de agua explicita, la cual es representada como un cubo.............................................. 64
Figura 6. Proceso de minimización energética de una estructura proteica. (Standard, 2015).
....................................................................................................................................................... 65
Figura 7. Diagrama Ramachandran que muestra la relación entre los ángulos dihedrales ψ
y φ. En las áreas señaladas en rojo tienden a agruparse la gran mayoría de aminoácidos,
permitiendo conocer su tipo de configuración estructural dependiendo de su posicionamiento en
el diagrama.................................................................................................................................... 68
Figura 8. A) Diferencias entre una pose de bajísima afinidad (izquierda) y una pose de alta
afinidad (derecha). B) Determinación de espacio de búsqueda, siendo el rojo el eje “x”, el verde el
eje “y” y el azul el eje “z”............................................................................................................. 71

14
Figura 9. Representación visual de la estructura proteica 1BX2, versión caricatura (A y C)
y superficie (B y D)....................................................................................................................... 77
Figura 10. Interfaz gráfica de la herramienta autopsf. En la pestaña opciones se habilitaron
la adición de un cubo de agua y de iones neutralizadores. ........................................................... 79
Figura 11. Demonstración de monomorfismo en las cadenas alfa de diferentes estructuras
de ALH-DR................................................................................................................................... 90
Figura 12. Alineamientos de las cadenas beta ALH-DR de diferentes estructuras. Se puede
observar que el polimorfismo concentrado en las mismas regiones............................................. 90
Figura 13. Alineamientos realizados entre las cadenas beta de la estructura 3PDO con las
cadenas beta de los alelos objetivo. .............................................................................................. 91
Figura 14. Alineamientos realizados entre las cadenas beta de la estructura 1A6A con las
Figura 15. Alineamientos realizados entre las cadenas beta de la estructura 4MDJ con las
Figura 16. Evaluación de parámetros de la calidad estructural con QMEAN4 normalizado
para las estructuras generadas por homología con UCSF Chimera y refinadas con NAMD. ...... 99
Figura 17. Evaluación de parámetros de la calidad estructural con QMEAN4 normalizado
para las estructuras generadas por homología con SCWRL4 y refinadas con NAMD. ............. 101
Figura 18. Gráficas generadas con Prosa-Web para evaluación estructural. (A) representa
la gráfica resultante a partir de una estructura de buena calidad y (B) representa la gráfica resultante
a partir de una estructura de mala calidad................................................................................... 102
Figura 19. Correlación R² entre cálculos de unión con Vina y datos experimentales CI50
para la simulación 1 con 1BX2 sin refinar.................................................................................. 106

15
Figura 20. Correlación R² entre cálculos de unión con Qvina2 y datos experimentales CI50
para la simulación 1 con 1BX2 sin refinar.................................................................................. 106
Figura 21. Histograma del número de modelos y energía para todas las mutaciones de la
simulación 1................................................................................................................................ 107
Figura 22. Modelos del máximo (A), moda (B) y mínimo (C) energéticos de una molécula
pALH-DR2 resultante de la primera simulación, con la cadena alfa en azul y la cadena beta en
rojo. Los bolsillos son: P1 (purpura), P4 (verde), P5 (amarillo), P7 (gris) y P9 (marrón). El color
de los aminoácidos del péptido es rojo para 89 (P1), azul para 92 (P4), naranja para 96 (P6), verde
para 97 (P9)................................................................................................................................. 110
para la simulación 2 con 1BX2 refinado..................................................................................... 112
para la simulación 2 con 1BX2 refinado..................................................................................... 112
simulación 2................................................................................................................................ 113
pALH-DR2 resultante de la segunda simulación, con la cadena alfa en azul y la cadena beta en
rojo. Los bolsillos son: P1 (purpura), P4 (verde), P5 (amarillo), P7 (gris) y P9 (marrón). El color
de los aminoácidos del péptido es rojo para 89 (P1), azul para 92 (P4), naranja para 96 (P6), verde
para 97 (P9)................................................................................................................................. 116
para la simulación 3 del ligando de 1BX2 refinado con NAMD................................................ 118
para la simulación 3 del ligando de 1BX2 refinado con NAMD................................................ 118

16
simulación 3................................................................................................................................ 119
pALH-DR2 resultante de la tercera simulación, con la cadena alfa en azul y la cadena beta en rojo.
Los bolsillos son: P1 (purpura), P4 (verde), P5 (amarillo), P7 (gris) y P9 (marrón). El color de los
aminoácidos del péptido es rojo para 89 (P1), azul para 92 (P4), naranja para 96 (P6), verde para
97 (P9)......................................................................................................................................... 121
para la simulación 4 del ligando de 1BX2 refinado con AMBER.............................................. 122
para la simulación 4 del ligando de 1BX2 refinado con AMBER.............................................. 123
simulación 3................................................................................................................................ 124
pALH-DR2 resultante de la tercera simulación, con la cadena alfa en azul y la cadena beta en rojo.
Los bolsillos son: P1 (purpura), P4 (verde), P5 (amarillo), P7 (gris) y P9 (marrón). El color de los
aminoácidos del péptido es rojo para 89 (P1), azul para 92 (P4), naranja para 96 (P6), verde para
97 (P9)......................................................................................................................................... 126

17
Lista de tablas
Tabla 1. Disponibilidad de ensayos CI50 en IEDB para cuatro loci de ALH-DRB: DRB1,
DRB3, DRB4 y DRB5 (Vita et al., 2014)..................................................................................... 74
Tabla 2. Identidad de Plantillas y objetivos para modelación por homología. ................. 90
Tabla 3. Cambios en mínimos energéticos y RMSD tras refinamiento de estructuras
plantilla y estructuras homólogas generadas con UCSF Chimera y SCWRL4. La medida RMSD
es dada en comparación a la estructura inicial.............................................................................. 93
Tabla 4. Revisión de los parámetros de calidad estructural provistos por MolProbity para
los cristales optimizados. .............................................................................................................. 95
Tabla 5. Revisión de los parámetros de calidad estructural provistos por QMEAN4 para los
cristales originales......................................................................................................................... 97
Tabla 6. Numero de contactos entre el ligando y el receptor obtenidos para la moda y
mínimo en todas las simulaciones............................................................................................... 127
Tabla 7. Resultados del acoplamiento molecular para análogos del ligando con mono-
sustituciones de alanina para las cuatro simulaciones de pALH-DR2. Los bolsillos (P) en la ranura
y el aminoácido que los ocupan están representados en diferentes colores y los puntos anómalos
están subrayados en gris.............................................................................................................. 129

18
Lista de ecuaciones
Ecuación 1. La energía potencial total es calculada como la suma de la energía de todas las
interacciones en péptido-receptor (Phillips et al., 2005)............................................................... 65
Ecuación 2. Energía libre de enlace, definida por sus variables ideales: constante de gas
universal, presión atmosférica y temperatura en kelvins (Du et al., 2016)................................... 72
Ecuación 3. Energía libre de enlace definida como la diferencia entre el cambio de entropía
y el cambio de entalpía en condiciones ideales (Du et al., 2016). ................................................ 72
Ecuación 4. Diferencia entre las energías minimizadas del complejo proteína-ligando,
proteína y ligando (Yunta, 2016).................................................................................................. 72

19
Lista de diagramas
Diagrama 1. Procedimiento para generar con modelamiento homologo estructuras de
moléculas ALH-DR, garantizando su calidad usando metodologías de refinamiento estructural.
....................................................................................................................................................... 80
Diagrama 2. Procedimiento para realizar el ajuste de parámetros necesarios para llevar a
cabo los cálculos de acoplamiento molecular, el cual se aplicó para Autodock Vina y Quick Vina
2..................................................................................................................................................... 82
Diagrama 3. Protocolo de simulaciones 1 y 2 para generar modelos de unión pALH-DR.
....................................................................................................................................................... 87
Diagrama 4. Protocolo de simulaciones 3 y 4 para generar modelos de unión pALH-DR.
....................................................................................................................................................... 88

20
Lista de anexos
Anexo 1. Gráfica muestra de la comparación en los cambios del RMSD (Å) y la energía
(kcal/mol) en un lapso de tiempo (femtosegundos).................................................................... 160
Anexo 2. Scripts para la preparación de automática de estructuras utilizadas en el
acoplamiento molecular.............................................................................................................. 160
Anexo 3. Script para la automatización de acoplamiento molecular con Vina y Qvina2.
..................................................................................................................................................... 161
Anexo 4. Script de Python utilizado para calcular las medidas de tendencia con los datos
de unión....................................................................................................................................... 162
Anexo 5. Script en R para calcular COR ABC y un ejemplo de cómo se organizaron los
datos para ser evaluados en el caso de los péptidos con afinidad muy fuerte (5nM). ................ 163
Anexo 6. Gráficas de dinámicas resultantes a partir del proceso de refinamiento de las
estructuras generadas con UCSF Chimera.................................................................................. 164
Anexo 7. Gráficas de dinámicas resultantes a partir del proceso de refinamiento de las
estructuras generadas con SCWRL 4.0....................................................................................... 168
Anexo 8. Análisis Ramachandran de las estructuras generadas por homología con UCSF
Chimera después del refinamiento.............................................................................................. 172
Anexo 9. Análisis con Prosa-Web de las estructuras generadas por homología con UCSF
Chimera....................................................................................................................................... 174
Anexo 10. Estructuras generadas por homología con mejor calidad. La estructura en cian
representa la original. La estructura resultante tras el refinamiento esta representada con su cadena
alfa en azul y su cadena beta en rojo........................................................................................... 175
Anexo 11. Tablas con las correlaciones calculadas para cinco estadísticos de tendencia
central.......................................................................................................................................... 176

21
Anexo 12. Estructura con defecto en su receptor, impidiendo la entrada del ligando
(blanco). ...................................................................................................................................... 180
Anexo 13. Interacciones de Ala P1 (A), Ala P4 (B) y Ala P6 (C) con aminoácidos
circundantes. Ala P1, Ala P4 y Ala P6 están coloreados en amarillo......................................... 181

22
Glosario
Acoplamiento molecular: Referido como Docking en inglés, es una simulación del proceso de
unión de un ligando a la ranura de un receptor.
Afinidad de unión: O simplemente afinidad, es la capacidad de un péptido para unirse a un
receptor. Entre mayor sea la afinidad más fuerza tendrá la unión. En los ensayos con acoplamiento
molecular, entre más negativo sea el número que representa la energía de unión, mayor es la
afinidad.
ALH: Antígeno leucocitario humano (en inglés LHA). Es la versión humana del CMH por lo que
también tiene tres clases: ALH-I, ALH-II, ALH-III.
Área bajo la curva (ABC): Del inglés: “Area under the curve” y abreviado AUC por sus siglas
en inglés, es el área bajo una curva COR. Se utiliza para proporcionar una medición agregada del
rendimiento en todos los umbrales de clasificación dados.
Característica Operativa del Receptor (COR): Del inglés: “Receiver Operating Characteristic”
y abreviado como ROC por sus siglas en inglés. En las ciencias biomédicas se utiliza para ver el
desempeño de un biomarcador en la predicción de un resultado en comparación al azar.
CD4+T: Linfocitos colaboradores, ayudantes o efectores (en inglés: “T helper”), son un grupo de
linfocitos con un importante papel en el establecimiento de las defensas inmunes. Se encuentran
principalmente en la superficie de las células presentadores de antígenos profesionales.
CD8+T: Los linfocitos citotóxicos se encargan de las funciones efractoras cruciales para la
inmunidad celular, neutralizando células infectadas o anómalas. Se encuentran en la superficie de
la mayoría de células en el cuerpo.

23
CI50: Concentración inhibitoria mediana. Esta es la concentración de necesaria de un compuesto
para inhibir la biotransformación de una sustancia, especificado al 50% de concentración.
CMH: Complejo mayor de histocompatibilidad (en inglés MHC). Tiene tres clases: CMH-I,
CMH-II, CMH-III.
Epítopo: Conocido también como determinante antigénico, es la parte de un patógeno que genera
una respuesta inmune al ser reconocido por las células T. En el contexto del CMH/ALH son
ligandos peptídicos presentados por el CMH/ALH.
Geometría estructural: Forma estructural o física de una proteína. Computacionalmente se
representan en formato PDB.
In-silico: En sílice, refiriéndose los circuitos de un computador. Un experimento biológico hecho
en computadora.
In-vitro: En vitro, que se realiza en tubos de ensayo. Un experimento biológico realizado en un
laboratorio húmedo.
In-vivo: Proceso biológico que ocurre o tiene lugar dentro de un organismo vivo.
Ligando: Sustancia que forma complejos con una biomolécula para servir un propósito. En este
trabajo el termino ligando se usa de forma intercambiable con los términos péptido, antígeno y
epítopo. Dependiendo de su afinidad con los receptores CMH/ALH pueden o no ser presentados a
las células T.
Modelamiento por homología: También llamado modelamiento comparativo, es el proceso de
generar nuevas estructuras a partir de un cristal homólogo con alta similitud.
pCMH/pALH: Abreviatura para el complejo creado por el péptido y el CMH o el péptido y ALH.

24
PDB: Del inglés: “Protein Data Bank”, es una base de datos con una amplia colección de
estructuras proteicas resueltas experimentalmente.
Receptor: Molécula que recibe señales químicas. En este trabajo los receptores son las ranuras del
CMH/ALH y las señales químicas que reciben son los ligandos, los cuales presentan a las células
T.
Refinamiento estructural: Proceso para mejorar la calidad de una estructura proteica durante el
proceso de modelado para acércalas más a un estado nativo.
Región de unión a péptidos: Abreviada RUP, esta es la región del receptor proteico con mayor
afinidad hacia los péptidos, permitiendo su unión. En CMH/ALH, esta región tiene unos sockets
o bolsillos que permiten el anclaje de las cadenas laterales de cada péptido.

25
Introducción
Los genes del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) son extremadamente
polimórficos, codificando proteínas de superficie pertenecientes a la superfamilia de las
inmunoglobulinas, cruciales para la defensa inmune de los vertebrados (Kaufman, 2018).
Denominado como ALH (antígeno leucocitario humano) en humanos, el CMH tiene
aproximadamente 20,088 alelos reportados en la IMGT/HLA a la fecha de septiembre del 2018
para las clases ALH-I y II, siendo de los loci más polimórficos en los vertebrados. Este
polimorfismo es mantenido en mayor parte por una selección balanceante mediada por la dinámica
co-evolutiva entre hospederos y parásitos, donde se favorecen los alelos específicos que puedan
proveer mayor protección contra uno o más parásitos. La selección balanceante se refiere a varios
procesos selectivos que no son mutuamente exclusivos y que pueden explicar cómo se ha
mantenido el polimorfismo en el CMH por medio de la selección natural (Kaesler et al., 2017).
Primero tenemos la hipótesis de la selección según la frecuencia negativa que propone que los
alelos exóticos pueden conferir ventajas selectivas, ya que al ser novedosos son más eficaces contra
los parásitos especializados en vulnerar las defensas expresadas por los alelos más frecuentes
(Ejsmond & Radwan, 2015). Segundo, la hipótesis de la sobredominancia, que propone que los
individuos heterocigóticos tienen una mayor aptitud biológica que los individuos homocigóticos
al ser capaces de generar una respuesta inmune con un mayor repertorio de reconocimiento que
puede tratar con una mayor variedad de parásitos (McClelland, Penn, & Potts, 2003).
Un factor de mayor relevancia en estos procesos selectivos ha sido la reproducción sexual
(Edwards & Hedrick, 1998), ya que este ha sido el mecanismo a través del cual se ha preservado
el alto polimorfismo y heterocigosidad de estos genes. Los mecanismos de selección sexual han
resultado ser una estrategia óptima para mantener una alta diversidad de genes CMH en la

26
población al mismo tiempo que se crea un balance optimo entre la diversidad del repertorio CMH
y la diversidad de células T en los individuos. En esta selección, los individuos eligen las parejas
reproductivas que tengan el mayor potencial para complementar sus genes CMH (Reusch,
HaÈberli, Aeschlimann, & Milinski, 2001), permitiendo la posibilidad de disponer de un gran
reservorio de genes CMH funcionales a nivel población y mantener a la vez una diversidad optima
de CMH a nivel de individuos para optimizar sus capacidades de inmunocompetencia (Milinski,
2016).
Las moléculas CMH se clasifican en dos clases según el origen del antígeno. Si el antígeno
es de origen endógeno, el péptido será presentado por una molécula CMH clase I a un linfocito
CD8+T, conocidos también como linfocitos citotóxicos, que se encargan de neutralizar células
infectadas por microorganismos intracelulares. Si es el antígeno es de origen exógeno, será
presentado por una molécula CMH clase II a un linfocito CD4+T, conocidos también como
linfocitos colaboradores o Th (T helper), los cuales ayudan a estimular la respuesta inmunitaria
activando otros inmunocitos, incluyendo a CD8+T (Neefjes, Jongsma, Paul, & Bakke, 2011). Los
péptidos presentados CMH-I son fragmentos proteicos encontrados en el citosol de las células, que
pueden ser de origen propio, tumoral o de patógenos intracelulares, principalmente virus (Janeway
Jr, Travers, Walport, & Shlomchik, 2001). Por otra parte, los péptidos presentados por las
moléculas CMH-II son fragmentos proteicos de antígenos exógenos previamente fagocitados y
procesados por las células presentadoras de antígeno profesionales, teniendo un papel crítico en la
respuesta inmune adquirida contra una gran diversidad de patógenos (Neefjes et al., 2011).
Entender como los péptidos son presentados a CMH mediante estas dos vías es fundamental para
entender el funcionamiento de los procesos de respuesta inmune, siendo la afinidad pCMH
(péptido-CMH) un factor clave. Por lo tanto, la cuantificación de la afinidad pCMH es un factor

27
decisivo para identificar o diseñar epítopos que garanticen una respuesta inmune adecuada,
requisito necesario para su aplicación terapéutica (Andreatta et al., 2015).
Este trabajo se enfocó en el ALH-DR, el cual se distingue de las otras subclases de CMH
clase II ALH-DP y ALH-DQ, en que tiene el mayor nivel de expresión y tiempo de expresión en
superficie celular (Gansbacher & Zier, 1988; Glimcher & Kara, 1992), además de tener una cadena
beta muy polimórfica, con alrededor de 2,593 variantes alélicas comparada con 7 alelos para la
cadena alfa. Algunos ejemplos de la importancia de ALH-DR en la investigación de enfermedades
incluyen su rol en la detección de antígenos tumorales (Röhn et al., 2005), en la evaluación de
respuestas inmune en vacunas contra el sarampión (Ovsyannikova, Pankratz, Vierkant, Jacobson,
& Poland, 2006), en la caracterización de péptidos que generen respuesta contra la tuberculosis
(Shams et al., 2004); y en malaria, ya que la inmunidad contra este parasito está controlada
principalmente por la región genética de ALH-DRB (Suárez et al., 2017). Estas características que
hacen importante su estudio en el campo biomédico (Stern & Calvo-Calle, 2009).
Para medir la unión pCMH in-vitro, la metodología estándar son los ensayos de afinidad
por competencia (Salvat, Moise, Bailey-Kellogg, & Griswold, 2014), en los que se utiliza una
concentración de un ligando marcado (radiomarcado o fluoromarcado) para determinar la
presencia de varias concentraciones de compuestos competidores no marcados, midiendo el CI50
(concentración inhibitoria media). También se utilizan técnicas como la micro-calorimetría
(Willcox et al., 1999) o la resonancia de plasmones (Szabo, Stolz, & Granzow, 1995). Los métodos
in-vitro presentan un desafío experimental considerable cuando se necesita evaluar la unión de un
número considerable de sistemas pCMH ya que el número de permutaciones peptídicas estimadas
para un ligando en la ranura CMH puede llegar a ser considerablemente alto. Por ejemplo, al
calcular las posibles permutaciones con repetición para un péptido de nueve aminoácidos, se revela

28
que el repertorio potencial para ligandos de este tamaño puede alcanzar un total de 5.12 × 1011
posibles combinaciones en CMH-II. Si se unieran péptidos de 11 a 30 aminoácidos al CMH-II, el
número de permutaciones podría ser desde 2.048 × 1014
hasta 1.074x1039
combinaciones
respectivamente; teniendo en cuenta que el CMH-II puede llegar a unirse con péptidos de una
longitud mucho mayor, se debe asumir que el número potencial de permutaciones que conforman
el repertorio total es enorme. A la fecha (marzo del 2018), la IEDB registra tan solo en ensayos de
CMH-I 666,432 péptidos, mientras que en ensayos para CMH-II hay 222,742 péptidos. En adición
al problema del enorme número de combinaciones peptídicas posibles, está el hecho de que los
receptores del CMH tienen un altísimo polimorfismo (Tsai & Santamaria, 2013), por lo que sería
necesario hacer un número abrumador de ensayos siguiendo un abordaje en húmedo para medir
sus afinidades y seleccionar aquellos con una cantidad alta. Otro inconveniente con estos ensayos
es que consumen las muestras en el proceso, ya sea por degradación o por la dificultad de
recuperarlas intactas. Estas muestras están compuestas por péptidos, formando complejos
estructurales con una molécula CMH, las cuales deben ser aisladas y purificadas, proceso que es
técnicamente difícil y costoso (Sidney et al., 2013). Por esta razón, la disponibilidad y viabilidad
de moléculas de CMH es el mayor cuello de botella en la estimación de la unión pCMH usando
métodos experimentales en húmedo.
Debido a los factores anteriores, es necesario tener alternativas para evaluar las afinidades
de unión de péptidos diferentes a los métodos experimentales. Una solución es el desarrollo de
métodos in-silico que permitan predecir la unión de péptidos a CMH-II con precisión. Estos
métodos se clasifican en dos grandes grupos: los métodos basados en secuencias y los métodos
basados en estructuras. Aquellos basados en secuencias utilizan una enorme cantidad de datos
experimentales para realizar predicciones con técnicas de aprendizaje de máquina - AM (ML del

29
inglés Machine Learning), que incluyen búsqueda de patrones, matrices cuantitativas, redes
neuronales artificiales, modelos de Markov ocultos, algoritmos de Monte Carlo entre otros. La
herramienta basada en secuencias con mayor precisión en la actualidad (con un 85% de exactitud
en promedio) es NetCMHIIpan, un predictor pan-específico que utiliza pseudo-secuencias de
ALH-II (es decir, no usa la secuencia completa para realizar la predicción, solo algunos
aminoácidos que están en contacto con el péptido) y la secuencia del péptido como requerimientos
para la estimación de la unión, teniendo la capacidad para predecir cualquier unión entre cualquier
ALH-II y péptidos de interés; sin embargo, la precisión de la predicción de este métodos cuando
se cuenta con muy pocos datos de entrenamiento puede ser baja (Luo et al., 2015). La capacidad
predictiva de estos métodos es medida en términos del área bajo la curva COR (ABC) y los
coeficientes de correlación de Pearson, que buscan graficar la sensibilidad del método contra la
tasa de falsos positivos, siendo un valor de ABC = 1 indicativo de predicciones perfectas y ABC
= 0.5 de predicciones aleatorias (Nielsen, Justesen, Lund, Lundegaard, & Buus, 2010).
Otra escuela en la predicción de unión pCMH son los métodos basados en estructuras, que
se han vuelto más asequibles debido al incremento de estructuras generadas por métodos
experimentales y a su facilidad de acceso en bases de datos públicas. Estos métodos buscan
estudiar las interacciones entre los átomos del péptido y de la ranura del CMH con el propósito de
cuantificar y predecir la energía de unión del complejo que se crea tras su unión (Liao & Arthur,
2011). Estos métodos pueden utilizar estructuras generadas por homología con moléculas CMH
similares, fundamentándose en la observación de que proteínas con alta identidad en la secuencia
de aminoácidos tienen una topología global similar a menudo se unen con ligandos similares
(Russell, Sasieni, & Sternberg, 1998). La idea en este trabajo, consiste en aprovechar esta
propiedad de las proteínas homologas para realizar ensayos de unió in-silico en alelos que no tienen

30
un cristal disponible, utilizando una estrategia computacional para generar estructuras homologas
de buena calidad para posteriormente evaluarlas con métodos de acoplamiento molecular
(conocido en inglés como “molecular docking”), comparando los datos de afinidad hallados in-
silico con datos experimentales CI50 de esta manera verificando la capacidad predictiva de esta
metodología computacional, validada por la reproducibilidad de la tendencia de unión de datos
experimentales CI50 contra los datos de unión calculados por medio de acoplamiento molecular.
La unión de un péptido a CMH-DR es un proceso clave en la presentación del antígeno a
CD4+T, siendo el hallazgo de epítopos con alta afinidad un objetivo clave en el desarrollo de
herramientas diagnosticas o terapéuticas. Los enfoques tradicionales de vacunología tradicional
pueden fallar en encontrar epítopos óptimos para una vacuna, como en el caso del patógeno
Neisseria meningitidis en el que las vacunas conjugadas inducían anticuerpos bacterianos para
todos los serogrupos a excepción del B, debido a que sus polisacáridos capsulares son idénticos al
ácido polisiálico presente en los humanos (Pizza et al., 2000). Sin embargo, tras la secuenciación
completa de su genoma y con asistencia de herramientas informáticas, fue posible desarrollar una
vacuna contra este patógeno, utilizando una serie de técnicas que en conjunto se conocen como
vacunología reversa (VR). (Modjarrad & Koff, 2016). Esta metodología consistió en examinar
todo el genoma del patógeno para identificar todos sus posibles antígenos a partir de sus marcos
abiertos de lectura (ORF), excluyendo aquellas secuencias que pudiesen presentar homología con
proteínas humanas, lo que permitió hallar candidatos con alto potencial terapéutico que finalmente
terminaron por convertirse en una vacuna (Christodoulides & Heckels, 2017), demostrando el
potencial que tiene esta metodología como herramienta para el descubrimiento de vacunas contra
una gran variedad de enfermedades. El énfasis de este trabajo es evaluar metodologías
estructurales que se inscriban en el esfuerzo de desarrollo de vacunas basadas en péptidos para ser

31
usadas en el marco de la vacunología reversa. La VR consiste en examinar todo el genoma de un
patógeno en busca de genes que puedan expresar antigenicidad, filtrando aquellos que puedan
exhibir propiedades deseables para el diseño de vacunas (Kumar Jaiswal et al., 2017; Sette &
Rappuoli, 2010). Actualmente la VR busca complementarse con técnicas que le permitan aumentar
su eficiencia para encontrar objetivos de vacunación, incorporando ML para hacer más eficiente
el proceso de encontrar epítopos prometedores, como por ejemplo los clasificadores usados para
distinguir entre antígenos protectivos y no protectivos de manera automática, haciendo más
eficiente este proceso (Heinson et al., 2017).
En la identificación de epítopos de células T (partes del antígeno reconocidas por las células
T), existe un gran interés en estudiar la unión pCMH debido a la gran correlación existente entre
la fuerza de unión en este complejo y su habilidad para generar una respuesta inmune competente
por parte de las células T (Jensen et al., 2018). Sin embargo, encontrar epítopos a partir de una
enorme cantidad de péptidos es un desafío debido a su gran diversidad. Para solucionar este
problema en la actualidad se utilizan métodos pan-específicos basados en AM, ya que son
eficientes para predecir la afinidad de unión, siendo útiles para obtener predicciones de unión
precisas para pCMH (Lianming Zhang, Udaka, Mamitsuka, & Zhu, 2011). Para la predicción de
unión (pCMH), se han utilizado varias metodologías pan-específicas basadas en AM, siendo las
más conocidas: TEPITOPE: es un paquete de software que incorpora perfiles de bolsillos con una
matriz de datos para la predicción de pCMH (Sturniolo et al., 1999). Este algoritmo es utilizado
para predecir epítopos en el ALH-DR, tanto promiscuos como específicos. Alineamiento SMM:
Matriz de alineamiento estabilizante que permite la predicción de afinidades pCMH (Nielsen,
Lundegaard, & Lund, 2007). TEPITOPEpan: Este método es una extensión del original para
aplicarlo a la predicción de unión en más alelos. Puede hacer predicciones cualitativas para
cualquier molécula ALH-DR de secuencia conocida. NetCMHII: Este es un método el cual intenta

32
predecir péptidos de unión para 25 alelos de ALH-DR, 20 alelos de ALH-DQ, 9 alelos de ALH-
DP y 7 alelos de ratón., utilizando redes neurales artificiales entrenadas con 100,000 datos de unión
pALH extraídos de IEDB (Nielsen, Lundegaard, Blicher, et al., 2007). NetCMHpan: Una variante
del anterior. Este método pan-especifico es capaz de predecir unión peptídica a cualquier molécula
CMH. (Karosiene et al., 2013). La versión 3.2 está enfocada en la predicción de pALH-II, siendo
entrenado con más de 50,000 datos de unión para ALH-DR/DP/DQ (Jensen et al., 2018).
Al estar basadas en AM, estas metodologías tienen en común que necesitan de una enorme
cantidad de datos experimentales para entrenar algoritmos que permitan predecir la afinidad de un
péptido con un receptor. En CMH/ALH, estos datos provienen de los ensayos de unión por
competición, usando el valor de CI50 como estimador de la unión. Para atender esta necesidad de
información, sitios como la base de datos de epítopos inmunes y recurso analítico (IEDB)
mantienen datos de ensayos de unión curados y organizados para facilitar su uso en el desarrollo
de metodologías para estudiar el proceso de unión pCMH. Sin embargo, hallar nuevos candidatos
con base en la información genómica y metodologías basadas en AM no es la única manera de
acelerar el proceso para hallar candidatos terapéuticos ya que aún es posible optimizar los ensayos
de unión para determinar que candidatos presentan las mejores afinidades in-vitro y por ende su
potencial para generar una respuesta inmunogénica in-vivo. Aquí es donde se aplican los métodos
para evaluar los ensayos de unión in-silico, conocidos como predicción de epítopos basados en
estructuras permitiendo disminuir aún bajo costes y aumentar la confiabilidad de las predicciones
en cuanto a la capacidad de unión de un epítopo determinado (Gourlay, Peri, Bolognesi, &
Colombo, 2017).
Para realizar ensayos de unión in-silico con métodos estructurales, un prerrequisito esencial
es la existencia de una estructura tridimensional, proveniente de experimentos de cristalografía,
criomicroscopía electrónica o resonancia magnética. En caso de no existir una estructura

33
tridimensional para el alelo CMH objetivo, se puede generar una estructura viable es el de
modelamiento estructural por homología, debido al gran parecido entre todas las estructuras CMH,
haciendo posible realizar cálculos de unión pCMH. Muestras de este enfoque, fueron los trabajos
realizados con ALH-DR por Atanasova et. al., 2011, a partir de estructuras generadas por
homología en el que se estimó la unión usando anclaje (docking), validando los resultados con
ensayos de unión experimentales medidos con CI50, determinando que esta aproximación es
confiable para predecir las afinidades de unión pCMH. La convergencia de estos métodos de
anclaje con el uso de dinámicas moleculares para el cálculo de energías libres estructurales,
especialmente con la inclusión de moléculas de agua críticas en la interfase pCMH, producen
resultados de afinidad de unión más confiables, precisos y reproducibles para CMH, siendo las
dinámicas que utilizan la mecánica molecular para área-superficie de Poisson-Boltzmann y la
mecánica molecular generalizada de área-superficie Born (MMPB(GB)SA) los más populares
debido a que ofrecen un buen balance entre velocidad y precisión (Wan, Knapp, Wright, Deane,
& Coveney, 2015). González et. al., (2017) encontraron también que las aguas estructurales son
de gran importancia para mejorar la precisión de los métodos estructurales, al estudiar la unión
pCMH usando un enfoque basado en estructuras, en el que se utilizaron métodos cuánticos semi-
empíricos (PM7 y FMO-DFTB) para calcular las energías de enlace de péptidos unidos a ALH-
DR1 y ALH-DR2, encontrando que existe una alta correlación de estos cálculos con los valores
CI50 incluyendo el efecto de moléculas de agua en la unión.
En el presente trabajo se modelaron estructuras de ALH-DR por homología de los
complejos no cristalizados que tuvieran ensayos de unión en la base de datos IEDB y se estableció
un protocolo para acoplamiento molecular usando como prueba de concepto la molécula ALH-
DR2 (AHL-DRA*01:01 – AHL-DRB1*15:01) complejada a una serie monosustituida de péptidos

34
derivados de mielina, realizando una validación de los resultados comparándolos con resultados
de unión obtenidos por CI50.
Se encontró que existe una correlación entre las afinidades calculadas con anclaje y las
afinidades experimentales CI50 calculadas para ALH-DR2-mielina, existiendo variaciones en la
correlación entre los distintos protocolos de anclaje y refinamiento. Por otra parte, se generaron 8
nuevas estructuras proteicas de ALH-DR utilizando el principio de modelamiento por homología,
con una muy alta similitud estructural a sus modelos, realizando las optimizaciones respectivas a
las estructuras obtenidas, y corroborando su buena calidad estructural demostrando la efectividad
de los procesos de refinamiento estructural. La aproximación metodológica seguida muestra que
es posible obtener nuevas estructuras de buena calidad aplicando técnicas de modelamiento por
homología y refinamiento estructural, para ser usadas como una base confiable en la realización
de ensayos in-silico.

35
Planteamiento del problema
Una respuesta inmune adaptativa exitosa depende de que se dé con alta afinidad la unión
entre antígenos extracelulares y los receptores del CMH clase II. Tanto los antígenos de los
patógenos como las moléculas del CMH clase II provienen de un trasfondo de diversidad, que
refleja una carrera co-evolutiva en donde la diversidad en los epítopos patogénicos es causa y
efecto del alto polimorfismo de moléculas del CMH en las poblaciones de vertebrados. Esta
diversidad, sumada a la dificultad y costos de realizar ensayos de unión experimentales, requiere
del desarrollo de metodologías in-silico. Entre las alternativas disponibles los métodos
estructurales se destacan por su robustez, permitiendo la evaluación de la unión pCMH y la
generación de modelos que permiten la explicación de la unión en sí misma, una ventaja que no
tienen los métodos basados en AM.
En este trabajo pretende evaluar el método de anclaje molecular para realizar predicciones
sobre la afinidad de unión pCMH. Se explorarán herramientas disponibles para realizar modelos
de homología para estas moléculas, se probarán varios protocolos para optimizar las estructuras
asegurando que adquieran sentido estructural se evaluarán algoritmos para verificar la calidad de
las estructuras, finalmente, un set de datos se usara para llevar a cabo la estimación de la unión
pCMH usando dos algoritmos de anclaje.

36
Justificación
Las moléculas de ALH son un sistema genético altamente polimórfico. Tan solo para ALH-
DR a la fecha de junio del 2018 según las estadísticas del sitio IMGT/ALH se contabilizaron 2471
alelos (7 de DRA y 2.464 de DRB). A nivel poblacional, esta variedad permite que el sistema
inmune pueda reaccionar a una gran variedad de patógenos, determinando por tanto que
resistencias y susceptibilidades a enfermedades que pueda tener este, como también la forma en
que reaccione a influencias ambientales (Trowsdale & Knight, 2013). Este sistema es clave para
que se dé la respuesta inmune adaptativa, ya que las células T solo pueden reconocer los péptidos
o antígenos en un contexto restringido por la presencia del CMH/ALH; entenderlo tiene un gran
potencial para mejorar la calidad de vida humana a través del desarrollo de medicamentos y
vacunas más eficaces. La herramienta más importante en el estudio de la interacción péptido-
CMH/ALH son los ensayos de unión, pero caracterizar experimentalmente todas las afinidades de
unión posibles en pALH para la predicción de epítopos en húmedo es muy costoso en tiempo y
dinero (Lianming Zhang et al., 2011). Debido a esto se ha favorecido el desarrollo de métodos que
permitan medir o predecir la unión del péptido al CMH in-silico. El problema de predecir la unión
del péptido al CMH ha sido abordado con metodologías computacionales basadas en AM, que
usan enfoques como redes neuronales, siendo ejemplo de esta aproximación el algoritmo
NetCMHpan (Nielsen & Andreatta, 2016), el cual utiliza datos de unión para aplicarlos a un
modelo de entrenamiento que a su vez solo se aplica para predecir la unión de los péptidos a la
molécula de CHM. La capacidad predictiva es distinta dependiendo de la clase de CMH, teniendo
por lo general más éxito predictivo en moléculas CMH-I que en CMH-II, ya que las primeras
tienen una ranura cerrada por lo que se unen a péptidos más cortos, con menos sitios de
reconocimiento específicos (bolsillos) y en un marco de unión único, mientras que las ultimas al
ser de ranura abierta en ambos extremos, los péptidos que pueden enlazar son mucho más largos,

37
por lo que es mucho más difícil identificar el marco de enlace (Nielsen, Lund, Buus, &
Lundegaard, 2010). Servidores como NetCMHpan han ido incrementando esta precisión
predictiva con los años, estando actualmente en un promedio de 90% para CMH-I (Jurtz et al.,
2017) y de 85% para CMH-II (Jensen et al., 2018). A pesar de que aún no se tiene una capacidad
predictiva del 100%, las ventajas de realizar estos ensayos in-silico tiene ya una aplicación en el
descubrimiento de nuevos epítopos y en la disminución del uso de métodos húmedos
(Ranganathan, Tong, & Tan, 2007).
Como ya se ha mencionado, los métodos bioinformáticos para estudiar la unión pCMH se
clasifican en aquellos basados en inteligencia artificial y aquellos basados en estructuras. Los
métodos basados en estructuras se han usado con éxito para predecir la afinidad de unión de ALH-
II, siendo dependientes de la disponibilidad de datos producidos experimentalmente, sin embargo,
es posible que estas metodologías puedan extrapolarse a moléculas sin datos de unión usando
criterios de similitud de secuencia denominándose entonces métodos pan-específicos. Ejemplos
son TEPITOPEpan (Lianming Zhang et al., 2012) y NetCMHIIpan (Karosiene et al., 2013), los
cuales puede extrapolar las especificidades de unión conocidas para otros alelos basándose en las
similitudes de los bolsillos.
Los métodos basados en estructuras para el estudio de la unión pCMH, se han mostrado
como herramientas confiables para la búsqueda a gran escala de epítopos para CD4+T (Mariyana
Atanasova, Patronov, Dimitrov, Flower, & Doytchinova, 2013). Estos métodos son dependientes
de estructuras, y en caso de que estas no estén disponibles en forma de cristal, es posible generarlas
con estrategias como modelamiento homólogo de estructuras. Estos enfoques son útiles dado que
permiten proponer modelos que permiten estudiar como las moléculas del péptido interactúan con
el receptor, permitiendo estudiar porque algunos péptidos tienen una mayor afinidad que otros. El

38
desarrollo de metodologías basadas en estructura para evaluar la interacción pCMH se justifica
dada las limitaciones de las opciones experimentales en húmedo e in-silico disponibles. El uso de
métodos estructurales robustos y rápidos es necesario, requiriendo de la generación de los modelos
de homología, su refinamiento y el uso de métodos de evaluación de la interacción ligando-
receptor eficaces (desde la óptica tiempo-calidad-capacidad de computo). La distribución de
posiciones conservadas y polimórficas en la región de unión a péptidos de las estructuras
cristalográficas indica que los aminoácidos conservados interactúan con los átomos de la columna
peptídica enlazados vía una red de puentes de hidrogeno y donde los bolsillos polimórficos pueden
interactuar con las cadenas laterales de los aminoácidos del péptido (Brown et al., 1993). En ALH-
DR, los aminoácidos conservados suelen estar en el P1, y las regiones polimórficas cerca de P4,
P6, P7 y P9 (Stern & Calvo-Calle, 2009). El modelamiento por homología busca preservar estas
características en los modelos calculados, usando métodos de refinamiento estructural eficientes.
El uso de la metodología de anclaje molecular se justifica en su eficiencia y en su razonable
costo computacional, por lo que tiene el potencial pare ser utilizado para realizar cribados
(screening) de una cantidad enorme de complejos pCMH. Utilizando anclaje sobre las estructuras
generadas por homología es posible generar modelos de cómo un ligando interactúa con el receptor
y qué afinidad pueda tener dicha interacción. Adicionalmente, dado que se conoce cada uno de los
modelos pCMH calculados y la manera en que ocurre la interacción se generan resultados con gran
capacidad explicativa.

39
Objetivos
Objetivo general
Simular el proceso de unión pCMH-DR, modelando estructuras y perfiles de unión de
péptidos con métodos computacionales estructurales.
Objetivos específicos
● Generar con modelamiento homologo estructuras de moléculas ALH-DR, garantizando
su calidad usando metodologías de refinamiento estructural.
● Generar modelos de unión pCMH, usando métodos de anclaje y validar los resultados de
unión obtenidos con datos de unión experimentales conocidos.
• Comparar el desempeño de los protocolos de refinamiento y anclaje utilizados para la
generación de estructuras por homología y la estimación de la unión pCMH.

40
Marco Teórico
Polimorfismo en el CMH, mecanismos e importancia
El complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) es una región genómica que contiene
varios loci extremadamente polimórficos que codifican proteínas de superficie pertenecientes a la
superfamilia de las inmunoglobulinas y son clave en la respuesta inmune adaptativa e
histocompatibilidad de los vertebrados, por lo que su estudio tiene relevancia en varios campos
relacionados con la biología evolutiva y las ciencias de la salud (Kaufman, 2018). En humanos, el
CMH se denomina ALH (Antígeno leucocitario humano), con aproximadamente de 20,088 alelos
reportados a la fecha en IMGT para todas las clases (noviembre del 2018), habiendo 14,800 alelos
para ALH clase I, 5,288 alelos para ALH clase II, siendo el ALH la región más polimórfica del
genoma humano y 187 alelos de otras moléculas no ALH. Este nivel alto de polimorfismo ha sido
generado evolutivamente a partir de mutaciones puntuales y recombinaciones genéticas (Martínez-
Borra & López-Larrea, 2012).
Las mutaciones puntuales son aquellas que afectan únicamente a un nucleótido y se dan
cuando ocurren errores durante la replicación del DNA, que son provocados por factores como por
ejemplo radiación o agentes químicos; si los mecanismos de reparación fallan estas mutaciones se
fijan en él genoma. En cambio, la recombinación genética del CMH genera modificaciones más
extensas, por ejemplo, cuando se intercambian exones entre dos alelos. Luego, los procesos de
selección positiva y selección balanceada son impulsados por la presión selectiva causada por
patógenos, encargándose de promover la supervivencia de los nuevos alelos que resulten ser más
resistentes (Ejsmond & Radwan, 2015; Modjarrad & Koff, 2016). En la selección positiva, se
incrementa la frecuencia de un alelo ventajoso con la capacidad para incrementar la aptitud
evolutiva (Vallender & Lahn, 2004) y a partir de esta, actúa la selección balanceada, donde se

41
mantienen estables las frecuencias de dos o más formas alélicas en una población, funcionando
por medio de dos mecanismos: ventaja heterocigótica y selección dependiente de frecuencia
(Sommer, 2005). Estos procesos son a su vez impulsan otros mecanismos evolutivos, tales como:
Selección natural y polimorfismo trans-especies.
El polimorfismo del CMH se ha mantenido principalmente por medio de mecanismos de
selección natural (sexual y fluctuante), el cual tiene la posibilidad de ser heredado a través de los
procesos de especiación, fenómeno conocido como polimorfismo trans-especies (Milinski, 2016).
La selección natural. por medio de la selección sexual, permite a los individuos maximizar la
resistencia de sus descendientes contra patógenos o parásitos, manteniendo a la vez una gran
diversidad de alelos CMH en el acervo genético de la población (Martínez-Borra & López-Larrea,
2012). A su vez, la selección fluctuante, la cual se caracteriza por la variación en las presiones
selectivas en el espacio y tiempo, puede producir cambios en la abundancia de un patógeno o
parasito a través del tiempo, lo cual crea variaciones en la intensidad de presión selectiva a la cual
puede estar expuesto el CMH de una población (Spurgin & Richardson, 2010; Těšický & Vinkler,
2015). Estas condiciones favorecen la formación del polimorfismo en el CMH, el cual es
mantenido por una selección balanceante a lo largo de escalas macro evolutivas, persistiendo a
través de eventos de especiación (Eimes, Townsend, Sepil, Nishiumi, & Satta, 2015; Klein, Sato,
Nagl). Todos estos procesos han sido determinantes en la organización genómica y estructural
actual del CMH.
Organización genómica del CMH
El complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) es una familia de genes que se encuentra en el
cromosoma 6p21 en humanos (17 en ratones) con una extensión de 4 centi-morgans (cM) de ADN,
teniendo cerca de 4 mega bases. En humanos el CMH es denominado antígeno leucocitario

42
humano (ALH). El CMH está asociado a la resistencia o susceptibilidad a múltiples enfermedades
(Trowsdale & Knight, 2013), así como con el proceso de rechazo trasplantes alogénicos, siendo
la respuesta más fuerte determinada por los alelos ALH-DR > ALH-B > ALH-A en este respectivo
orden (Bartels, Otten, Van Gelderen, & der Lelij, 2001; Vu et al., 2011), siendo estos loci los más
relevantes en la búsqueda de donante y receptor. Este grupo de moléculas se divide en tres
subgrupos o clases I, II y III. Las moléculas clase I (CMH-I) son expresadas en la en la mayoría
de las células nucleadas del cuerpo y se encargan de la presentación inmune a las células T al igual
que las moléculas clase II (CMH-II), las cuales son expresadas principalmente por las células
presentadoras de antígeno. Por último, están las moléculas de clase III (CMH-III), las cuales no
están relacionadas con los procesos de presentación inmune como I y II, pero que codifican
proteínas con funciones en el sistema de complemento inmune además de moléculas relacionadas
con respuesta inflamatoria. Estas tres clases de moléculas no solo difieren en su función, sino que
también en su organización estructural y genómica, por lo que es necesario dar descripción más
detallada de sus genes, funciones y estructura:
Las moléculas de clase I.
Estas están presentes en todas las células nucleadas del cuerpo, subdividiéndose en las
moléculas clásicas CMH -A, CMH -B, CMH -C. Los CMH A, B y C (figura 2), siendo su principal
función la presentación de antígenos intracelulares al linfocito CD8+T (figura 1), tienen un papel
importante en el reconocimiento de tejidos propios y foráneos. En adición a estos genes clásicos,
la región I también codifica una serie de genes denominados “no clásicos”, los cuales son ALH-
E, ALH-F y ALH-G conocidos también como la familia 1B (Charron & Petersdorf, 2013). Estos
tienen un muy bajo polimorfismo a comparación de sus contrapartes clásicas, presentando un
conjunto muy restringido de antígenos, teniendo funciones como la presentación de glucolípidos

43
bacterianos, regulación del linfocito NK y de TCD8 como también de expresar la proteína HFe
para regular la absorción del hierro. Estas moléculas se conforman por una cadena α con tres
dominios extracelulares, α1 y α2, que forman una ranura cerrada y un dominio α3 en la membrana,
siendo el peso de esta cadena 43 kDa. Esta es codificada por un único gen variante (ya sea ALH-
A, ALH-B o ALH-C) y forma un complejo con una microglobulina β2 con un peso de 12 kDa, la
cual se encuentra en la membrana junto a α3. Esta molécula es codificada independientemente por
gen invariante ubicado en el cromosoma 15, siendo este en humanos B2M. (Chelbi, Dang, &
Guarda, 2017; Neefjes et al., 2011).
Las moléculas de clase II.
Estas pueden encontrase en las células presentadoras profesionales de antígeno, células
tímicas y células B (aunque por activación con IF γ pueden expresarse en fibroblastos y
queratinocitos), cuyos genes se encuentran ubicados en la región 6p21.32. Las moléculas del CMH
clase II se dividen funcionalmente en dos tipos; las moléculas clásicas encargadas de la
presentación de péptidos a los linfocitos CD4+ (ALH-DR, ALH-DQ y ALH-DP) y moléculas no
clásicas (ALH-DM y ALH-DO) con funciones de chaperonas que median el proceso de carga de
los péptidos a las moléculas clásicas (figuras 1 y 2). En estas moléculas, ambas cadenas son
expresadas genes distintos. Por ejemplo, en ALH-DR la cadena invariante α, con un peso de 34
kDa, es codificada por el locus no polimórfico ALH-DRA, mientras que las cadenas polimórficas
β, con un peso de 28kDa, son codificadas por un locus polimórfico que puede ser ALH-DRB1,
ALH-DRB3, ALH-DRB4 o ALH-DRB5 (Tong, Tan, & Ranganathan, 2004). En estas cadenas,
los dominios α1 y β1 se ubican en la parte exterior formando una ranura abierta, mientras que los
dominios α2 y β2 se encuentran en la membrana.

44
ALH-DR en particular, se distingue de ALH-DP y ALH-DQ, debido a que tiene el mayor
nivel de expresión en la superficie celular durante la respuesta inmune y en el tiempo que se da
esta expresión. Esto fue demostrado por Gansbacher y Zier (1988) con experimentos en cinética
de expresión de moléculas ALH-DR durante el crecimiento y activación in-vitro de células T se
evidencio como los niveles de expresión para DR en la superficie de las células al comienzo de la
respuesta inmune fueron los más rápidos en aumentar, como también los más lentos en disminuir
en el tiempo. En adición, ALH-DRB es el gen de cadena β más polimórfico con alrededor de 2,593
variables alélicas de las cuales 2,268 pertenecen a DRB1, seguidos en diversidad por DQB1 con
1,257 variantes y DPB1 con 1,014 variantes, característica que sumada a las anteriormente
expuestas, hacen del CMH-DR una molécula clave para el estudio genéticos y farmacéutico de
múltiples patologías (Stern & Calvo-Calle, 2009).
Southwood et al., (1998) propusieron un orden para ALH-DR con base a sus funciones
creando categorías funcionales, basándose en la habilidad para unir y presentar péptidos
antigénicos a las células T, influyendo en sus repertorios y teniendo por tanto una asociación con
la susceptibilidad o resistencia a varias enfermedades. Estos alelos fueron: DRB1*0101,
DRB1*0401, DRB1*0701, DRB5*0101, DRB1*0901, DRB1*1302 y DRB1*1501, que se
caracterizan por tener una superposición de repertorios de unión a péptidos. Como consecuencia
de esta superposición de repertorios de unión se dan los supermotivos de repertorios de secuencias
unión. Un ejemplo de un supermotivo es la superposición en el repertorio de unión del bolsillo 4
en los alelos: DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*0402, DRB1*0404, DRB1*0405, DRB1*1101,
DRB1*1201, DRB5*0101 y DRB1*1501(Ovsyannikova, Jacobson, Vierkant, Pankratz, & Poland,
2007). El mayor interés de estudiar estos alelos es que su distribución determina la susceptibilidad
o resistencia de una población, y se relaciona con la respuesta a tratamientos farmacológicos y a

45
estrategias de vacunación, por lo que este tipo de información es importante para el estudio de
enfermedades infecciosas.
Las moléculas de clase III.
CMH-III se encuentra en una región con 7 kilobases, siendo la región más densa del
genoma humano, aunque algunos de los genes codificados por esta no están relacionados con el
sistema inmune. CMH-III se enfoca principalmente en codificar componentes para el sistema
complemento (como los factores C y B), citosinas inflamatorias, factores de necrosis tumoral y
proteínas de shock térmico (Naik, 2003).

46
Figura 1. (A) Presentación de antígeno por parte del CMH-I a la izquierda y por parte del CMH-II a la derecha
(Parham, 2014). (B) Vista estructural de los perfiles estructurales para CMH-I y II (Cole, 2013).
Figura 2. Representación de la región genómica del antígeno leucocitario humano (ALH) (Stern & Calvo-Calle,
2009).

47
La Región de unión a péptidos (RUP)
Es la porción más expuesta de la región extracelular contiene la ranura que varía según la
clase de CMH, es la RUP, en la cual se pueden encontrar los bolsillos de unión con una
estereoquímica irregular formando bolsillos estructurales, que permiten acomodar los péptidos y
definir los patrones o motifs que tendrán la RUP (Rammensee, 1995; Stern et al., 1994). El nivel
de restricciones de estos bolsillos puede variar según el tipo de molécula CMH, denominando
aquellos más estrictos en sus requerimientos de enlace como anclajes primarios y aquellos más
flexibles como anclajes secundarios (Madden, 1995). A diferencia de CMH-I, en donde el péptido
suele estar limitado por un sitio de unión cerrado, en CMH-II la ranura es abierta, permitiendo
péptidos de longitud mucho mayor (Kaiser, 2017). Entonces, la longitud del péptido es de gran
importancia, debido a que el número de aminoácidos que flanquean el núcleo del péptido pueden
influenciar en su capacidad para enlazarse a la ranura y por tanto de ser reconocidos exitosamente
por las células T (Buus et al., 2015; O”Brien, Flower, & Feighery, 2008).
La RUP del CMH-I está conformada por los dominios polimórficos α1 y α2. Esta ranura
tiene dos puntos principales para el anclaje del péptido, como se ilustra en la figura 3 (Jensen et
al., 2018). En cambio, en el CMH-II las cadenas α y β forman juntas una ranura abierta, entre dos
hélices flanqueantes de la cadena α y un β piso hecho con láminas de la cadena β (Agudelo et al.,
2009). La cadena α usualmente facilita la formación del bolsillo más profundo de la ranura (P1),
en el cual se ha observado una mayor frecuencia de anclaje de aminoácidos como la tirosina (Tyr),
fenilalanina (Phe) y Leucina (Leu), en contraste con los demás bolsillos que al ser un poco más
superficiales, suelen tener aminoácidos pequeños o no cargados en las posiciones P4, P6, P7 y P9
(Stern & Calvo-Calle, 2009). A esta región se le conoce como el sitio de unión, y es el lugar donde
se liga el epítopo central, también llamado núcleo del péptido (figura 3), cuya orientación es el

48
terminal amino cerca al P1 y su terminal carbonilo cerca al P9, y es en donde se ligan los 9
aminoácidos requeridos para el anclaje del péptido en la ranura. Como se discutió previamente, el
propósito de realizar esta carga de antígeno es presentarlos a las células T. Si este antígeno logra
ser reconocido por dichas células y generar una respuesta inmune, este puede considerarse un
determinante antigénico o epítopo.
.
Figura 3. Comparación entre el perfil de bolsillos de CMH-I y CMH-II. (A) Bolsillos en CMH-I. (B) Bolsillos en
CMH-II. (C) Longitud de aminoácidos para CMH-I. (D) Longitud frecuente de aminoácidos para CMH-II (Cole,
2013).
Presentación y reconocimiento de antígeno.
Un epítopo, es un péptido parte de un antígeno, el cual al ser presentado al receptor de una
célula T (RCT) en contexto con CMH-I/II, genera una respuesta por parte del sistema adaptativo
inmune (Andreatta et al., 2015).

49
En el sistema inmune los epítopos son presentados de dos formas distintas, según el origen
del antígeno. Si el antígeno es de origen endógeno, el péptido será presentado por molécula CMH
clase I a un linfocito CD8+T, conocidos también como linfocitos citotóxicos, encargados de
neutralizar células infectadas por microorganismos intracelulares. Si es el antígeno es de origen
exógeno, será presentado por una molécula CMH clase II a un linfocito CD4+T, conocidos
también como linfocitos colaboradores o Th (T helper), los cuales ayudan a estimular la respuesta
inmunitaria activando otros inmunocitos, incluyendo a CD8+T (Neefjes et al., 2011). Los péptidos
presentados CMH-I son fragmentos proteicos encontrados en el citosol de las células, que pueden
ser de origen propio, viral, bacteriano como también tumoral (Janeway Jr et al., 2001). En cambio,
los péptidos presentados por las moléculas CMH-II son fragmentos proteicos de antígenos
exógenos previamente fagocitados y procesados por las células presentadoras de antígeno
profesionales, teniendo un papel crítico en la inmunidad adaptativa contra una gran diversidad de
patógenos (Neefjes et al., 2011). Por tanto, entender como los péptidos antigénicos son presentados
a CD4+T por parte de CMH es fundamental para entender como las células Th son activadas para
diferenciarse en células efectoras y llevar a cabo una respuesta inmune eficiente.
La importancia de ALH-DR en la inmunidad adaptativa
El polimorfismo genético tiene un impacto en la resistencia o susceptibilidad contra las
enfermedades (MacDonald et al., 2000; Traherne, 2008). Por esta razón el polimorfismo y patrón
de expresión del ALH-DR lo hace relevante en el estudio de enfermedades, afecciones
autoinmunes y cáncer (Cuzick et al., 2000; Traherne, 2008; Tsai & Santamaria, 2013). La malaria
es uno de los casos que mejor ilustra la importancia del polimorfismo en ALH, debido a que las
frecuencias de distintos alelos, principalmente de ALH-DRB1, tienen un impacto importante en

50
como los individuos o poblaciones reaccionan contra esta enfermedad (Lima-Junior & Pratt-
Riccio, 2016; Storti-Melo et al., 2010), siendo por tanto el CMH con mayor interés para desarrollo
de una vacuna contra este parasito.
Debido a esto, la similitud entre moléculas del CHM-DR ha sido considerada en el diseño
racional de vacunas contra la malaria, para que puedan ser reconocidas tanto en humanos como
por modelos animales para la enfermedad, como los monos Aotus (Patarroyo, Cifuentes,
Bermudez, & Patarroyo, 2008). Suárez et al., (2017) encontraron que existe una gran similitud
estructural y funcional entre los repertorios CMH-DR de Aotus con los humanos, sugiriendo que
las proteínas inductoras de protección inmune (IMPIPS) evaluadas en Aotus tienen un gran
potencial para ser usados en humanos para inducir una protección completa contra la malaria. Otras
enfermedades que ilustran como ALH-DR es relevante en el diseño de vacunas son: hepatitis B
(Nishida et al., 2018; Ovsyannikova et al., 2006), influenza (Alexander et al., 2010; Gelder et al.,
2002; Spies et al., 2015), enfermedades autoinmunes (Bottazzo, Hanafusa, Pujol-Borrell, &
Feldmann, 1983; Burmester et al., 2015; Q. Wang et al., 2016), sarampión, paperas y rubeola
(Ovsyannikova et al., 2006), Mycobacterium (Abu, Al-Attiyah, & others, 2003; Hajizadeh et al.,
2007; Mustafa, 2000) y cáncer: (Apple et al., 1994; Dunne et al., 2017; Shen, Wang, He, Wang,
& Zheng, 2014). Aunque el enfoque tradicional para el desarrollo de vacunas ha sido parcialmente
exitoso en algunos de estos casos, continúa siendo un proceso largo y técnicamente complicado,
razón por la cual se busca aplicar tecnología genómica para optimizar estos procesos de desarrollo.
Vacunología tradicional y vacunología reversa
Con el avance de tecnologías de secuenciación y computación se ha dado un incremento
considerable en la cantidad genomas secuenciados, debido a que el costo actual para secuenciar
un genoma bacteriano ha disminuido radicalmente en las últimas décadas, con costos desde 50
dólares por muestra (Modjarrad & Koff, 2016). A diferencia de la vacunología tradicional, la cual

51
depende en mayor medida de identificar que antígenos son expresados in-vitro o in-vivo, la
vacunología reversa (VR) permite identificar in sillico todos los genes codificadores de antígenos
presentes en un organismo patógeno, tomando como base a los marcos abiertos de lectura presentes
en su genoma. En adición esta estrategia tiene otras ventajas como son: estudiar el organismo sin
tener que cultivarlo, identificar antígenos cuya expresión no es posible in-vitro y la de encontrar
antígenos de expresión transitoria, los cuales pueden ser de vital importancia en el proceso de
descubrimiento de epítopos con potencial terapéutico (Modjarrad & Koff, 2016).
El desafío de la VR consiste en aislar y clonar todos los genes de un organismo infeccioso
y a partir de las proteínas codificadas por estos genes generar una librería o catálogo de antígenos
con la capacidad de generar una respuesta inmune. Estas proteínas deben ser previamente
ensayadas para seleccionar aquellas con la capacidad de estimular una respuesta inmune optima y
por tanto de inmunizar al huésped contra este agente infeccioso. Las proteínas o fragmentos
proteicos con la mejor respuesta inmune pueden ser utilizadas como vacunas independientes o
combinadas en una vacuna de subunidad, que son aquellas que utilizan únicamente partes muy
específicas del patógeno, dando como resultado una respuesta inmune muy fuerte contra dichas
partes. Por ejemplo, la vacuna de subunidad contra la malaria SPf66, desarrollada con métodos
clásicos de vacunología, tuvo una efectividad limitada debido a variaciones genéticas en diferentes
poblaciones humanas (D'alessandro et al., 1995). Sin embargo, recientemente con la secuenciación
de los genomas de Plasmodium (Oyola et al., 2016; Winter et al., 2015) ha sido posible identificar
in-silico epítopos de alta utilidad que no habían sido considerados previamente y que tienen
potencial para aumentar la eficacia de los métodos disponibles para diseñar vacunas de subunidad
contra la malaria, utilizando la metodología propuesta por la VR (Isea, Mayo-Garcia, & Restrepo,
2016).

52
Identificación de epítopos potenciales
El reconocimiento de un epítopo por parte de las células T es fundamental para dar inicio
a la respuesta inmune, más sin embargo este reconocimiento solo puede suceder cuando este es
presentado por un CMH (Burmester et al., 2015). La unión de un antígeno con el CMH depende
directamente de su afinidad con el receptor de esta molécula, lo cual está determinado por el
carácter químico y estructural de los aminoácidos que interactúan en la ranura de unión. En los
péptidos, las cadenas laterales de sus aminoácidos definen como estos interactúan con los bolsillos
del receptor, determinando de esta forma el nivel de afinidad con el que ciertas secuencias pueden
ser acomodadas en el sitio de unión.
Por ejemplo, las moléculas ALH-DR tienen dos bolsillos profundos (P1 y P9) que pueden
acomodar aminoácidos con cadenas laterales voluminosas y dos bolsillos someros (P4 y P6),
dictando esta configuración un patrón para el tipo de aminoácidos que deben tener los antígenos
de alta afinidad hacia estas moléculas (Hammer et al., 1993). Si esta unión del antígeno con el
CMH no lleva a cabo debido a una ausencia de afinidad o si esta unión se da con una afinidad
demasiado baja, no podrá haber una respuesta inmune contra el patógeno. Por esta razón, en la
selección de antígenos para vacunas es necesario elegir aquellos con mayor afinidad, ya que existe
una fuerte correlación entre la fuerza de unión de un péptido y su inmunogenicidad (Iwai et al.,
2003; Jensen et al., 2018). Las herramientas para la medición o predicción de esta afinidad en
pCMH se dividen respectivamente en métodos experimentales (in-vitro) y en métodos
computacionales (in-silico).

53
Métodos in-vitro para medir la afinidad de unión en CMH
La unión del péptido al CMH es un proceso clave en la presentación de antígenos y por
tanto en la selección de epítopos CD4+T y CD8+T, siendo la afinidad del enlace pCMH resultante
de importancia para determinar su capacidad inmunogénica (Paul et al., 2013).
Experimentalmente, la afinidad de enlace relativa de un complejo pCMH puede ser evaluada
directamente utilizando experimentos de competición, en los cuales la concentración del péptido
lleva a un 50% (CI50) de inhibición del péptido utilizado como marcador (Jojic, Reyes-Gomez,
Heckerman, Kadie, & Schueler-Furman, 2006).
Salvat, Moise, Bailey-Kellogg, & Griswold (2014), describen este tipo de ensayos en
cuatro pasos: 1) Enlazamiento: los péptidos objetivo compiten con los péptidos de control,
enlazándose a las proteínas CMH-II y realizando este procedimiento en un amplio rango de
concentraciones del péptido de prueba. 2) Captura: Una vez la reacción de enlace llega al punto
de equilibrio, los complejos péptido-CMH son separados enlazándolos con un anticuerpo, el resto
son lavados. 3) Detección: Los péptidos de control son medidos cuantitativamente utilizando
fluorescencia temporizada. 4) Análisis: Los datos espectroscópicos son procesados y analizados
para determinar la afinidad (figura 4). La realización de estos ensayos requiere de obtener
previamente las moléculas necesarias, como líneas celulares transfectadas expresando el CMH, el
cultivo de antígenos, el cultivo de anticuerpos relacionados, entre otras (Krogsgaard et al., 2000).
Sin embargo, estos ensayos experimentales para la predicción de CMH presentan grandes
obstáculos como herramienta para descubrir epítopos, ya que el CMH es una molécula
extremadamente polimórfica con más de 8700 variantes (Mariyana Atanasova et al., 2013),
teniendo cada una la capacidad de ligarse con hasta 2.048 × 1014
péptidos o más tan solo en CMH-
II, incrementando enormemente los costos (Degoot, Chirove, & Ndifon, 2018). Este problema se

54
ha intentado abordar con ensayos automatizados de alto rendimiento (Salvat et al., 2014), sin
embargo su aplicación al descubrimiento de epítopos puede resultar limitada por varios factores
(Lionta, Spyrou, K Vassilatis, & Cournia, 2014). Debido a esto, ahora es más común el uso de
métodos computacionales o métodos in-silico para la predicción de interacciones pCMH en la
determinación de antígenos que puedan inducir una respuesta inmune potente (Soria-Guerra,
Nieto-Gomez, Govea-Alonso, & Rosales-Mendoza, 2015), logrando reducir los costos y esfuerzos
experimentales hasta en un 85% (Dimitrov, Garnev, Flower, & Doytchinova, 2010).
Figura 4. Ensayo de competición de unión y determinación diferencial CI50 con marcadores lumínicos para CMH.

55
Métodos in-silico para predecir la afinidad de unión en CMH
La unión de péptidos antigénicos a las moléculas CMH y el reconocimiento de estos
ligandos por parte de los RCT es un paso esencial para la respuesta inmune, denominándose a los
péptidos que logran generar dicha respuesta epítopos. Si esta unión falla, no puede haber
reconocimiento ni respuesta inmune contra el antígeno. Por esta razón, la predicción de afinidades
de unión en pCMH es un objetivo tan importante de la inmunología (Wan et al., 2015). Los
métodos basados en secuencias son eficientes para realizar predicciones de afinidad en pCMH, sin
embargo, son muy dependientes en la disponibilidad de datos experimentales, los cuales pueden
escasear debido a la dificultad para realizar los ensayos, como sucede en el caso de pCMH-II. En
cambio, los métodos estructurales no dependen de datos experimentales para simular el proceso
de unión pCMH, precisando únicamente de datos CI50 validar sus resultados, a la vez que facilita
la observación de las interacciones moleculares antígeno-receptor, siendo un método ideal para
estudiar y predecir las interacciones pCMH-II en alelos con pocos datos experimentales.
Métodos basados en secuencias.
Son aquellos que desarrollan modelos predictivos con base en datos experimentales. Estos
métodos caen a su vez en dos categorías: de alelos específicos y pan específicos. En los primeros
un método es entrenado por cada molécula CMH individual y en los últimos un solo método puede
ser entrenado en datos con cobertura de múltiples moléculas CMH, siendo estos por lo general
más efectivos para la predicción de afinidades de unión. Sin embargo, estos métodos son muy
dependientes en la disponibilidad de datos experimentales, por lo que no es posible realizar
predicciones si no se cumple este requisito.
Estas dificultades han mejorado substancialmente debido al incremento en la cantidad de
datos experimentales disponibles en la IEDB, como también en la aplicación de algoritmos AM

56
que permiten realizar una captura de esta información experimental de una forma más efectiva.
Gracias a esto, los métodos basados en secuencias son ahora capaces de obtener predicciones de
unión mucho más precisas para moléculas ALH. En las últimas décadas estos métodos se han
desarrollado varias herramientas utilizando este paradigma, siendo algunas de las más relevantes:
TEPITOPE.
Este paquete de software que incorpora perfiles de bolsillos con una matriz de datos para
la predicción de pALH (Sturniolo et al., 1999). Este algoritmo es utilizado para predecir epítopos
en el ALH-DR, tanto promiscuos como específicos. Este programa examino nonameros enlazados
a los alelos ALH-DR seleccionados y trans múltiples escaneos sobre la secuencia proteica es
posible identificar regios o secuencias promiscuas. Los frames peptídicos potenciales son
seleccionados con base a un análisis cuantitativo de las múltiples cadenas de afinidad a los alelos
de ALH-DR, determinando de esta manera que epítopos pueden tener un potencial terapéutico.
TEPITOPEpan.
Este método es una extensión del original para aplicarlo a la predicción de unión en más
alelos. Se aplica extrapolando las especificidades de 35 vectores de especificidad de unión
obtenidos experimentalmente de 11 alelos ALH-DR en TEPITOPE, extrapolando estos datos a
aquellos alelos que no están caracterizados (Lianming Zhang et al., 2012). La similitud de bolsillos
entre estas dos moléculas es calculada con base a su similitud de secuencia, computando la
especificidad de unión en un alelo sin caracterizar como el promedio pesado en las especificidades
de unión tomando como base los alelos caracterizados por TEPITOPE.

57
Alineamiento SMM.
El método de alineamiento con matriz de estabilización (en inglés Stabilization Matrix
Alignment Method), está basado en matrices de estabilización que buscan identificar afinidades
pCMH a través de una matriz de pesos, la cual reproduce óptimamente los valores CI50 por cada
péptido en el grupo de entrenamiento (Nielsen, Lundegaard, & Lund, 2007). La predicción tiene
como base un conjunto compuesto por 14 alelos humanos ALH-DR y 3 alelos de ratón H2-IA,
demostrándose que es superior en su capacidad predictiva a métodos como TEPITOPE,
SVRCMH, CMHpred.
NetCMHII.
Este es un método el cual intenta predecir péptidos de unión para 25 alelos de ALH-DR,
20 alelos de ALH-DQ ,9 alelos de ALH-DP y 7 alelos de ratón., utilizando redes neurales
artificiales entrenadas con 100,000 datos de unión pALH extraídos de IEDB (Nielsen, Lundegaard,
Blicher, et al., 2007).
NetCMHIIpan.
Una extensión del anterior. La mayor diferencia entre estos dos es que NetCMHII puede
predecir afinidades de unión únicamente para las moléculas ALH para las que ha sido entrenado,
mientras que NetCMHIIpan puede predecir afinidades de unión para cualquier molécula ALH, tan
solo conociendo la secuencia proteica (Karosiene et al., 2013). La versión 3.2 está enfocada en la
predicción de pALH-II, siendo entrenado con más de 50,000 datos de unión para ALH-DR/DP/DQ
(Jensen et al., 2018).

Cesar david puentes florez union de peptidos al complejo mayor de histocompatibilidad

Cesar david puentes florez union de peptidos al complejo mayor de histocompatibilidad

Recomendados

Recomendados

Más contenido relacionado

Último

Último (20)

Destacado

Destacado (20)

Cesar david puentes florez union de peptidos al complejo mayor de histocompatibilidad