previo

1. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA FARMACÉUTICA
Práctica 3. Extracción y determinación de actividad biológica
de una proteína (lectinas)
Integrantes:
• Acosta Rodríguez María Fernanda
• Ayllón Ornelas Brenda Karen
• Fierro Leos Ariadna
• González Hernández Luisa Fernanda
• Mendoza Narez René
Profesoras:
❖ M. en C. Flor Selene Villalobos Escobedo
❖ Dra. Estela Flores Gómez
Fecha de entrega: 14/03/2022
Equipo 1 Grupo: 5FM2

2. Práctica 3. Extracción y determinación de actividad biológica de una proteína (lectinas)
Objetivos
Objetivo general
• Adquirir los conocimientos teórico-prácticos para la obtención de compuestos proteicos con
actividad hemoaglutinante a partir de extractos vegetales.
Objetivos específicos
• Determinar la actividad hemoaglutinante de diferentes extractos de lectinas de semillas de
diferentes especies vegetales.
• Determinar cuantitativamente la cantidad de lectinas en cada extracto a través del método
Bradford.
• Confirmar los pesos moleculares de las lectinas obtenidas mediante el uso de geles de
poliacrilamida (SDS-PAGE).
Metodología
Extracción de lectinas
Prueba de hemoaglutinación

3. Cuantificación de proteína con el reactivo de Bradford
Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
Tratamiento de la muestra
Preparación del gel

4. Montaje de la cámara de electroforesis y corrimiento del gel

5. Tabla 1. Fundamentos de los reactivos utilizados en la práctica 3
Reactivo Fundamento
Solución isotónica (NaCl 0.85%) Cuando las células se colocan en una solución
Isotónica, es decir con una concentración salina
similar a la de su medio, la concentración de
agua permanece constante dentro y fuera de la
célula por lo cual el volumen y su forma no se
alteran y pueden conservarse a largo tiempo.
Solución amortiguadora PBS 0.015 M, pH 7.2,
0.15 M NaCl)
El buffer de fosfatos se utiliza para mantener
las células en condiciones fisiológicas estables
durante periodos cortos manteniendo el pH y
la presión osmótica lo más parecido al
ambiente biológico natural.
Acetona fría Permite la recuperación de proteínas
eliminando componentes no proteicos,
polisacáridos, lípidos y compuestos fenólicos.
Solución de Acrilamida 30%-Bisacrilamida
0.8%
La solución de Acrilamida se utiliza para verter
geles de poliacrilamida utilizados en la
secuenciación y electroforesis de proteínas.
Amortiguador del gel separador pH 8.8 Su función es mantener el pH del gel separador,
con un valor de 8.8.
Amortiguador del gel separador pH 6.8 Su función es mantener el pH del gel
separador, con un valor de 6.8.
Amortiguador de corrida 5X / SDS El tampón de ruptura o de carga se utiliza para
desnaturalizar las proteínas de la muestra para
mantenerlas desplegadas durante la
electroforesis.
Amortiguador de muestra pH 6.8 Mantener el pH estable de la muestra.
Persulfato de amonio al 10% p/v El persulfato de amonio forma los radicales
libres que inducen la polimerización de la
acrilamida y la bisacrilamida.
TEMED Se utiliza junto al persulfato de amonio para
catalizar la polimerización de acrilamida al
preparar geles para electroforesis.
Solución de azul de bromofenol 10 mg/mL Se trata de un compuesto coloreado y con
carga, utilizado para comprobar el progreso de
la electroforesis.
Solución teñidora Se utiliza para teñir el gel de poliacrilamida-SDS
y otras tinciones.
Solución destiñidora Se utiliza para desteñir el gel de poliacrilamida-
SDS

6. Cuestionario previo
1. Investigue que es una lectina de origen vegetal y al menos 3 características de las mismas.
Las lectinas son proteínas de origen no-inmunógeno que son capaces de interactuar de manera
específica y reversible con azúcares de carbohidratos complejos, sin que la estructura covalente del
ligando glicosídico en consideración sea afectada. (Kocurek, et. al., s.f.)
Se ha reportado que las lectinas de leguminosas por lo general se componen de dos o cuatro
subunidades, con un peso molecular aproximado de 25-30 kDa por subunidad. Cada subunidad tiene
un sitio de unión a carbohidratos (Sharon y Lis, 1990; Abhilash et al., 2013).
2. Investigue y fundamente 3 aplicaciones de importancia de las lectinas de origen vegetal en
la industria farmacéutica
Las lectinas vegetales pueden tener diversas funciones: participan en las interacciones entre las
bacterias fijadoras de nitrógeno con la raíz de plantas de leguminosas, poseen actividad mitogénica,
pueden tener efectos protectores en contra de la acción patogénica de ciertos microorganismos
como es el caso de los nemátodos herbívoros.
En diversas especies animales se han reportado evidencias de que las lectinas participan en
fenómenos tales como el reconocimiento y la eliminación de glicoproteínas del sistema circulatorio,
así como de células envejecidas, células tumorales y microorganismos, mediante un proceso de
opsonización y la participación de células con actividad fagocítica. (Hernández y Martínez, 2005).
Se ha reportado también el uso de lectinas en casos de diabetes. En efecto, en casos de diabetes
insulina dependientes moderadas (menos de 30 unidades de insulina por día) una dieta adecuada
de leguminosas permitió eliminar el uso de la hormona. La adición de la lectina obtenida de
Phaseolus vulgaris o de concanavalina-A a la dieta podría ser capaz de producir efectos semejantes.
(Acta Farmacéutica Bonaerens, 1987)
3. ¿En qué consiste la reacción de hemoaglutinación entre una lectina de origen vegetal y los
glóbulos rojos?
La aglutinación consiste en la agregación sistemática de células mediada por macromoléculas
especifica (anticuerpos o lectinas) que reconocen estructuras moleculares determinadas sobre la
superficie celular.
La hemoaglutinación es la aglutinación de los hematíes o glóbulos rojos, por una reacción que se
produce con una proteína (generalmente anticuerpos) específicas que detectan una proteína o un
oligosacárido (para el caso de las lecitinas) de superficie de los glóbulos rojos y hace que precipiten
(Hernández, et al,1999)
El ensayo de hemaglutinación es un método simple y sencillo para estimar en forma
semicuantitativa la presencia de actividad de lectina. Este método clásico permite detectar su
presencia a través de aglutinar glóbulos rojos como se observa la siguiente figura (Ilustración 1) La
cual los glóbulos rojos forman una malla que cubre todo el pocillo. (Clavijo, 2018)

7. 4. Investigue el fundamento del SD-SPAGE así como de los reactivos utilizados.
Existen diferentes técnicas y aparatos para el uso de la separación y purificación de proteínas por
electroforesis. Sin embargo, la técnica más empleada es la formación de una placa de gel de
poliacrilamida en la que se utiliza el método desarrollado por Laemmli (1970). En este método se
lleva a cabo la preparación de placas de gel de poliacrilamida que contienen dodecil sulfato de sodio,
denominando esta técnica como SDS‐PAGE. Las placas de gel de poliacrilamida se forman por la co‐
polimerización de la acrilamida para lo cual se utiliza un agente entrecruzador como la N,N’‐metilen
bis‐acrilamida en presencia de un catalizador de ion persulfato en forma de persulfato de amonio y
un iniciador como TEMED. La polimerización depende de la temperatura. Se recomienda utilizar una
temperatura por encima de los 20°C para prevenir una polimerización incompleta. La polimerización
se debe realizar en una atmósfera inerte ya que el oxígeno puede actuar como un neutralizador de
radicales libres, generados por el ión persulfato, por lo que se deben utilizar cámaras verticales que
dispongan de dos placas de vidrios selladas o en tubos para formar geles en disco (Disc gel) y de esta
manera disminuir la absorción de oxígeno por los geles. La velocidad de polimerización está
determinada por la concentración de persulfato de amonio y TEMED. Mientras que la porosidad del
gel, la determinan las proporciones relativas de poliacrilamida (C) y bis‐acrilamida (T), siendo menor
el poro cuanta más bisacrilamida haya en relación a la concentración de acrilamida. El porcentaje
total de acrilamida/bis‐acrilamida determina el rango de separación del gel. (Pérez, 2015)
5. ¿Cuál es la utilidad del SDS -PAGE en la industria farmacéutica?
La SDS-PAGE es la electroforesis más utilizada para el análisis de proteínas debido a:
• La gran mayoría de las proteínas son solubles en SDS.
• Todos los complejos SDS-proteína tienen carga negativa y migran, por lo tanto, en el
mismo sentido.
• Su densidad de carga es muy elevada, por lo que su velocidad de migración también lo
es y las electroforesis son muy rápidas.
• La separación depende de un parámetro físico-químico, como es la masa molecular, que
se puede calcular.
• Los complejos SDS-proteína se tiñen fácilmente
6. Existe algún método de conservación para las lectinas, ¿cuál sería y por qué?
Se puede realizar un procedimiento de liofilización que consiste en el desecado de determinados
materiales por medio de la sublimación del agua contenida en éstos. Consiste en congelar el
Ilustración 1 Hemoaglutinación de globulos rojos con lectinas vegetales

8. producto y posteriormente remover el hielo por sublimación, aplicando calor en condiciones de
vacío. Este método constituye un efectivo sistema de preservación de elementos biológicos tales
como células, enzimas, vacunas, virus, levaduras, sueros, algas, y alimentos. Todos estos contienen
sustancias volátiles o termosensibles que no se ven afectadas por este proceso, puesto que se
trabaja a temperaturas y presiones reducidas. Lo más importante del método es que no altera la
estructura fisicoquímica del producto y permite su conservación. (Parzanese, et. al., s.f.)
Bibliografía
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Santos Jorge. (2015). Electroforesis en gel de poliacrilamida‐SDS como herramienta en el
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• Clavijo F.(2018). Producción de lectinas de origen vegetal, fungico y evaluación de su
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• M. V. Rodríguez, B. Riquelme, J. Valverde y S. Gattuso. (2004). CARACTERIZACION DEL
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