Arquitectura molecular y celular en la nutricion del aguacate (persea americana)

1. Arquitectura Celular y
Arquitectura Molecular
como nuevos paradígmas en
nutrición vegetal del Aguacate
(Persea americana Mill, variedad Hass )
Dr. Luis Alberto Lightbourn Rojas

2. Abstract
Según el Modelo Bioquimico Lightbourn, la eficiencia y eficacia en la asimilación
de los nutrientes aportados por las moléculas usadas para alimentar las plantas
responde directamente a su arquitectura femtológica, la cual es determinada y
determinante por la arquitectura nanológica de la membrana celular.
2

3. Introducción
El desarrollo de medios matemáticos para penetrar en Espacios de Riemann
permite conocer los niveles enantiomórficos y las distribuciones energéticas de
enlace para diseñar moléculas específicas que tengan como característica
fundamental su acoplamiento transitivo a través de los canales iónicos de la
membrana celular, lo que marca una nueva era en el diseño de moléculas que no
solo penetren eficientemente por las capas fosfolipídicas de las membranas
celulares sino que además sinergicen en tiempo y forma con rutas metabólicas
especifícas que son las responsables directas del metabolismo primario y
secundario.
3

4. Desarrollo
Teniendo como base las perspectivas topológicas de la Ingeniería Metabólica
Lightbourn y los balances energéticos entrópico-entálpicos de los procesos
anabólicos, podemos hacer la enantiomorfía propia para que las moléculas que
aporten tanto nutrientes estructurales como funcionales tengan la topología idónea
de acuerdo a los fenómenos de transferencia de calor y al determinar las energías
libres y los moméntums específicos para cada isomería geométrica de las rutas
metabólicas intraestructurales de acoplamiento e impulso, podemos optimizar la
transferencia de energía intracelular, tanto en moméntum de masa como de
polaridad y polarizabilidad de enlaces sinérgicos. Esto es en pocas palabras diseñar
moléculas específicas de acuerdo a la estructura de la membrana celular. Este
Nuevo paradígma marca un salto cuántico con respecto a lo tradicional que se
maneja en la alimentación de las plantas en cuanto a las formas salinas de aporte de
nutriente, las cuales no son diseñadas en base a sus funciones homológicas y
cohomológicas, sino simplemente se manipulan para hacerlas mas “solubles” en
agua, sin importar la enantiomorfía específica que las hará penetrar o no a la célula.
Éste es hasta hoy día el estado actual de la nutrición tradicional.
4

5. Pasos fundamentales del diseño arquitectónico
Nano - Femto
5
Trazabilidad Exo- Endógena del Nutriente
Producción de la Molécula
Diseño de la Molécula
Ingeniería Metabólica
Consideraciones Termodinámicas y
Estereoquímicas
Estudio Topológico de la Membrana Celular
Economía: Energética, de Recursos y de Bajo
Impacto Ambiental
Resultados Confiablemente Cuantificables
Resultados Precisamente Proyectables
Programa de Nutrición Ad Hoc
Glycobiología Correlacional
Una Nueva Forma de Interpretar los Análisis
de Suelo, Agua y Planta

6. Lipogénesis y Síntesis de Lípidos Complejos
6

7. Características del mesocarpio del fruto del Aguacate
(Persea americana Mill.)
Mesocarpio
 Contenido de lípidos (hasta un 30% de la pulpa)
 Diferenciación de carbohidratos
La formación de lípidos depende:
Carbohidratos → acetato → ácidos grasos
ácidos grasos + glicerol = lípidos complejos
7

8. Esquema para la conversión de los hidratos de carbono a los lípidos complejos por los
cortes de tejido del mesocarpio de la fruta del aguacate Hass en desarrollo.
G-6-P 6PGA CO₂
NADPH NADPH
Pentosa fosfatoF-6-P
PiATP
F-1 , 6-P
T-3-PDHAPGlicerol
ATP
Glicerol-P
NADPH NADH
3-PGA
PEP
ATP
OAA
NADH
MalatoPiruvato
CO₂
NADPH
CitratoAcetilo-CoA
Isocitrato
NADPH
CO₂
A-Cetoglutarato
CO₂
Succinato
Fumarato
Malato
OAA
Ácido de grasa
NADPH
CO₂CO₂
Glucosa
Monoglicerol
Diglicerol
Triglicerol
Ácido lisofosfatídico
Ácido fosfático
Ácidos grasos- CoA

9. Sin embargo se carece de información acerca de la
lipogénesis del fruto del aguacate
Fuentes de:
 Glicerol
 Acetil CoA
 NADPH
Y su relación
con la síntesis de
Triglicéridos
Glicolípidos
Fosofolípidos
Ácido graso
Grupo fosfato
Glicerol
Serina
Carbohidrato
Glicerol
Ácido graso

10. Síntesis de glicéridos en aguacate
Glicerol -3-fosfato Ácido lisofosfatídico Ácido fosfatídico
Diacilglicerol
Triglicerol
Microsomas aislados del mesocarpio de aguacate parecen sintetizar glicéridos vía
una ruta similar a la del sistema de tejido animal, llamada ruta Kennedy
Ruta Kennedy
←Fracción
mitocondrial
Microsoma →
Centrifugación a
10 000 g
La adición de la fracción de
sobrenadante a la fracción
mitocondrial tiene un poco de
efecto en la incorporación de
glicerol a lípidos

11. Antecedentes
Barron and Stumpf (1962)
Síntesis de los tiglicéridos: Glicerofosfato → Fosfolípidos → Monoglicéridos →
Diglicéridos → Triglicéridos
Señalaron que el origen de los monoglicéridos permanecía en cuestión , a pesar de
que concluyeron que los monoglicéridos podrían surgir del ácido lisofosfatídico
por una remoción hidrolítica de un fosfato inorgánico.
Bradbeer and Stumpf (1960)
Encontraron que la mitocondria del maní incorporó P32 de ATP32
predominantemente en ácido fosfatídico junto con una pequeña incorporación en
fosfatidil etanolamina. Esta incorporación no involucró glicerofosfato como
intermediario pero resultó de una fosforilación de 1,2-diglicérido por ATP. Este
diglicérido fosfoquinasa también fosforilado 1-monoglicéridopara producir ácido
lisofosfatídico.
11

12. Papel del ácido fosfatídico en la síntesis de
fosfolípidos y triglicéridos
Existen 2 principales rutas por las cuales el ácido fosfatídico es matabolizado en los
organismos vivos:
1. La formación de CDP-diglicéridos por interacción con CTP
2. La remoción hidrolítica de una fosfato inorgánico con la formación de
diglicéridos, un precursor común de triglicéridos y fosfolípidos
Brades and Shapiro (1967)
Reportaron que el ácido fosfatídico fosfatasa fue inhibida por palmitol CoA. Esta inhibición es
competitiva con respecto al ácido fosfatídico.
Cheniae (1965)
Examinaron la incorporación de glicerofosfato en lípidos con el extracto de microsomas de
espinacas. Los estudios cinéticos de los productos indicaron que el ácido fosfatídico fue un
precursor para triglicéridos. Y que la ocurrencia de monoglicéridos resultó de otro fosfolípido ,
probablemente ácido lisofosfatídico.
12

13. Se utilizaron frutos de Persea americana MILL.
Variedad Hass
Corte y selección del
tejido de mesocarpio
de cada fruto
Infiltración del tejido con
sustrato radioactivo en
buffer de bicarbonato de
potasio 0.05 M
Enjuague de las
piezas con buffer de
bicarbonato de
potasio no
radioactivo
Secado con
papel filtro
Las piezas se colocaron
sobre una red de acero
inoxidable con una tela
de queso encima dentro
de un frasco a 25 °C
Hackett (1953)
Infiltración al vacío de
glucosa o acetato
13

14. Aislamiento de lípidos
Cromatografía de gases
Químicos
Acetato-1-C14, Glucosa-1-C14,Glucosa-6-
C14,Glucosa-U-C14, CoA, ATP, NAD,
NADP
Estimación de la
participación vía catabólica
100 cortes de tejido de mesocarpio
infiltrados con
Glucosa-1-C14 y/o Glucosa 6-C14
específicamente marcadas
Estimación de la proporción
Acil-C14 y glicerol C14
Acidificación y separación de la
mitad del glicerol acuosos y la
mitad del acil
Preparación de las partículas
citoplámicas
Homogenización con sucrosa 0.4 M
y centrifugaciones
Ensayos con enzimas
NADPH con actividad dehidrogenasa dependiente
NADPH con actividad ácido graso sintetasa
dehidrogenasa dependiente
Determinación de proteína
Digestión con Micro-Kjeldahl
Determinación de
radioactividad
Contador de impulsos Compumatic II
Estrategia Experimental

15. Porcentaje de incorporación de la glucosa uniformemente
marcada en dioxido de carbono respirable, lípidos y
ácidos solubles por los cortes de tejido del fruto de
aguacate Hass
Aproximadamente el 50 % del total de
los carbonos marcados fueron
acumulados en lípidos y el 30 % de
esto fue en dióxido de carbono
respiratorio después de 6 h de
incubación. Los residuos fueron en
alcohol soluble y fracciones insolubles.
Ácidos solubles
Glucosa
Lípidos
CO2
1 2 3 4 5 6
Tiempo
(horas)
10
20
30
40
50
60
0
PorcentajededistribucióndelC14
15

16. Cambios en la distribución del marcaje en lípidos
sintetizados a partir de glucosa-U-C14 y la relación acilo
graso/glicerilo
 Del total de los carbonos marcados:
4 % estuvo en la fracción glicerilo
46 % estuvo en la fracción acilo graso
La relación acilo graso-C14 a glicerilo-C14 fue
inicialmente baja, pero más tarde incrementó
arriba de 11.3 donde la glucosa-U-C14 fue
utilizada
 El valor de 11.3 muestra el completo marcaje
de diglicérido o ácido fosfatídico que aparece en
los cortes de tejido donde la relación falla
mostrando su máxima expectación de 17 incluso
después de las 16 h de incubación
10
20
30
40
PorcentajededistribucióndelC14
1 2 3 4 5 6
Tiempo
(horas)
0 0
2
4
6
8
10
12
Proporcióndeacilograso-C14/Glicerilo-C14
Proporción
Glicerilo-C14
Acilo graso-C14
16

17. Distribución de marcaje en lípidos sintetizados a partir de glucosa marcada
uniformemente por las piezas de tejido de aguacate Hass después de 4 h de
incubación
Lípidos Distribución %
Proporción de acilo graso/glicerilo
Observado Teórico
Triglicérido 45.6 15.9 16.0-18.0
Diglicérido 14.1 11.7 10.7-12.0
Monoglicérido 12.1 5.8 5.3-6.0
Glicolípido 12.1 8.2 2.2-4.0
Ácido fosfatídico 4.3 3.1 10.7-12.0
Fosfatidil glicerol 1.9 1.5 5.3-6.0
Fosfatidil etanolamina 1.8 6.7 9.4-7.2
Fosfatidil inositol 0.7 1.9 3.5-4.2
Fosfatidil colina 7.4 10 4.6-4.5
Los radios para lípidos neutrales están relacionados a los valores teóricos pero
aquellos para fosfolípidos indican la multiplicidad de su metabolismo
17

18. La evolución de C14O2 de la
glucosa-1-C14 y glucosa-6-C14
indican la participación de la
ruta pentosa fosfato oxidativa en
los cortes de tejido.
Sin embargo, la proporción C-1 y
C-6 no pueden aproximar una
medida de la participación de la
ruta pentosa fosfato en el tejido
de manera que la síntesis de
lípidos fue de mayor interés en
el metabolismo del tejido.
Incorporación de la glucosa-1-C14 específicamente marcada y la
glucosa-6-C14 de igual radioactividad específica por los cortes de tejido
de aguacate Hass
Glucosa-1-C14
Glucosa-6-C14
CO2
Ácido graso
Ácido graso
Ácido soluble
CO2
Glicerol
Glicerol
Ácido soluble
IncorporaciondeC14,cmp/gFW
2,000
1,000
0 30 60 120 240 30 60 120 240
Tiempo (min)
3,000
18

19. Niveles relativos de actividad de la enzima en el mesocarpio de
aguacate
Actividad
total
Requerimiento
Experimento I: fracción particulada
Enzima málica 65 NADP+, Mn++
NADPH: glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa 140 NADP+, Mn++
NADPH: isocitrato deshidrogenasa 220 NADP+, Mn++
NADH : isocitrato deshidrogenasa 130 NAD+, Mn++
Experimento II: sobrenadante
Enzima málica 1,425 NADP+, Mn++
NADPH: glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa 3,337 NADP+, ?
NADPH: isocitrato deshidrogenasa 3,600 NADP+, ?
NADH : isocitrato deshidrogenasa 0
Experimento III: NADPH: isocitrato deshidrogenasa
Sobrenadante después de 10 000 g 4,300 NADP+, ?
Sobrenadante después de lavado 218 NADP+, Mn++
Fracción particulada después de lavado 84 NADP+, Mn++
19

20. Participación relativa de los niveles de actividad enzimática que ayudan a
la asimilación de acetato por el sistema particulado aislado del mesocarpio
del futo del aguacate
Incorporación de acetato
Sustrato Lípidos cpm Ácidos solubles en agua cpm
Experimento I
Isocitrato 2,054 3,489
Malato 1,608 4,114
Glucosa-6-fosfato 1,582 4,560
Ninguno - 6,300
Experimento II
Isocitrato 2,249 4,876
Malato 1,716 5,529
Glucosa-6-fosfato 1,578 5,036
Ninguno 701 7,400
20

21. El marcaje de la glucosa-6-C14 fue
metabolizado por formas de la
ruta de la pentosa fosfato
oxidativa y de la ruta glicolítica
sin pérdida del marcaje, y podría
llegar a ser eventualmente un
equilibrio entre las 2 triosas, las
cuales mostraron un estado de
incorporación estable del marcaje
en la fracción lípídica de los cortes
de tejido.
Incorporación de la glucosa-6-C14 en los ácidos grasos de clases de
lípidos por los cortes de tejido del fruto del aguacateIncorporaciondeC14,cmp/gFW
Tiempo (min)
21

22. La proporción de acilo graso-C14
a glicerilo-C14 de las clases de
lípidos ha sido trazado contra el
tiempo de incubación. Este valor
indica la síntesis de novo de los
lípidos complejos
Cambios en las proporciones de acilo graso-C14/glicerilo-C14 de
glucosa-6-C14 por los cortes de tejido del mesocarpio del fruto del
aguacate
Tiempo (min)
Proporcióndeacilograso-C14/glicerilo-C14
22

23. La radioactividad específica
de las fracciones de acilo
graso en las clases de lípidos
indican que todas las
fracciones de fosfolípidos son
diluidas en tiempo por los
ácidos grasos no marcados
Radioactividad específica de los ácidos grasos en clases de lípidos
sintetizados de glucosa-6-C14 por los cortes de tejido del fruto del
aguacate Hass
Tiempo (min)
Radioactividadespecífica
cpm/mmolácidograso
23

24. De la observación de los 3 gráficos anteriores se puede
considerar las siguientes posibilidades
1. Hay un lisofosfolípido metabólicamente lábil
2. Se produjo una acilación directa de lisofosfolípido
3. Las fracciones de acilo graso fueron intercambiadas con los otros
fosfolípidos que no habían sido marcados y viceversa
4. Se produjo una síntesis de novo de fosfolípidos. La multiplicidad en la
formación de fosfolípidos puede ser debido a la incorporación de un ácido
graso diferente en la posición específica de cada tipo de fosfolípidos
24

25. • Análisis de la composición normal de ácidos grasos de lípidos
• Porcentaje de distribución de los ácidos grasos marcados en las clases de
lípidos complejos y su composición normal de ácidos grasos
• La radioactividad específica de los ácidos grasos en clases de lípidos
sintetizados a partir de Glucosa-6-C14
 Estos estudios mostraron que los ácidos palmitoléico, linoléico, linolénico y
araquídico fueron los ácidos grasos menos marcados entre los examinados.
 Por otro lado, los ácidos palmítico y oléico en monoglicérido, diglicérido y ácido
fosfatídico fueron rápidamente marcados.
 El ácido esteárico fue sintetizado casi tan rápido como los ácidos palmítico y oléico
después de la infiltración al vacío del acetato, debido a la anaerobiosis.
Estudios en el tiempo de la síntesis de ácidos grasos a
partir de acetato-1-C14
25

26. La transformación de NADH a NADPH en un sistema biológico dado permanece aún
incierta, a pesar de que NADH es equivalente a NADPH sobre la base de energéticos
biológicos, en que la transformación de NADH a NADPH por la mitocondria requiere
ATP. La síntesis de ácidos grasos por un sistema mitocondrial, el 50 % del total de
NADPH requerido puede ser remplazado por NADH.
Contrario al sistema mitocondrial, la síntesis de ácidos grasos, especialmente la
síntesis de ácido palmítico en aguacate, parece ser el más apropiado del sistema de
la enzima soluble y toma una ruta avidina sensible. Así el sistema de generación
de NADPH es importante para elucidar el proceso metabólico de lipogénesis
en la fracción soluble en el tejido de mesocarpio del aguacate.
26

27. La participación de 3 sistemas de generación de NADPH
se predijeron de los experimentos in vitro
1. NADPH: glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
2. NADPH: isocitrato deshidrogenasa
3. Enzima málica o NADPH: malato deshidrogenasa
Todos ellos facilitan NADPH para la síntesis de lípidos del aguacate. Es evidente
que el metabolismo de los ácidos orgánicos en el tejido también regulan la
lipogénesis en plantas
27

28. En plantas, la tasa de utilización de NADPH es un factor primario
para el control de la participación de la ruta de la pentosa fosfato
oxidativa
 La liberación de C14O2 de glucosa-1-C14 y glucosa-6-C14 indica la presencia
de la ruta de la pentosa fosfato oxidativa en los cortes de tejido
 Desde que el marcaje de C-1 de la glucosa fue incorporado en los lípidos del
fruto del aguacate, el uso de la relación glucosa-1-C14/glucosa-6-C14
errónea como una medida de la participación de esta ruta
28

29. La relativa participación de la ruta de la pentosa fosfato
oxidativa apoyando la síntesis de lípidos como un donador
de NADPH puede ser estimada de la siguiente manera:
1. Un mol de C14O2 producido por la vía de la descarboxilación de 6-
fosfogluconato (G1(CO2) – G6(CO2)) puede proveer 2 moles de NADPH los
cuales pueden ser equilibrados para la asimilación de un mol de acetil CoA
en ácido graso.
2. El total de ácidos grasos sintetizados durante el período podría ser la
cantidad total de C14 encontrada en las fracciones acilo graso de C-1 y C6 de
glucosa .
La relativa participación de la ruta de la pentosa fosfato oxidativa apoyando
la síntesis de lípidos (GNADPH) se define como:
GNADPH =    
   
1 02 6 2
1 6
C CO
acilo acilo
G G
G G


29

30. Posible proceso de conversión de carbohidratos a lípidos
complejos en el fruto de aguacate en desarrollo
El 50 % de la glucosa metabolizada se acumula en lípidos cuya síntesis
puede ser regulada por la disponibilidad de glicerofosfato, en los cuales un
acilo graso CoA se acumula. De esta manera, el ácido fosfatídico formado a
partir de glucosa por los cortes de tejido, actúa como un precursor para
triglicéridos y fosfolípidos en plantas.
Es conveniente discutir la síntesis de triglicéridos y fosfolípidos juntos
porque su síntesis está estrechamente relacionada a través de un
intermediario común, D-α, β-diglicérido y L-α, β-ácido fosfatídico.
30

31. La síntesis de ácido oléico en aguacate fue un modo predominante de
acumulación de lípidos durante el desarrollo del fruto, y el fruto almacenó
exclusivamente triglicéridos.
Desde que la concentración de ácido palmítico y ácidos grasos insaturados
en los triglicéridos y monoglicéridos indicaron la relación precursor-
producto, esto sugiere que los triglicéridos fueron sintetizados de
monoglicéridos con la incorporación de un ácido graso insaturado.
Mientras que el ácido graso en diglicéridos, ácido fosfatídico y otros
fosfolípidos fue altamente insaturado, es dificil sugerir una ruta de
monoglicéridos.
31

32. Resumen
Estudios sobre el metabolismo de los lípidos relativo a la lipogenésis a partir de
glucosa y la síntesis de lípidos complejos en el fruto de aguacate, Persea americana
Mill., fue realizado para elucidar la rutas de degradación de la glucosa seguido por la
síntesis de fosfolípidos y triglicéridos.
En los cortes de tejido de mesocarpio del fruto de aguacate en desarrollo, en el cual
predominó la acumulación de lípidos, aproximadamente el 50 % del total de la
glucosa aplicada fue convertido a lípidos, donde el 83.9 % de los lípidos marcados
fueron los lípidos neutrales.
Se determinó la participación de la ruta de la pentosa fosfato oxidativa,
aproximadamente el 30 % de la glucosa metabolizada por la rutas catabólicas fue
directamente oxidada para liberar dióxido de carbono y proveer el 50 % del total del
poder reductor responsable de la síntesis de ácidos grasos.
32

33. Mientras que el C-1 de glucosa se incorporó en las fracciones de glicerilo, el C-6 de
glucosa se incorporó en las fracciones de acilo graso de lípidos complejos en los
cortes de tejido del fruto de aguacate en desarrollo.
El NADPH producido por la enzima málica y el isocitrato deshidrogenasa soluble
podría también participar en la síntesis de ácidos grasos por el sistema aislado del
mesocarpio.
Las conclusiones de la síntesis de lípidos de que puede haber 2 rutas de ácido
lisofosfatídico, vía ácido fosfatídico a diglicérido y fosfolípido, y vía monoglicérido a
triglicérido por la esterificación de ácidos grasos insaturados , estuvieron basadas en
el análisis de experimentos trazados con glucosa-C14 y acetato-C14 por los cortes de
tejido de mesocarpio del fruto de aguacate.
Resumen
33

34. 34

35. Aguacate Persea
americana,
Almacenado a 5 °C por
24 h
MaterialdelaPlanta1
Cortes de 10.4 mm de
diámetro por 1 mm de
espesor del mesocarpio del
aguacate
Preparación de Muestra2
Infiltración de los cortes
con glucosa marcada
con 14C
Marcajecon 14C3
Concentración de CO2
Extracción de lípidos
con cloroformo-metanol
Determinaciones4
Análisis de la actividad
enzimática durante la síntesis de
lípidos
Partículas Citoplasmáticas5
35

36. Porcentaje de incorporación de glucosa marcada en dióxido de
carbono respiratorio y en lípidos del tejido del fruto de aguacate Hassa
Tiempo (min) Incorporación del marcado (%) Proporción ácido graso/Glicerilo
CO2 Lípidos
15 7.5 1.5 1.8
30 12.7 2.9 2.0
60 17.8 6.4 2.3
120 22.5 13.5 3.4
180 25.2 28.8 7.5
240 27.1 38.1 11.1
360 30.0 50.1 11.3
a198,000 cpm de glucosa-U-14C fueron infiltrados por cada gramo de tejido. El CO2, lípidos y los
residuos solubles e insolubles en agua fueron medidos en secuencia acumulativa. Los lípidos
fueron saponificados para separar el glicerilo y el ácido graso.
36

37. Distribución del marcado en lípidos sintetizados a partir de
glucosa uniformemente marcada en el tejido de fruto de
aguacate Hass, después de cuatro horas de incubación
Lípidos Distribución
(%)
Proporción ácido graso/Glicerilo
Observada Teórica
Triglicéridos 45.6 15.9 16.0-18.0
Diglicéridos 14.1 11.7 10.7-12.0
Monoglicéridos 12.1 5.8 5.3-6.0
Glicolípidos 12.1 8.2 2.2-4.0
Ácido fosfatídico 4.3 3.1 10.7-12.0
Fosfatidil glicerol 1.9 1.5 5.3-6.0
Fosfatidil etanolamina 1.8 6.7 6.4-7.2
Fosfatidil inositol 0.7 1.9 3.5-4.2
Fosfatidil colina 7.4 10.0 4.0-4.5
aLos lípidos extraídos fueron separados por cromatografía en columna y saponificados para medir la
proporción de ácido graso y glicerilo. El ácido graso representa a los ácidos grasos C16 y C18, y el
gicerilo incluye a el glicerol, etanolamina, inositol y colina.
37

38. Metabolismo de la glucosa específicamente marcada en el tejido del
mesocarpio del aguacate Hass
Tiempo (min) 30 60 120
Marcado
C-1 C-6 C-1 C-6 C-1 C-6
cpm cpm cpm cpm cpm cpm
14CO2 326 54 645 114 1582 332
Lípidos 526 505 893 879 1716 1890
Glicerilo 365 189 522 203 911 268
Ácidos grasos 161 316 371 676 805 1622
Ácidos c 51 81 127 171 270 498
C-6/C-1d 0.166 0.176 0.210
Gp 0.301 0.304 0.350
GNADPH 0.570 0.508 0.515
a33,300 cpm de glucosa fueron infiltrados por gramo tejido. El CO2, lípidos y ácidos solubles en agua fueron
medidos en secuencia acumulativa. bLos lípidos fueron saponificados y separados en glicerilo y ácidos grasos. cLos
ácidos representan la fracción soluble en agua. Las fracciones fueron secadas y extraídas con acetona para eliminar
los residuos de glucosa. dC-6/C-1: CO2 de la glucosa-6-14C/CO2 de glucosa-1-14C. Gp: Participación relativa de la vía de
la pentosa fosfato. GNADPH: Participación relativa de la vía de la pentosa fosfato manteniendo la síntesis de ácidos
grasos.
38

39. PA
TGMG
DG200
400
600
800
30 60 120 240
Tiempo, min
Incorporaciónde14C,cpm
Incorporación de glucosa-6-14C en
los residuos de ácidos grasos de los
lípidos de los tejidos de mesocarpio
de aguacate. Un μmol de glucosa-6-
14C (37,000 cpm/μmol) fue
infiltrado en 1 gramo de tejido. La
incorporación de 14C en los lípidos
fue medida en secuencia
acumulativa. Los lípidos fueron
separados por cromatografía en
columna de ácido silícico y
saponificación para separar las
fracciones de glicerilo y ácido graso
.
TG: Triglicéridos, DG: Diglicéridos,
MG: Monoglicéridos, PA: Ácido
fosfatídico.
39

40. Proporcióndeácidograso-14C/glicerilo-14C
TG
DG
PA
MG
1
Tiempo, min
2
3
4
5
6
7
8
30 60 120 240
Cambios en la proporción de
acilo graso-14C de glicerilo a
lípidos sintetizados a partir de la
glucosa-6-14C del tejido del
aguacate.
TG: Triglicéridos,
DG: Diglicéridos,
MG: Monoglicéridos,
PA: Ácido fosfatídico.
40

41. PA
PE PG
PC
PI
TG
30 60 120 2400
5
10
15
20
25
Radioactividadespecífica,
cpmx10-3/mmolácidograso
Tiempo, min
Radioactividad específica
de ácidos grasos en los
lípidos sintetizados a partir
de glucosa-6-14C de tejido
de aguacate. La
radioactividad específica
fue determinada por
titulación de ácidos grasos
con NaOH 0.01 N en
solución alcoholica seguido
de 14C continuo.
PA: ácido fosfatídico,
PC: Fosfatidil colina,
PE: Fosfatidil etanolamina,
PG: Fosfatidil glicerol,
PI: Fosfatidil inositol.
41

42. Los niveles relativos de la actividad de la enzima en homogenizado del
mesocarpio del aguacate
Actividad totala Requerimiento
Experimento I
Fracción particulada
Enzima málica 65 NADP+, Mn++
NADPH: Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 140 NADP+, Mn++
NADPH: Isocitrato deshidrogenasa 220 NADP+, Mn++
Sobrenadante
Enzima málica 1425 NADP+, Mn++
NADPH: Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 3337 NADP+, ?
NADPH: Isocitrato deshidrogenasa 3600 NADP+, ?
42

43. Los niveles relativos de la actividad de la enzima en homogenizado del
mesocarpio del aguacate
Actividad totala Requerimiento
Experimento II
NADPH: Isocitrato deshidrogenasa
Sobrenadante después de 10, 000 X g 4300 NADP+, ?
Sobrenadante después de lavado 218 NADP+, Mn++
Fracción particulada después de lavado 84 NADP+, Mn++
NADPH: Isocitrato deshidrogenasa
Sobrenadante después de 10, 000 X g 0
Sobrenadante después de lavado 0
Fracción particulada después de lavado 130 NAD+, Mn++
43

44. 1) El tejido de los frutos de aguacate en desarrollo acumulan lípidos
en el mesocarpio, y muestran la participación de la vía de la
pentosa fosfato en la síntesis de lípidos aportando un 50% del
requerimiento de NADPH:malato deshidrogenasa
y NADPH:isocitrato deshidrogenasa.
2) Además, la participación de la vía de la pentosa fosfato fue de
aproximadamente el 30%. La rápida eliminación de la
dihidroxiacetona fosfato de la secuencia glucolítica fue un factor
dominante para la esterificación de ácidos grasos en la síntesis de
lípidos de novo. De esta manera, el ácido fosfatídico formado a
partir de la glucosa en los tejidos del mesocarpío actúa como
precursor de glicéridos y fosfogliceridos.
44

45. 3) Es probable que la presencia de ácido fosfatídico en el tejido se
deba a la inactivación de la lipasa D durante los procedimientos
de aislamientos.
45

46. 1) Aproximadamente el 30% de la glucosa metabolizada por rutas
catabólicas, es directamente oxidada hasta dióxido de carbono, y
el 50% del total es destinada a la síntesis de ácidos grasos.
2) El carbono número 1 de la glucosa es incorporado en la estructura
del glicerilo, mientras que el carbono número 6 es incorporado
en ácidos grasos del tejido del fruto en desarrollo.
3) .Además de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, la enzima málica
y la isocitrato deshidrogenasa participan en el abastecimiento de
NADPH2, para la síntesis de ácidos grasos del mesocarpio del
fruto de aguacate.
46

47. Anteriormente los modelos de NADH eran diseñados de
acuerdo a tres aspectos:
1
• Controlando la estereoselectividad cambiando
el sustituyente del dihidronicotinamida con miras a formar
una cadena lateral alejada esteáricamente-exigente.
Pero el dihidronicotinamida necesita ser modificado significativamente
por introducción de grandes auxiliares quirales, un complicado anillo o
por cambio del grupo amina por un grupo sulfinil quiral.
2
• Incorporando un sustituyente a la reacción central,
la posición C4 del anillo dihidropiridina.
3
• Diseñar la conformación especifica para obtener alta
estereoselectividad.
Sufre de perdida de quiralidad en la posición C4 durante el curso del
modelo de la reacción de reducción.
47

48. METODOLOGIA
Ensayo 1
C2H5OH, H2SO4
1,3,5-Tris(bromometil)benzeno,
CH3OH, reflujo, 45%
2 3
4
Na2S2O4, Na2CO3, H2O,
temperatura ambiente, 26%;
5
2. Ácido 3,5-piridinadicarboxilico; 3. 3,5-dietoxicarbonilpiridina;
4. Grupo fenil 1,3,5-trimetileno (+) estabilización del grupo
metileno y remoción de Br en metileno.

49. 6
1. NaOH, H2O, temperatura
ambiente, 5 h; 2. SOCl2, reflujo 8 h
(1R,2R)-Diaminocyclohexane,
THF, temperatura ambiente,12 h
NADH
6. Sustitución del grupo etileno por Cl, ciclación de la
molecula para la obtencion del modelo de 1 NADH

50. Ensayo 2
Pentafluorofenol, DMF,
temperatura ambiente, 6 h, 92%
2
8
7
1,3,5-Tis(bromometil)benzeno,
DMF, 85 ºC, 12 h, 35%
(1R,2R)-Diaminociclohexane, THF,
temperatura ambiente, 4 h, 21%
2. Ácido 3,5-piridinadicarboxilico;
7. Conjugación de grupos etileno con pentafluorofenol;
8. remoción de pentafluorofenol por diaminociclohexano.

51. NADH
Na2S2O4, Na2CO3, H2O,
temperatura ambiente, 10 h, 42%..
9
51

52. RESULTADOS
El ensayo 1 no fue satisfactorio debido a que el intermediario 5
mostro sensibilidad a la temperatura, la luz y el aire
5
52

53. ESTRUCTURA DEL NADH
El modelado molecular vía dinámica molecular seguida de
minimización de energía con Gaussian 03, mostró que tiene una
forma de cavidad cóncava estable “tazón”
Carbonos quirales
53

54. T
(°C)
t Relación Mg(ClO4)2/ Modelo 1
ee [%][a,b]
Configuración
10 Rendimiento [%][c]
1 r.t. 3 d 3.0 88 R 96
2 50 18 h 3.0 82 R 96
REACCIÓN DE REDUCCIÓN ASIMETRICA DE
METIL BENZOILFORMATO
Mg(ClO4)2
CH3CN
10
+ +
54

55. Este modelo podría ser usado para la investigación en biosimulación,
como una nueva prueba fluorescente en el curso de la traducción de
señales y para algunas investigaciones de mecanismos de reacción.
El nuevo modelo de NADH es capaz de emitir fluorescencia a 455 nm
cuando es excitado a 390 nm (λexc= 390 nm, λem= 455nm).
El NADH podría utilizarse como una nueva prueba fluorescente, sensible
a pH que con potencial como una pequeña molécula de prueba para la
investigación de la artereoesclerosis en la transducción de señales.
CONCLUSIÓN
55

56. ESPECTRO DE EMISIÓN DEL NADH EN METANOL COMO
FUNCIÓN DEL pH
LONGITUD DE ONDA (nm)
INTENSIDADDEFLUORESCENCIA
pH 8.0
pH 7.8
pH 7.7
pH 7.0
pH 6.8
pH 6.4
pH 6.0
Wang y Zhao,
2009
56

57. BIBLIOGRAFÍA
Metabolism of glucose in relation to the
lipid synthesis in the fruit of
Persea americana MILL.
YOSHIO KIKUTA1 and Louis C. ERICKSON
Department of Biochemistry, Citrus Research Center and Agricultural
Experimental Station, University of California, Riverside,
California 92502, U. S. A.
(Received January 13, 1969)
57

58. LUIS ALBERTO LIGHTBOURN ROJAS., PhD
DIRECTOR DE LA DIVISIÓN DE GENERACIÓN, EXCOGITACIÓN Y
TRANSFERENCIA
DE CONOCIMIENTO, BIOTEKSA, S.A. DE C.V.
Doctor of Science Summa Cum Laude Major in Chemistry
Doctor of Science Summa Cum Laude Major in Mathematics
Doctor of Philosophy Summa Cum Laude Major in Molecular Biology
Doctor of Philosophy Summa Cum Laude Major in Mathematics
Generador de la Bionanofemtotecnología de Bioteksa
Creador del Modelo Bioquímico Lightbourn para Nutrición Vegetal
Creador de los Modelos de Ingeniería Metabólica Lightbourn para Nutrición
Vegetal
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en los convenios de colaboración científica e investigación de ante CIAD-
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Miembro activo de la AMERICAN CHEMICAL SOCIETY
Miembro activo de la AMERICAN ORGANIZATION OF ANALYTICAL
CHEMISTRY
Miembro activo de la American Society for Biochemistry and Molecular
Biology
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GMT -7
58

59. LUIS ALBERTO LIGHTBOURN R., PhD
DIRECTOR DIVISION DE GENERACIÓN, EXCOGITACIÓN
Y TRANSFERENCIA DE CONOCIMIENTO BIOTEKSA, S.A. DE C.V.
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