GENETICA

1. CULTIVOIN VITRO2017
Dra.Ing.Ftal.MarcelaRuscitti
INFIVE(Instituto de FisiologíaVegetal)
UNLP– CONICET
marcelaruscitti@gmail.com

2. BIOTECNOLOGIA
CULTIVOIN VITRO DE TEJIDOS
MICROPROPAGACION
(principalaplicacióncomercial)

3. Biotecnología
Es la aplicación de organismos vivos para la
resolución de problemas de interés a la
comunidad.
Puedeser clasificadaen:
Biotecnologíaensaludhumana
Biotecnologíaanimal
Biotecnologíaindustrial
Biotecnologíavegetal
Biotecnologíaambiental

4. Biotecnologíavegetal
Permite producir
rápidamente
mas
nuevas
variedades de plantas con
características mejoradas,
rendimiento,
a condiciones
resistencia a
control de
mayor
tolerancia
adversas,
herbicidas,
plagas.

5. Cultivoinvitrode tejidosvegetales

6. ¿Quéesel cultivodetejidosvegetales in vitro?
Pierik(1987)definecultivode tejidosvegetalesin vitro de
plantassuperiorescomo:
El cultivo enmedionutritivo,bajo condiciones
estériles,de plantas,semillas,embriones,
órganos,explantos,tejidos,célulasy
protoplastosde plantassuperiores.

7. Existen tres conceptos básicos que
fundamentan el cultivo in vitro de
células y tejidos vegetales:
- Totipotencialidad celular
- D es diferenciación /Rediferenciación
- Balance de reguladores del crecimiento
vegetal

8. Condicionesdeincubación
• Temperatura
• Luz
Calidad
Cantidad
Controldelfotoperíodo

9. El CTV requiere
una infraestructura
mínima
especializada y
condiciones
controladas de
cultivo
• Laboratorio: preparación de medios
-Area de preparaciónde medios
-Area de lavadoy esterilización
-Cuartoestéril
-Cámara de cultivo
-Area de rusticación
• Material vegetal: explantos
-Plantas madres seleccionadas
(preacondicionamiento)
-Explantos (elección, disección,
esterilización, etc.)
• Condiciones de cultivo
-Asepsia
-Recipientes
-Temperatura
-Luzy fotoperíodo

10. ¿Cómo lograr uncultivo de tejidos vegetales?

11. Mediosdecultivo: tipos
Sólido

12. Embriogénesissomática
ETAPAS
• Inducción:formacióndemasas proembriónicas,conauxinas
• Histodiferenciación: embriones en estadío globular, de corazón, de
torpedo, sinauxinas
• Maduración: embrionesen estado cotiledonar, conABA,desecación
• Germinación

13. Embriogénesissomática
Calloembriogénico embriones Embriónenestado
globular
Embriónenestadode
corazón
Embriónenestadode
torpedo
Embriónenestado
cotiledonar

14. Induccióndela EmbriogénesisSomática

15. Embriogénesissomática

16. MICROPROPAGACIÓN

17. MICROPROPAGACIÓN
La micropropagación
constituye la principal
aplicación comercial
del cultivode tejidos
vegetales

18. • La micropropagación vegetal, o propagación clonal masiva
de plantas superiores, posibilita la obtención y cultivo de
plantas a gran escala.
• Se realiza bajo estrictas condiciones de esterilidad en un
medio sintético nutritivo y con control de temperatura, luz y
fotoperíodo.

19. • Iniciación
-Eleccióny fitoacondicionamientode la planta
madre
-Eleccióndelexplantoinicialy de la formulación
delmediode cultivo
-Desinfecciónsuperficialde los explantos
-
Establecimientodel cultivo in vitro
• Multiplicación
-Multiplicacióndelmaterial stock
• Enraizamiento
-Enraizamientode los brotes obtenidos in vitro
• Rusticación
-Pasaje de las plantas crecidas in vitro a las
condiciones de maceta oa campo
Etapas
de la micro
propagación
vegetal

20. FASE I: ESTABLECIMIENTODELCULTIVOEN
CONDICIONESDE ASEPSIA
• Lavado del material con agua corriente, eliminación de las partes
muertaseinfectadasdelaplanta.
• Introducción de la porción de planta en alcohol diluido al 80% durante
unossegundos.
• Sumergirla planta enunasolucióndehipoclorito desodiooCaconun
agentehumectantedurante10-
30minutos.
• Enjuague del material con agua estéril para eliminar la solución de
hipocloritodesodio.El enjuaguedebe tener lugarbajocondicionesde
asepsia, y suele realizarse en tres veces sucesivas de unos 2 minutos
cadauna.

21. • Protocolo tipo de esterilización superficial
de material vegetal:
- Etanol 70% ,entre 5 y 10 seg.
- Solución de hipoclorito de sodio (NaCIO)
de 5 a 20% ,entre 5 y 30 min.Este paso
puede ser reemplazado por el uso de
soluciones diluídas de bicloruro de mercurio
(HgCl2), entre el 0,01 y0,05%.
-Enjuagues con abundante H2O estéril
(4 ó 5 veces).
- En el caso del HgCl2,el material se debe
enjuagar sucesivas veces pues es difícil
de eliminar
.
Los explantos
deben ser
esterilizados
antes de ser
establecidos
en condiciones
de cultivo

22. Siembra encondicionesde esterilidad

23. Principalescausasde contaminación:
• Esteriliz
aciónsuperficial inadecuada
• Manipulación
• Introducciónde esporaspor Trips
Se detecta fácilmente a simple vista a lospocos
días.

24. Génerosde hongosmásfrecuentes:
• Aspergillus
• Candida
• Cladosporium
• Microsporium
Génerosde bacteriasmásfrecuentes:
• Agrobacterium
• Bacillus
• Enterobacter
• Pseudomonas
• Lactobacillus

25. FASE II: MULTIPLICACIÓNDE LOSBROTES

26. Costosde la micropropagación
• Capitalparalainstalacióndel laboratorio
• Costodelamanodeobra
• Costodelosmateriales
• Característicasdelcomportamientoinvitro delmaterial:
Facilidad de establecimiento, rejuvenecimiento, etc.
Tasa de multiplicación
Enraizamientoinvitro/exvitro
• Pérdidasqueocurrenencadaetapadelproceso:
contaminación
hiperhidricidad
% plantasqueno enraiz
an
% plantasqueno sobrevivenlaaclimatación

27. Micropropagación vspropagación vegetativa convencional
• Esposible propagar algunasespeciesquenose
propagan “in vivo”.
• Senecesitamuypocomaterial departida.
• Elcrecimientoesmayorpor rejuvenecimientoy
sanidad.
• Serequierepocaárea paraelcultivodel material.
• Seelimina elefectoestacional.
• Simultáneamente se “limpia” el material.

28. Otras aplicaciones …

29. Variaciónsomaclonal
Obtención de variantes
somaclonales de pasto
llorón, Eragrostis curvula a
partir del cultivo de
inflorescencias .
Resistencia a frío en paraíso
gigante
Resistencia a salinidad en
eucalipto
Alos 24meses de cultivo
invitro, engeneral, la
planta muere porla
cantidadde cambios
cromosómicos
producidos¡¡¡¡¡.

30. Mejora genética. OGM
En1983se informaronlosprimerosexperimentos
deexpresióndeun transgen(genintroducido porvía asexual)en
células vegetales y al año siguiente seobtuvieron las primeras
plantastransgénicas(tabacoy petunia).
Desdeentoncesseha
extendidolaaplicación
de estatecnologíaamás
de120especies.

31. Aplicacionesdelcultivode tejido
Mejoragenética.OGM
METODOS:
a) indirectos: transformación
mediada por Agrobacterium
tumefaciens: unvector
biológicoque participade la
transferencia (sólo para
dicotiledóneas)
b)directos: por distintos
mecanismosfísicosse introduce
el ADNenlacélula:
electroporaciónde protoplastos,
polietilenglicol, biolística

32. PLANT
ASTRANSGENICAS
Resistencia a herbicidas: se basa en la transferencia de genes de
resistencia presentes en bacterias o vegetales como la petunia. Ejemplos:
soja resistente a glifosato, colza resistente a glufosinato y algodón
resistentea glifosato, glufosinato y bromoxinil, tabaco.
Resistencia a plagas y enfermedades: resistencias a virus en tabaco,
patata, tomate, pimiento, calabacín, soja, papaya, alfalfa y albaricoquero,
resistenciaa insectos en maíz Bt, algodón, batata
Mejora de las propiedades nutritivas y organolépticas: en el tomate se
ha logrado mejorar la textura y la consistencia impidiendo el proceso de
maduración, al incorporar un gen que inhibe la formación de pectinasa,
enzimaquese activa en el curso delenvejecimientodelfruto.
TransgénicosenArgentina,: soja
maíz
algodón

33. 1er árbol transgénico:
Populus nigra
transformadoconlosgenesde resistenciaa insectos.
Manipulacióngenética enel
sector forestal
Serealizaenal menos35países,yselimitan
esencialmente a lasespeciesPopulus, Pinus,
Liquidambar y Eucalyptus.

34. BIBLIOGRAFIARECOMENDADA
Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II
Editores:
GabrielaLevitus, VivianaEchenique,
Clara Rubinstein, Esteban Hopp
yLuisMroginski
EdicionesINTA
http://intainforma.inta.gov.ar/wp-content/uploads/2010/09/bio_WEB.pdf