Este documento describe diferentes métodos luminiscentes como la fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia. Explica que la fluorescencia y fosforescencia involucran la absorción de luz y emisión de luz a una longitud de onda más larga, y que la quimioluminiscencia involucra una reacción química que produce una especie excitada que emite luz. También discute cómo estos métodos se pueden aplicar para determinar compuestos inorgánicos y orgánicos de manera sensible y selectiva.
2. Aplicaciones de los métodos luminiscentes
Efecto de sustitución sobre la fluorescencia de bencenos sustituidos
3. Analisis por fluorescencia
Los métodos son confinados a la región espectral de 200 a 800 nm.
Los métodos de fluorescencia son más específicos y sensibles que los métodos colorimétricos.
En el desarrollo del procedimiento se determinan dos espectros: espectro de excitación y
espectro de emisión.
El espectro de excitación coincide con el espectro de absorción, y la banda de excitación de
mayor longitud de onda intersecta la banda de emisión.
El espectro de excitación se obtiene por medición de la intensidad de excitación sobre la
emisión de la sustancia en un amplio rango de energía radiante.
El espectro de emisión es obtenido por medición de la intensidad de la emisión sobre un
rango de longitudes de onda mientras la sustancia está siendo irradiada con una fuente
monocromática.
La mayoría de los compuestos orgánicos y quelatos metálicos que fluorescente sobre 400 nm
pueden ser excitados con radiaciones entre 350 a 360 nm.
4. La fluorescencia (o fosforescencia) cumple con la siguiente relación, cuando las concentraciones
son muy diluidas y no menos del 2% de la radiación incidente sea absorbida, hay una relación
lineal de la intensidad luminiscente PL y la concentración c;
PL = ΦL P0 ϵbc
donde ΦL (rendimiento cuántico de luminiscencia) y P0 (radiación incidente sobre la muestra).
Es de interés la dependencia de la luminiscencia con la intensidad de excitación.
La sensibilidad puede incrementarse con altas intensidades de excitación.
El termino b no es el diámetro de celda, sino el volumen solido del rayo definido por el ancho de
ranura (slit) de excitación y emisión junto con la geometría del rayo.
El ancho de ranura (slit widths) es el factor critico y no las dimensiones de la celda.
18. Efectos estructurales
La eficiencia luminiscente de una molécula depende de su estructura y del medio circundante en la cual se
mide la luminiscencia.
Algunas reglas pueden notarse.
La naturaleza del estado singlete (S1) más bajo es crítico en la determinación del comportamiento luminiscente
de una molécula porque la fluorescencia y la conversión intersistema ocurre de ese estado.
En moléculas orgánicas, la transición entre S0 y S1 involucra transiciones π→π* o n→π*.
Similarmente, el estado triplete (T1) experimenta las mismas transiciones.
La mayor eficiencia fluorescente envuelve transiciones π→π* porque la probabilidad es mayor.
Para los estados n→π*, la probabilidad de transición fluorescente es menor debido al bajo grado de traslape
entre los orbitales n y π*. Esto hace menos favorable a la fluorescencia.
Sin embargo, la velocidad de cruzamiento intersistema es desplazado debido a que la diferencia de energía
entre el singlete y el triplete es menor y el grado de acoplamiento espín-orbital es mayor.
Esto resulta en alto rendimiento de la fosforescencia.
19. Observaciones generales:
1. La luminiscencia no se observa en hidrocarburos saturados.
2. La luminiscencia es raramente observada en hidrocarburos no aromáticos que tiene algunos dobles enlaces.
Algunos altamente conjugados, pero no hidrocarburos aromáticos (por ejemplo, β-caroteno y vitamina A) exhibe
fluorescencia. Diacetilo exhibe alguna fosforescencia.
3. Muchos hidrocarburos aromáticos exhiben intensa fluorescencia.
4. La fosforescencia es favorable en moléculas aromáticas que contengan grupos carbonilos (benzofenonas) o
heteroátomos como nitrógeno (pirimidina, pirazina). Fuerte fluorescencia es observada en moléculas
heterocíclicas (triptófano y otros que incluyen al indol).
5. Grupos sustituyentes en anillos aromáticos influyen dramáticamente en el rendimiento cuántico y las
longitudes de onda de emisión,
20. 6. El efecto del sustituyente halógeno es conocido como “efecto interno de átomo pesado”. Los átomos pesados
perturban los espines electrónicos y se desplazan hacia a estados mezclados.
21. 7. Frecuentemente hay un incremento en φF, un descenso en φP y un desplazamiento batocrómico en las bandas
de emision cuando el tamaño del anillo y la extensión de la conjugación se incrementa
22. 8. La fluorescencia es favorecida en moléculas con estructura rígida planar. Estas características incrementan la
interacción y conjugación del sistema de electrones-π. Por ejemplo, la fluoresceína es fuertemente fluorescente,
mientras que la fenolftaleína es no fluorescente. La única diferencia es el puente oxigeno que fuerza la planaridad.
9. Para sistemas moleculares que contienen dos o más anillos aromáticos separados por grupos alquilo, las
características fluorescentes son aquellas de los grupos aromáticos independientes.
10. La fluorescencia de metales ocurre únicamente en complejos organometálicos particularmente quelato
metálico rígido.
23. APLICACIONES DE LOS METODOS LUMINISCENTES
Generalidades
Los métodos luminiscentes poseen límites de detección más bajos que las medidas espectrofotométricas de
absorción. La sensibilidad de un método fluorimétrico puede mejorar si aumenta 𝑃0 o si se amplifica aún más la
señal de fluorescencia.
Por tanto, los métodos fluorimétrico tienen casi siempre límites de detección que son de uno a tres órdenes de
magnitud superiores a los correspondientes procedimientos espectrofotométricos.
Por otro lado, la precisión y la exactitud de los métodos fotoluminiscentes son por lo regular más bajas que las de
los procedimientos espectrofotométricos en un factor entre, quizá, 2 y 5.
Determinación fluorométrica de especies inorgánicas.
Los métodos inorgánicos fluorométricos son de dos tipos. El primero corresponde a los métodos directos donde se
forma un quelato fluorescente y se mide su emisión.
El segundo grupo se basa en el descenso de la fluorescencia que resulta de la acción amortiguadora de la sustancia
en estudio. La última técnica se ha utilizado más en la determinación de aniones.
24. Cationes que forman quelatos fluorescentes
Existen dos factores que limitan la cantidad de iones de metales de transición que forman quelatos fluorescentes.
En primer lugar, muchos de estos iones son paramagnéticos; esta propiedad aumenta la velocidad de cruce entre
sistemas hacia el estado triple. Por tanto, la desactivación por fluorescencia es poco probable, aunque puede
observarse fosforescencia.
Un segundo factor es que los complejos de los metales de transición se caracterizan por presentaros niveles de
energía muy cercanos, lo que aumenta la probabilidad de desactivación por conversión interna.
Por ello las principales aplicaciones inorgánicas de la fluorometría se reservan a los iones de los metales que no
son de transición, los cuales son menos susceptibles a los procesos de desactivación.
Hay que señalar que los cationes de los metales que no son de transición son en general incoloros y tienden a
formar quelatos que también lo son. Entonces, la fluorometría a menudo complementa a la espectrofotometría.
28. Métodos para especies orgánicas y bioquímicas
La cantidad de aplicaciones del análisis fluorométrico en la química orgánica es impresionante.
Por ejemplo, entre los compuestos orgánicos tenemos: adenina, ácido antranílico,
hidrocarburos aromáticos policíclicos, cisteína, guanina, isoniacida, naftoles, los gases que
atacan el sistema nervioso sarín y tabún, proteínas, ácido salicílico, escatol, triptófano, ácido
úrico y warfarina (coumadina).
Se encuentran incluidos muchos agentes medicinales que se pueden determinar mediante
fluorometría, como adrenalina, morfina, penicilina, fenobarbital, procaína, reserpina y
dietilamida del ácido lisérgico (LSD).
Sin duda, la aplicación más importante de la fluorometría es en el análisis de productos
alimenticios, farmacéuticos, muestras clínicas y productos naturales.
La sensibilidad y selectividad del método lo hacen particularmente valioso en estos campos.
Una gran cantidad de compuestos importantes desde el punto de vista fisiológico manifiestan
fluorescencia.
29. Tabla. Data de fosforescencia para algunos compuestos orgánicos
31. QUIMIOLUMINISCENCIA
Generalidades
La aplicación de la quimioluminiscencia a la química analítica es reciente.
Las reacciones químicas que producen quimioluminiscencia son pocas, lo que limita el procedimiento a un número
relativamente pequeño de especies.
Algunas de las sustancias que manifiestan quimioluminiscencia son componentes importantes del ambiente.
Para estos casos, la alta selectividad, la sencillez y la extrema sensibilidad del método son la causa de su creciente
utilización.
La quimioluminiscencia se produce cuando una reacción química genera una especie electrónicamente excitada que
emite luz cuando vuelve al estado fundamental.
Las reacciones quimioluminiscentes se producen en varios sistemas biológicos, en los que el proceso se suele
denominar bioluminiscencia.
Entre los ejemplos de especies que presentan bioluminiscencia están las luciérnagas, un coral suave del género
Renilla y ciertas medusas, bacterias, protozoos y crustáceos.
Las características químicas de los distintos procesos bioluminiscentes naturales no se conocen totalmente.
32. Principios
Tres secuencias comunes de reacción usados en la quimioluminiscencia son los siguientes:
(a)
(b)
(c)
donde A y B son reactantes, I es un intermediario, P es el producto, y F es un aceptor fluorescente. Asumiremos en
esta discusión que A es la especie convertida a la especie luminiscente (es decir, A es el precursor
quimioluminiscente), mientras que B representa otros reactivos o especies que influyen la reacción.
Las secuencias de reacción (a) y (b) ilustran que las especies luminiscente pueden ser un intermediario o un
producto en la reacción.
La reacción (c) representa la quimioluminiscencia sensibilizada en la cual la especie excitada produce en uno de los
primeros pasos una secuencia de transferencia de su energía a un fluoróforo eficiente aceptor la cual fluoresce.
El A es el analito, el B es una reactivo ,es un activador I es un
intermediario se tiene la quimioluminiscencia
33. Para que la quimioluminiscencia ocurra, debe conseguirse tres condiciones generales.
1. Primero debe haber suficiente energía para producir un estado excitado. Así la reacción debe ser
suficientemente exotérmica tal que
−𝛥𝐺 ≥
ℎ𝑐
𝜆𝑒𝑥
donde 𝛥𝐺 es el cambio de energía de Gibbs (kcal mol−1
) de la reacción y 𝜆𝑒𝑥 es el limite de la mayor-longitud-de-
onda en nanómetros para la excitación de la especie luminiscente. Para la emisión quimioluminiscente en la región
visible, −𝛥𝐺 debe ser de 40 a 70 kcal mol−1
.
2. Segundo, debe haber una ruta de reacción favorable para producir el estado excitado. En muchas reacciones, la
relación de I∗ a I (o P∗ a P) producido por los mecanismos (a) y (b) es excesivamente pequeño y la
quimioluminiscencia no es observada.
También, otros intermediarios o productos pueden ser producidos por diferentes rutas, con únicamente una ruta
que conduce a la especie excitada y la quimioluminiscencia
3. Tercero, la emisión del fotón debe ser un proceso de desactivación favorable para la quimioluminiscencia
favorable.
Para la quimioluminiscencia sensibilizada, ambos la eficiencia transferencia de energía desde las especies excitadas
al donador y la eficiencia de fluorescencia del donador debe ser bueno.
34. Figura. Curva hipotética muestra intensidad quimioluminiscente como
función del tiempo después que los reactivos son mezclados para iniciar la
reacción. El incremento inicial en intensidad se debe al tiempo finito para
el mezclado de reactivos o un periodo de inducción en la reacción. El
decaimiento de la señal es causado por el consumo de los reactivos y
cambios en la eficiencia cuántica de la quimioluminiscencia con el tiempo.
35. Instrumentación
El equipo para medir la quimioluminiscencia es notablemente sencillo, y puede consistir tan sólo de un recipiente
de reacción adecuado y un tubo fotomultiplicador.
En general, no es necesario ningún dispositivo para seleccionar la longitud de onda porque la única fuente de
radiación es la reacción química entre el analito y el reactivo.
Diversos fabricantes de instrumentos ofrecen fotómetros quimioluminiscentes.
La señal característica de un experimento quimioluminiscente depende del tiempo y surge con rapidez hasta un
máximo cuando la mezcla del reactivo y el analito se completa.
Luego sigue una disminución de la señal más o menos exponencial.
Por lo regular, en lo que se refiere al análisis cuantitativo, la señal se integra para un tiempo fijo y se compara con
patrones tratados de forma idéntica.
Otra opción es usar las alturas de los picos para efectuar los cálculos.
A menudo se observa una relación lineal entre la señal y la concentración, para un intervalo de concentración de
varios órdenes de magnitud.
36. Figura. Diagrama del fotómetro quimioluminiscente simple. La muestra y algunos reactivos son suministrados en la celda de
muestra. El reactivo final es inyectado con una jeringa a través de una membrana para iniciar la reaccion
quimioluminiscente. La quimioluminiscente es monitoreado con un detector tubo fotomultiplicador (PMT), la corriente
fotoanódica es convertido a voltaje, y el voltaje es mostrado en un aparato de lectura o digitalizado y almacenado para la
manipulación posterior de la data y presentarlo. Frecuentemente se emplea una jeringa automática para lograr una
velocidad de inyección y volumen más reproducible y sincronización de la colección de data para la iniciación de la reacción.
Aunque la fuerza de inyección proporciona el mezclado, frecuentemente se utiliza una barra de agitación magnética y
agitador para obtener un mejor mezclado. Frecuentemente, se controla la temperatura de la celda de muestra.
37. Figura. Fotómetro quimioluminiscente de flujo continuo. En (a)la muestra y reactivos son combinados en un
soporte y enviado a una celda de flujo para la observación de la quimioluminiscencia. El diseño en (b) es también
usado para soluciones. En este caso, el reactivo es forzado a través de una membrana para la corriente que fluye
de la muestra. Se ilustra en (c) una cámara de reacción para determinación quimioluminiscente de gases.
38. Estos reactivos reaccionan con oxígeno, peróxido de hidrógeno y muchos otros agentes oxidantes fuertes para
originar un producto de oxidación quimioluminiscente.
El luminol es el ejemplo más común de este tipo de compuestos.
A continuación, se muestra su reacción con oxidantes fuertes, como oxígeno, peróxido de hidrógeno, el ion
hipoclorito y el ion permanganato, en presencia de una base fuerte.
A veces se necesita un catalizador para que la reacción transcurra a la velocidad adecuada.
La emisión producida coincide con el espectro de fluorescencia del producto, el anión 3-aminoftalato.
La quimioluminiscencia es azul y está centrada alrededor de 425 nm.
Muchos de los análisis que se llevan a cabo en fase líquida utilizan sustancias orgánicas quimioluminiscentes que
contienen el grupo funcional
39. Dentro de ciertos límites, la intensidad de quimioluminiscencia del luminol es proporcional a la concentración del
oxidante, del catalizador o del luminol.
Por consiguiente, la reacción proporciona un método sensible para determinar cualquiera de estas especies.
Por ejemplo, si se utiliza peróxido de hidrógeno como oxidante, se puede detectar el catalizador Co2+a
concentraciones inferiores a 0.01 nmol/L, Cr3+
si el catalizador es 0.5 nmol/L por debajo de Cu2+
y si es 1 nmol/L
por debajo de 1 nmol/L.
Con algunos cationes se inhibe la luminiscencia.
En esos casos, el descenso en la intensidad facilita determinar las concentraciones.
41. 1. La fluorescencia del sulfato de quinina es atenuada por las altas concentraciones de ion cloruro. Las señales
siguientes de fluorescencia F se obtuvieron en función de la concentración del ion cloruro.
Determine la constante
de supresión 𝐾𝑞.
42. 2. ¿Para cuál de los siguientes pares de compuestos se espera una mayor eficacia cuántica de fluorescencia? Explique.
