Presentation 15: Genomic comparisons between Vibrio parahaemolyticus AHPND positive strains (Dr Sonia Soto, Mexico)

FAO TCP/INT/3502 “Reducing and managing the risk of
Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND) of Cultured Shrimp”
Sonia Soto Rodriguez
ssoto@ciad.mx
Genomic and phenotypic
characterization of Vibrio
parahaemolyticus causing AHPND in
Mexico
CIAD
24/06/2015 1
International Technical Seminar/Workshop “EMS/AHPND: Government, Scientist and Farmer Responses”
22-24 June 2015, Tryp Hotel, Panama City

2
AHPND
Afectación a nivel mundial producción de camarón cultivado
Vietnam
Thailand
Malaysia
Hainan, China
Philippines
Mexico
International Technical Seminar/Workshop “EMS/AHPND:
Government, Scientist and Farmer Responses”
24/06/2015

Caso de México
– 2013 reducción mayor al 70 % en la producción de camarón
cultivado
– Rápida dispersión de la enfermedad
• Signos clínicos similares a los de AHPND de Asia.
• Aplicación productos: cloro, desinfectantes, vinagre, peróxido,
antibióticos (oxitetraciclina, enrofloxacina y florfenicol)…. Todo
sin resultado aparente
24/06/2015 3
Centro de Investigación en Acuicultura y Desarrollo, A.C.
Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental
International Technical Seminar/Workshop “EMS/AHPND: Government,
Scientist and Farmer Responses”

Estados con cultivo comercial de camarón en México
24/06/2015 4
Nayarit
Sinaloa
Sonora
Colima
Baja
California
Chiapas
Tamaulipas
Campeche
Golfo de México
Océano Pacífico
Veracruz
Baja
California Sur
Jalisco
Yucatán
Más del 90%
de producción

Estados afectados por AHPND en México
24/06/2015 5
Nayarit abril
2013
Sinaloa
mayo 2013
Sonora mayo
2013
Colima abril
2014
B. California
julio 2014
Chiapas
julio 2014
Tamaulipas junio
2014 (PCR +)
Campeche
agosto 2014
Golfo de México
Océano Pacífico
Veracruz
noviembre 2014
Yucatán

Situación sanitaria en 2015
para Sinaloa
24/06/2015 6
Área total 50,310 Ha (5,647
estanques, 47 pre-crías)
Superficie de granjas
afectadas
16,401 Ha
Superficie total afectada 50%
Granjas afectadas 74%
datos: CESASIN

Peso de camarones al momento del
brote en Sinaloa
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0.6
1.2
1.8
2.4
3.0
3.6
4.2
4.8
5.4
6.0
6.6
7.2
7.8
8.4
9.0
9.6
10.2
10.8
11.4
12.0
Frecuencia
peso (g)
24/06/2015 7International Technical Seminar/Workshop “EMS/AHPND: Government,
datos: CESASIN

Quién es V. parahaemolyticus
• Bacilo Gram negativo, no fermenta sacarosa
• Naturalmente asociado con sistemas de cultivo de
camarón:
• Planctónica, sedimento, afinidad por superficies
quitinosas
• Puede existir en estado viable pero no cultivable
• Capaz de causar gastroenteritis en humanos
• Patógeno para camarones, ostiones
• Idenficación molecular: gen tlh, cepas patógenas para humanos:
gen tdh y/o gen trh

Identificación del agente
causal
24/06/2015 9

1. Estudio de campo (más de 200 camarones
enfermos de varias granjas, muestras de
agua y sedimento):
2. Aislamiento e identificación del agente
causal
3. Desafíos de laboratorio
4. Re-aislamiento del agente causal
24/06/2015 10
Postulados de Koch

RESULTADOS EN CAMPO
Signos clínicos
24/06/2015 11
• Hepatopáncreas decolorado, atrofiado y
acuoso.
• Tracto vacío (estómago e intestino)
• Anorexia
• Letargia
• Cromatóforos expandidos

Camarones sanos
24/06/2015 12
Camarones enfermos

24/06/2015 13
Observaciones en campo

24/06/2015 14
Elongación células,
s/infiltración
hemocítica
Descamación
aguda del epitelio
HP
Infección
secundaria, atrofia
del HP
AHPND
Histopalotolgía de camarones de granja
1. INITIAL STAGE 2. ACUTE STAGE 3. TERMINAL STAGE

0.E+00
1.E+08
2.E+08
3.E+08
4.E+08
5.E+08
6.E+08
7.E+08
8.E+08
9.E+08
1.E+09
Normal Initial Acute Terminal ND
CFU/gonTCBS
Hepathopancreas Stomach
Secondary
infection by
opportunistic
vibrios
24/06/2015 15
Vibrio density in hepatopancreas and
stomach of shrimp

24/06/2015 16
Green colonies on hepatopancreas and
stomach on TCBS
0
20
40
60
80
100
Normal Initial Acute Terminal ND
GreencoloniesonTCBS(%)
Stage of disease
Hepathopancreas Stomach

Molecular
CIAD, A.C. Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental
Characterization of Vp strains from
México
24/06/2015 17

Molecular identification and
characterization
Caracterización (fingerprinting) con el primer GTG5.
Versalovic et al. 1994, Gomez-Gil et al. 2005.
 Gran diversidad de cepas
 Cepas de probaron con diferentes sistemas
de diagnósticos
24/06/2015 18
 Amplificación del gen tlh, tdh y trh.
• Ambos análisis se realizaron por PCR de punto final y
PCR cuantitativa (qPCR).

Shrimp mortality caused by pure Vp strains
24/06/2015 20
0
25
50
75
100
4 6 7 8 9 10 15 16 17 18 19 21 22 24 25 26 28 41 44
Cumulativemortality(%)
Time post infection (h)
Control
M05-28
M09-04
M08-02
M06-07
• Pathogenicity: immersion method , shrimp 0.1-1.0 g, density 106 CFU/mL

M09-04 strain, 18 hours post infection
24/06/2015 21
Control
Clinical signs
Anorexy, empty gut, letargy, pale and aqueous
hepatopancreas, and expanded chromatophores

Túbulos con marcada infiltración
hemocítica, epitelio necrótico con
abundante descamación de células
muertas en el lumen de los túbulos
24/06/2015 22
Evidencia histopatológica
Fase aguda
Infiltración hemocítica severa en tejido
conectivo; necrosis severa y melanización
del epitelio de túbulos con proliferación
de masas de bacterias
Fase terminal

Resultados de pruebas diagnósticas
24/06/2015 23
Strain AHPND
IQReal toxin
1CY5
AP2 Flegel
AP3
qPCR
AP4
qPCR
M02-07 Neg Neg - -
M05-28 Neg - Neg - -
M06-04 Neg + Neg + +
M07-02 Neg + Neg + -
M09-03 Neg Pos + +
M2302 Neg Neg + +
MSG-21 Neg Pos - +
M06-03 Pos Pos + -
M06-05 Pos Pos + +
M06-06 Pos + Pos + +
M06-07 Pos Pos + +
M08-01 Pos + Pos + +
M08-02 Pos + Pos + +
M08-03 Pos + Pos + +
M2301 - Neg + -

24/06/2015 24
• Immersion method, M0904 strain, shrimp 1.15 ± 0.04 g
Densidad infectiva umbral
0
25
50
75
100
0 3 5 7 9 11 21 25 28 31 46 104 167
Cumulativemortality(%)
Time post infection (h)
8.10 x 10^6
8.26 x 10^5
8.20 x 10^4
7.85 x 10^3
7.85 x 10^2
7.85 x 10^1
Control

Characterization of
Vp EMS+
Genomic

Whole Genome Sequencing
Cepa Origen Patogenicidad Cita
M0904, M0905,
M0802, M0803
Sinaloa, Mexico High virulence Unpubl.
M0605, M0607 Sinaloa, Mexico Medium
virulence
Gomez-Gil et al.
2014
FIM-S1708 Sonora, Mexico Virulent Nunan et al. 2014
DE2S2, DE1S1,
D06S3
Thailand Virulent Kondo et al. 2014
CHN Hainan, China Virulent Yang et al. 2014
3HP, 5HP Thailand Virulent Yang et al. 2014
24/06/2015 26
13 genomas de cepas patogénicas
7 Mexico y 6 Asia

Mexico (Sinaloa)
Mexico (Sinaloa)
Thailand
Japan
Hong Kong
Bangladesh
Thailand
ftsZ, topA, gapA, recA, pyrH. 6,642bp
Pathogenic strain
24/06/2015 27
MLSA analysis of Vp strains
Mexico (Sonora)
Thailand
Mexico (Sonora)
Medium
virulence
High virulence

M0904 ChI
3.34 Mbp
integron
P4-type
prophage
Inserted
plasmid
7.8 Kbp
phage
RTX
1. v110
2. RIMD 2210633
3. CP003973
4. BA000032
5. M0903
6. DE1S1
7. DE2S2
8. D06S3
9. M0607
10. M0605
11. M0803
12. M0802
13. M0905
Unknown
Innocuous
Pathogenic
Comparison of
chromosome I of
the pathogenic
strain M0904
against 13 Vp
strains.
MuSo phage
Inserted sequence
24/06/2015 28

1. v110
2. M0603
3. RIMD 2210633
4. CP003973
5. BA000032
6. DE1S1
7. DE2S2
8. D06S3
9. M0607
10. M0605
11. M0803
12. M0802
13. M0905
14. M0904
M0903 ChII
1.91 Mbp
RTX
mannosidase
prophage
Mu-like prophage
hemolysin
Unknown
Innocuous
Pathogenic
Comparison of
chromosome II of
the innocuous
strain M0903
against 10 Vp
strains.
24/06/2015 29

Conjugative plasmid
comparison
Pathogenic
strains
Transposon 1
Transposon 2
24/06/2015 30

Transposones
• Elementos móviles
• Compuesto por una transposasa y genes
24/06/2015 31
Secuencia de ADN
gen
transposon

Transposón 1 en el plásmido AP
24/06/2015 32
%GC
promotor
promotor
Operón PirAB
IS903 = transposasa tipo 903
hp = proteina hipotética
CSAP = Cell surface anchor protein Genes poseen alta homología con las toxinas
PirAB de Photorhabdus luminescens (bacteria
patógena para insectos)

PirA
PirB
B. thuringiensis Cry3A P. luminescences PirAB V. parahaemolyticus M0904
24/06/2015 33

Plásmidos conjugativos
24/06/2015 34
Célula donadora Célula receptora
Bacteria

Characterization of Vp from
México
Phenotypic

Morphological and physiological
characteristics of Vp strains
24/06/2015 36
Pathogenic strains Nonpathogenic strains
Characteristic M0603 M0605 M0802 M0904 M0905 M0528 M0604 M0702 M0903 SMG21
Gram staining - - - - - - - - - -
Cell morphology Rod Rod Rod Rod Rod Rod Rod Rod Rod Rod
Motility + + + + + + + + + +
Swarming on TSA (2% NaCl) - - - - - - - - - -
Luminiscence - - - - - - - - - -
Pigment - - - - - - - - - -
Growth on TCBS GC GC GC GC GC GC GC GC GC GC
Growth on ChromAgar
Vibrio m m b b b m m b B b
Oxidase + + + + + + + + + +
Catalase + + + + + + + + + +
Arginine dihydrolase - - - - - - - + + -
Lysine decarboxilase + + + + + + + + + +
Ornithine decarboxilase + + + + + + + - - +
O-F + + + + + + + + + +
GC: green color
m: malve
b: blue
B: beige

Morphological and physiological characteristics
of Vp strains
24/06/2015 37
Characteristic Pathogenic strains Nonpathogenic strains
Production of: M0603 M0605 M0802 M0904 M0905 M0528 M0604 M0702 M0903 SMG21
H2S - - - - - - - - - -
Indole + + + + + + + + - +
Gas from D-glucose - - - - - - - - - -
Nitrate reduction + - + + - + + + + -
Nitrite reduction + + + + + + + + + -
Voges-Proskauer - - - - - - - - - -
β-galactosidase (OPNG test) - - + + + - - + - +
Urease - - - - - + - - - -
Gelatinase + + + + + + + + - +
Acetoin + + + + + + + + + +
Utilization of:
Amygdalin + + - + + + + + - +
L-Arabinose + + + + + - + - - +
Citrate + + - - - + + + - +
D-Glucose + + + + + + + + + +
Inositol - - - - - - - - - -
D-Mannitol + + + + + + + + - +
Melibiose - - - - - - - - - -
L-Rhamnose - - - - - - - - - -
Sorbitol - - - - - - - - - -
Sucrose - - - - - - - - - -
Tryptophan deaminase - - - - - - - - - -
Production of
Utilization of

Colony morphology of V. parahaemolyticus
• Green color colonies on TCBS
• Mauve, blue and beige on CHROMagar
Vibrio
24/06/2015 38

24/06/2015 39
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
LOGCFU/mL
Time (hr)
M0904 path M0905 path M0965 path M0903 nonpath
Crecimiento de Vp:
• Exponencial a partir de las 2 h de incubación
• Similar cepas patógenas e inocuas

• NaCl:
0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0 %
24/06/2015 40
Tests: pathogenic and nonpathogenic strains
growth at:
• pH:
4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0
• Temperature:
4.0, 20.0, 37.0, 44° C

24/06/2015 41
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
DO(610nm)
Time (h)
0% 0.5% 1% 2% 4% 5% 6% 8% 9% 10%
Pathogenic strain M0904: growth from 0.5 to 10% NaCl

24/06/2015 42
Pathogenic strain M0904: growth at pH 5-10
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
0.90
1.00
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
OD(610nm)
Time (h)
pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 pH 10

24/06/2015 43
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
0.90
0 20 40 60 80 100 120
OD(610nm)
Time (h)
T= 4°C T= 20°C T= 30°c T= 37°C T= 44°C
Pathogenic strain M0904: growth at 20, 30, 37 and 44° C

Sensibilidad a antibióticos
Prom. 5 cepas patógenas
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
ÄCIDICONALIDIXICO30
CLORANFENICOL
CLORANFENICOL30μg
ÁCIDONALIDIXICO(50μg/ml)
NORFLOXACINA
CTX50
CEFOTAXIMA30μg
NITROFURANTOINA400
NITROFURANTOÍNA300μg
CEFALOTINA30μg
CIPROFLOXACINA5μg
NORFLOXACINA10μg
GENTAMICINA10μg
AMIKACINA30μg
SULFAMETOXASOL/TRIMETR…
FLORFENICOL(300μg/ml)
KANAMICINA(1500μg/ml)
NETILMICINA30μg
OXITETRACICLINA(160μg)
TETRACICLINA
AMPICILINA
AMPICILINA10μg
CARBENCILINA100μg
PENICILINAPROCAÍNA
Halodeinhibición(cm)
24/06/2015 44
Ac. nalidíxico
Oxitetraciclina
Norfloxacina

24/06/2015 45
Table 1. Minimum inhibitory concentration
(MIC) of antibiotics for Vp pathogenic strains
Antibiotic (µg/mL) Vp strain
M0603 M0605 M0802 M0904 M0905
Oxytetracycline 100 100 200 200 200
Chloramphenicol 100 100 250 250 250
Ceftriaxone 250 250 250 250 250
Norfloxacine 100 100 100 250 250
Florfenicol 50 50 100 100 50
Enrofloxacine 100 100 100 50 50
Nalidixic acid 50 50 85 25 50

PROCESOS INFECCIOSO AHPND
Oral route (cannibalism,
sediment, water)

Microfotografías TEM (6 h p.i. Vp patógena)
24/06/2015 47
Lu
Lu
Cu
Cu
Es
Es
Es
Hp
Ep

Conclusiones
• Mas de una cepa patógena de Vp que se comportan
patógeno primario
• Cepas de Vp patógenas tienen:
• Plásmido conjugativo
• Plásmido puede infectar cepas locales
• Ligeras diferencias entre cepas mexicanas y asiáticas
• Factor de virulencia delta endotoxinas relacionadas a
PirAB.
• Cepas patógenas toleran amplio intervalo de
condiciones ambientales

49
Alternativas de control de
AHPND en México
24/06/2015

24/06/2015 50
• Probióticos (en la dieta y agua)
• Aditivos en el alimento y agua
(inmunoestimulantes, ácidos orgánicos,
minerales)
• Desinfectantes químicos
• Antibióticos (puros y mezclas)
• Prebióticos
• Productos químicos (peróxido de hidrógeno,
cloro, vinagre, sulfato de cobre, etc.)
Uso de (granjas de engorda y
laboratorios larvarios):
Evaluación
en desafíos
con Vp
patogénico

Cambio de sistema de producción
24/06/2015 51
 Uso de maternidades (sistema controlados):
Cerrados, liners, bajo recambio de agua
 Acoplados con control biológico: Probióticos y
Bioflocs
 Líneas genéticas

Actividadades de investigación en curso
• Caracterización de la toxina
• Estudios de colonización en estómago y
hepatopancreas (Hib in situ, ME, qPCR)
• Co-infecciones con otras bacterias
• Evaluación de la respuesta inmune de
camarones
• Estudios de la interacción sedimento-bacteria
(Vp)

Gracias por su atención!!!
Dra. Sonia A. SotoRodríguez
ssoto@ciad.mx
Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C.
24/06/2015 53

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