Antibiograma

1. ANTIBIOGRAMA

2. Estudio complementario de
laboratorio que permite evaluar la
sensibilidad in vitro de una
bacteria frente a un determinado
antimicrobiano

3. El antibiograma es un estudio complementario, cuyo principal objetivo es
evaluar en el laboratorio la respuesta in vitro de una bacteria a uno o varios
antimicrobianos.
Esta indicado para todo microorganismo, capaz de producir un proceso
infeccioso que requiera tratamiento antibiótico, de tal manera de seleccionar
aquellos que sean realmente activos contra el microorganismo causal; esto
permitirá establecer un manejo más confiable, evitando su uso
indiscriminado y la posibilidad de seleccionar cepas bacterianas resistentes.
También es necesario cuando el agente causal es de una variedad que suele
ser resistente o se trata de casos donde, la bacteria infectante, muestra
resistencia a los antimicrobianos usados habitualmente para su tratamiento.
Debido al tiempo que demanda el trabajo en el laboratorio, es importante
tomar la muestra antes de iniciar cualquier medicación y mientras se
aguardan los resultados, iniciar la antibioticoterapia más adecuada según la
evaluación clínica, para luego modificar la terapia inicial según sea necesario.

4. Métodos utilizados:
Método de Kirby-Bauer (difusión
en agar)
Exclusivo para gérmenes de
crecimiento rápido, aerobios
y sin exigencias nutricionales
especiales

5. Dentro de los métodos tenemos: pruebas de dilución en caldo o agar, se
pueden utilizar para medir cuantitativamente la actividad "in vitro" de un
antimicrobiano frente a un cultivo bacteriano. Estos métodos se basan en la
preparación de una serie de tubos o placas con caldo o agar,
respectivamente, a los cuales se les agrega el antibiótico en distintas
concentraciones. Luego se inoculan cada uno de los tubos o placas con una
suspensión estandarizada del microorganismo en estudio. Las pruebas se
examinan después de incubar a 37ºC por 24 horas y se determina la
concentración inhibitoria mínima (CIM) del antimicrobiano frente al
microorganismo ensayado, es decir, la menor cantidad de antibiótico capaz
de inhibir el desarrollo del mismo in vitro. Éstas técnicas tienen la desventaja
de ser costoso y lleva mucho tiempo realizarlo, por lo que se utiliza para
trabajos de investigación o en laboratorios especializados.
Las pruebas de difusión (Método de Kirby-Bauer) permiten medir, en un
medio sólido, la presencia o ausencia de un halo de inhibición producido por
el antibiótico sobre el crecimiento bacteriano. Es la técnica más
ampliamente utilizada, por ser económica, sencilla y satisfactoria para la
práctica clínica. Útil para microorganismos de crecimiento rápido, aerobios y
sin exigencias nutricionales. Y es un método de tipo cualitativo, permitiendo
clasificar la bacteria como sensible, intermedio y resistente respecto a uno o
varios antimicrobiano ensayados.

6. MEDIO DE CULTIVO
AGAR MÜLLER-HINTON
Medio estandarizado, venta
comercial
Bajo contenido de inhibidores de
sulfonamidas, trimetoprima y
tetraciclinas
Crecimiento satisfactorio para
patógenos no exigentes
Gran experiencia que avala este
método

7. El agar Mueller Hinton demostró ser, de todos los medios disponibles, el
mejor para las pruebas de sensibilidad de rutina de bacterias no fastidiosas,
siendo incluso recomendado por el Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI)
 Muestra buena reproducibilidad de los resultados de sensibilidad entre
distintos lotes comercializados, lo que ayuda a una estandarización entre
laboratorios.
Tiene baja cantidad de inhibidores: por ejemplo no contiene timina o
timidina que son inhibidores de sulfamidas y trimetoprima. Además esta
regulada la concentración de cationes divalentes que en caso contrario
alterarían los resultados, como ser la variación de Ca++ y Mg++ , que afecta los
halos de inhibición para aminoglucósidos y tetraciclinas en Pseudomonas
aeruginosa, el contenido excesivo de cationes produce halos de falsa
resistencia a este microorganismo.
 Permite buen crecimiento de la mayoría de los patógenos.
 Se tiene gran cantidad de datos y experiencia sobre pruebas de
sensibilidad realizadas con este medio.

8. DISCOS DE ANTIBIOTIOS

9. Los disco consisten en papel de filtro impregnados con los diferentes
antibióticos, a una concentración conocida.
En el mercado se pueden adquirir monodiscos, encontrándose prácticamente
todos los antimicrobianos que existen en el mercado, debiendo
seleccionarlos en base al microorganismo con el que se va a realizar el
ensayo y sitio de infección del paciente. Los multidiscos por su parte ya están
preseleccionados para Gram + y Gram – y vienen unidos.
Cada disco presenta una inicial o un número que identifica al antibiótico y
vienen en frascos cerrados, que contienen en el fondo, HONa o perlas de
sílica gel para contrarrestar la humedad.

10. CULTIVO PURO
Cada vez que recibimos una muestra en el laboratorio, primero
se deben aislar e identificar cada uno de los microorganismos
potencialmente patógenos (ya sea uno o más) y realizar un
antibiograma para cada una de las bacterias aisladas, NUNCA
se realiza directamente de la muestra recibida.
Por lo que es necesario, una vez identificados, obtener un
cultivo puro o monomicrobiano para la realización de la
técnica.

11. 1. Preparación del inóculo
Suspensión del germen en un
diluyente a partir de un cultivo puro o
monomicrobiano
Método de la TURBIDIMETRIA
NEFELOMETRO DE MAC FARLAND

12. Uno de los pasos más importantes es la preparación del inóculo. Esto
involucra la selección de colonias para la prueba, su suspensión en un
diluyente (solución fisiológica o agua destilada estéril) y la estandarización
de la suspensión. Primero, tomar del cultivo puro y con un ansa rulo varias
colonias del microorganismo a analizar. Si se selecciona entre 3–5 colonias,
en vez de solo una, las probabilidades de detectar resistencia son mayores;
luego se desprenden en el diluyente.
La turbidez de la suspensión debe ser igual al estándar 0,5 de la escala de
McFarland (lo que corresponde a aproximadamente 1,5 X 10 8 gérmenes por
mililitro).
Se puede comparar la turbidez de las suspensiones colocando los tubos
frente a un papel blanco o una pared con líneas negras, para poder evidenciar
la turbidez y mejorar la comparación.

13. 2) Siembra por diseminación

14. Antes de la siembra se debe agitar la suspensión del microorganismo para
asegurarnos que está bien mezclada. Luego, se sumerge un hisopo de
algodón estéril en la suspensión. Presionar el hisopo contra las paredes del
tubo, por encima del nivel líquido, a fin de escurrir el exceso de inóculo.
Se realiza la siembra en tres direcciones empezando en la parte superior de
la placa inocule la superficie con el hisopo. Cubra toda la placa pasando el
hisopo de ida y vuelta de un borde al otro. Rote la placa aproximadamente
60º y repita el procedimiento. Rote otra vez la placa 60º y repita por tercera
vez para finalmente hisopar también la circunferencia de la placa. Esto
garantizará que el inóculo sea distribuido homogéneamente.

15. 3) Colocación de los discos

16. Luego de la siembra, dejar la tapa abierta de la placa unos minutos para
permitir que se absorba el exceso de humedad superficial (SIEMPRE
TRABAJANDO CERCA DEL MECHERO PARA ASEGURAR LA ESTERILIDAD).
Posteriormente se colocan los discos sobre la superficie del agar, con pinza
estéril o dispensador . Presione cada disco firmemente para asegurar el
contacto completo con la superficie de agar, esto es importante para evitar
que terminen en la tapa de la placa después de la incubación. Otra cosa
importante a tener en cuenta, inmediatamente el disco toca la superficie del
agar ya comienza la difusión radial del antibiótico desde el disco hacia la
superficie del agar, por lo que una vez en contacto no se pueden levantar y
reubicarlos nuevamente.

17. Al colocar los discos siempre tener en cuenta que no deben
situarse a menos de 15 milímetros del borde de la placa, y
han de estar distribuidos de forma que no se produzca
superposición de los halos de inhibición. La distancia entre
ellos debe ser de 20 milímetros. Lo ideal es la aplicación de 7
discos por placa, de tal manera de poder apreciar
perfectamente los halos de cada uno.

18. A 37° C en estufa de cultivo, durante
18 – 24 hs.

19. HALOS DE INHIBICIÓN
Factores que influyen en la formación
del halo:
•Capacidad del antibiótico de difundir en el
medio
•Sensibilidad del germen a ese antibióticos
•Concentración del antibiótico en el disco

20. 5) Lectura de los halos
Después de la incubación se leen los antibiogramas, para ello
nos valemos de una regla milimetrada, y medimos el
diámetro del halo de borde a borde, pasando por el centro
del disco. Si uno de los bordes no fuera neto, o dos halos se
encontraran superpuestos, se mide desde un borde al centro
del disco y se multiplica por 2.
NUNCA por la sola presencia del halo se puede determinar
que un microorganismo es sensible a ese antibiótico.

21. 6) Interpretación de los halos

22. Para poder informar los resultados, se deben comparar los diámetros
obtenidos con los diámetros establecidos para cada antibiótico en las tablas
de interpretación internacionales. Estas tablas son elaboradas por
organismos como el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio
(CLSI) que realizan comparaciones entre métodos de dilución y difusión,
permitiendo de esta manera establecer la CIM para cada antibiótico y su
correspondiente diámetro de inhibición, dando lugar a la creación de
referencias estándar (siempre que la técnica utilizada por cada laboratorio
siga los lineamientos establecidos por el instituto de referencia).
Categorías de interpretación: Sensible indica que la infección ocasionada
por la cepa analizada puede tratarse de forma adecuada empleando las
dosis habituales del antimicrobiano, en función del tipo de infección y de la
especie considerada.
Intermedio en este caso la eficacia clínica se da en aquellas localizaciones
en las que se alcanzan altas concentraciones del antibiótico (p. ej. orina) o
cuando se emplean dosis más elevadas de lo habitual.
Resistente cuando el microorganismo no se inhibe por las concentraciones
habitualmente alcanzadas en sangre/tejidos del correspondiente
antimicrobiano y existen mecanismos de resistencias específicos para el
antibiótico estudiado, sin presentar una adecuada respuesta clínica cuando
se ha usado como tratamiento.

24. En las imágenes podemos ver los distintos casos que se pueden llegar a
observar en la placa. Por ejemplo:
Nº1: Colonias dentro de la zona de inhibición, pueden deberse a un cultivo
mixto y no monomicrobiano (como debía ser) o tratarse de una subpoblación
resistente de la bacteria analizada; conviene volver a identificarlas y realizar
otra vez el ensayo de sensibilidad antimicrobiana.
Nº2: La NO formación de halo, en estos casos si es posible ya con la sola
observación determinar que la bacteria es resistente a ese antibiótico; lo
contrario sucede cuando están presentes, donde no interesa el tamaño o su
sola observación sino que requieren ser comparados e interpretados por las
tablas de referencia para poder definir si la bacteria es sensible, intermedia o
resistente con respecto al antibiótico.
Nº3: Presencia de grandes halos, por estos casos es que es importante
respetar las distancias entre los discos y con el borde y no sobrecargar la
placa, debido a que puede resultar muy dificultosa la medición correcta de
los mismos.