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Bacterias - Marcelo Cevallos UCE

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Bacterias - Marcelo Cevallos UCE

Son organismos procariotas unicelulares, que se encuentran en casi todas las partes de la Tierra. Son vitales para los ecosistemas del planeta. Pueden observarse directamente al microscopio de campo claro. Sin embargo, debido al bajo contraste entre las células y su entorno, estos procedimientos se utilizan en ocasiones muy limitadas, como por ejemplo para la observación de la movilidad bacteriana.

Son organismos procariotas unicelulares, que se encuentran en casi todas las partes de la Tierra. Son vitales para los ecosistemas del planeta. Pueden observarse directamente al microscopio de campo claro. Sin embargo, debido al bajo contraste entre las células y su entorno, estos procedimientos se utilizan en ocasiones muy limitadas, como por ejemplo para la observación de la movilidad bacteriana.

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Bacterias - Marcelo Cevallos UCE

  1. 1. Bacterias Tinción
  2. 2. Las bacterias  Son organismos procariotas unicelulares, que se encuentran en casi todas las partes de la Tierra. Son vitales para los ecosistemas del planeta. Pueden observarse directamente al microscopio de campo claro. Sin embargo, debido al bajo contraste entre las células y su entorno, estos procedimientos se utilizan en ocasiones muy limitadas, como por ejemplo para la observación de la movilidad bacteriana.
  3. 3. Tinción  Es un método sencillo para incrementar el contraste entre la célula y su entorno y por lo tanto contribuye a mejorar la imagen observada. Las técnicas de tinción con diversos colorantes facilitan la observación al aumentar notablemente el contraste.
  4. 4. Tinción simple  Se fundamenta en la afinidad que va a tener la pared bacteriana por un colorante. Técnica de decantación (procedimiento para separar dos sustancias mezcladas) en la que se hace uso de los puentes de tinción, en los que se colocan los portaobjetos con las preparaciones secas y fijadas. Se caracteriza por utilización de un solo colorante para el procedimiento. Imagen tomada con el objetivo de 40X (Resolución de 400X)
  5. 5. Técnica • Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol). • Se usa un solo colorante para teñir la pared bacteriana y observar así su visualizar estructuras puesto que rara vez se tiñen. Escherichia coli Staphylococcus aureus Bacillus cereus
  6. 6. Tinción Gram  También llamada tinción diferencial, se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian en función de los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitución química. Función: permite la agrupación de las bacterias de acuerdo a su diferente afinidad tintorial, en dos grandes bloques, bacterias grampositivas y bacterias gramnegativas. Proceso.- La secuencia de la tinción es la siguiente: • el Frotis fijado con calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal • Se lava con agua, se cubre con solución Yodada durante 1 min • se lava de nuevo con agua. • decolorar con mezcla alcohol etílico/acetona. • Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste) durante 20 seg. • Lavar y secar.
  7. 7. Gram positivo:  Poseen una pared celular gruesa constituida por peptidoglicano, pero no cuentan con membrana celular externa. Al contener una gran cantidad de peptidoglicano, retienen con mayor fuerza este complejo de tinción. Tinción de Gram de Bacillus cereus (bacilos gram positivos). Microscopía de campo claro (100x). Observación: En bacterias gram positivas la gruesa capa de peptidoglucano con abundantes entrecruzamientos parece contribuir a la retención del colorante fundamental, cristal violeta.
  8. 8. Gram negativo:  La pared celular de las bacterias Gram negativas está constituida por una capa fina de peptidoglicano y una membrana celular externa. Tinción de Gram de Escherichia coli (bacilos gram negativos). Microscopía de campo claro (100x). Observaciones: En bacterias gram negativas la delgada capa de peptidoglucano junto con la abundancia de lípidos en la membrana externa de la pared celular incrementan la porosidad.
  9. 9. Tinción de endoesporas.-  Metodología utilizada para colorear las estructuras de resistencias de algunas bacterias.  Los principales géneros bacterianos son: Bacillus y Clostridium. Estos poseen especies patógenas para el ser humano. Fundamento. • Las esporas no se tiñen con las coloraciones convencionales, ya que poseen una pared muy gruesa y su composición impide la entrada a la mayoría de colorantes. • Al observar la espora de afuera hacia adentro, podemos observar: el exosporium, la cutícula, la corteza compuesta por peptidoglicano y finalmente la pared de la base que protege al protoplasto. • La espora contiene un 15% de calcio y ácido dipicolínico, por lo que la mayoría de técnicas de coloración se basan en la aplicación de calor. • Cuando la espora queda teñida, no puede eliminar el colorante.
  10. 10. Técnicas de coloración.  Actualmente, existen varios métodos de coloración que nos ayudan a atravesar la estructura gruesa de la espora para poder teñirla.  Se debe tener un cultivo puro de la muestra que se desea estudiar.  Se expone este cultivo a temperaturas extremas durante 24 horas. Si se expone durante mucho tiempo, las endosporas saldrán del bacilo y solo se podrán observar las exosporas.  Una vez acabado este tiempo, se colocan unas gotas de solución fisiológica estéril sobre un portaobjetos y se toma una pequeña porción del cultivo.  Finalmente, se deja secar, se fija al calor y se tiñe siguiente los pasos de cualquier técnica que escojamos.
  11. 11. Técnica de Dorner.  Preparar una suspensión del microorganismo esporulado en agua destilada y agregar la misma cantidad de fucsina fenicada de Kinyoun filtrada.  Colocar el tubo en un baño con agua en ebullición entre 5 y 10 minutos.  Mezclar una gota de la suspensión con una gota de solución acuosa de nigrosina al 10%. Esta solución debe estar hervida y filtrada y la mezcla se debe realizar sobre un portaobjetos limpio.  Extender la mezcla y secar rápidamente con calor suave y examinarla con objetivo de 100X.  Como resultado, las esporas se tiñen de un color rojo y las células bacterianas son casi incoloras en contraste con su fondo gris oscuro. Nigrosina.
  12. 12.  Hacer un extendido con una suspensión del microorganismo esporulado sobre un portaobjetos y fijar el calor.  Cubrir el portaobjetos son una solución acuosa de verde de malaquita al 5%.  Con la ayuda del mechero Bencen, calentamos la mezcla hasta que se desprendan los vapores. Repetimos esta acción entre 6 y 10 minutos.  Cubrir el portaobjetos con safranina acuosa al 0.5% durante 30 segundos.  Como resultado, las esporas presentan un color verde y los bacilos se tornan rojos.  Si el cultivo es demasiado joven, existe el inconveniente de que las endosporas no se tiñan bien, por lo que se presentas claras o incoloras. Por ello, es recomendable utilizar cultivos de 48 horas de incubación. Verde de malaquita. Técnica de Shaeffer–Fulton
  13. 13. Técnica de Möeller  Cubrir el frotis con cloroformo durante 2 minutos.  Pasado este tiempo, descartamos el cloroformo.  Cubrir con ácido crómico al 5% durante 5 minutos. Lavar con agua destilada.  Cubrir la lámina con carbol fucsina-fenicada y exponer a la llama del mechero de Bunsen hasta que se desprendan los vapores. Repetir esta acción durante 10 minutos y lavar.  Usar ácido clorhídrico para decolorar durante 20 o 30 segundos y lavar con agua destilada.  Contra teñir cubriendo la lámina con azul de metileno por 5 minutos y lavar con agua destilada.  Dejar secar y observar la muestra en el microscopio.  Como resultado, las esporas presentan un color rojo mientras que los bacilos son azules. Carbol fucsina y azul de metileno.
  14. 14. Usos. La coloración de esporas brinda información útil que facilita la identificación del patógeno y estos datos pueden informar sobre la especie involucrada dentro de un determinado género bacteriano. Ejemplo.La endospora de Clostridium tetani es terminal y deforma al bacilo, dándole un aspecto de un palillo de tambor.
  15. 15. Tinción de flagelos  Dado que los flagelos son demasiado delgados, es muy complejo visualizarlos incluso con la ayuda de un microscopio. Por ello, es necesario utilizar una técnica de montura húmeda para teñir flagelos bacterianos y es útil cuando el número y la disposición de flagelos son necesarios para la identificación de especies de bacterias móviles.  Los procesos de tinción de flagelos requiere el uso de un mordiente para que la mancha se adhiera a los flagelos, esto permite su visualización. Tipos de flagelos • Monotricas. • Lofotricas. • Anfitricas. • Peritricas.
  16. 16. Método de tinción de kodaka  Consisten en suspender las bacterias y colocar una gota de colorante en el borde del portaobjetos y se deja en reposo durante 10 minutos a temperatura ambiente.  El colorante entra en la preparación y tiñe los flagelos, que se podrán observar fácilmente en la zona del colorante.  Para realizar la tinción de flagelos, las bacterias deben cultivarse en medios que no posean carbohidratos para evitar efectos negativos de la acidez y estos cultivos deben ser jóvenes.  Este método de tinción aumenta el diámetro de los flagelos gracias al colorante.
  17. 17. Método de tinción de Leifson  Se preparan las laminillas previamente limpiadas con dicromato o ácido nítrico, calentadas y enjuagadas con alcohol.  Se prepara un frotis con bacterias en medio líquido. Inclinamos la laminilla desde una esquina para obtener una película delgada.  Cuando esté seca, colocamos una solución de fucsina básica durante 10 minutos. Después lavamos y dejamos secar.  Los flagelos se tiñen de rojo y presentan diferente disposición. Fucsina.
  18. 18. Método de tinción de Gray  Se utiliza un mordiente que cubre la superficie del flagelo, lo que, aparentemente, aumenta su grosor y proporciona una capa de material teñible para que sea más fácil captar el colorante.  Con ayuda de un mechero, pasamos el portaobjetos sobre la llama de 3 a 4 veces.  Preparar una suspensión de la bacteria en agua estéril una vez que el portaobjetos se haya enfriado y colocamos 5 gotas de la suspensión, distribuyéndolas 4 en las esquinas y 1 en el centro.  Dejar secar al aire y cubrir con el mordiente durante 10 minutos. Lavar con agua con cuidado de no retirar la solución y sobre esta, colocar solución carbol-fucsina durante 5 a 10 minutos. Lavar con agua y dejar secar al aire.  Al observar, se podrán distinguir los flagelos de color rojo. Carbol-fucsina.
  19. 19. Observación en el microscopio El microscopio es de gran importancia para la observación e identificación de estructuras y características de los tejidos en los microorganismos. Las tinciones nos ofrecen una ayuda adicional a la simple observación la morfología.
  20. 20. Para observar bacterias de una muestra en el microscopio se utiliza el objetivo de inmersión en máximo aumento. Para con este objetivo, colocamos la preparación con el aceite en la platina del microscopio.
  21. 21. Técnicas de Observación En Microscopio  OBSERVACIÓN A CAMPO OSCURO  OBSERVACIÓN CON CONTRASTE DE FASES  OBSERVACION CON FLUORECENCIA
  22. 22. Observación a Campo Claro  Es la técnica de microscopia más simple. En esta técnica la luz pasa a través o es reflejada por la muestra, sin alteraciones.  Toda la luz desde el espécimen y alrededores es colectada por el objetivo para formar una imagen contra fondo totalmente brillante.  Utilizada en patología e histología vegetal y animal.
  23. 23. Observación a Campo Oscuro  Técnica de contraste, sin luz directa.  Muestras transparentes y sin tinción.  Los rayos de luz forman la imagen  Adecuado para la observación de células y organismos.
  24. 24. Observación con Contraste de Fases  El resultado de la imagen será el fruto del paso de la luz a través de la muestra  La luz sin desviar, difractada y colectada por el objetivo es separada por un plato de fases  Esta técnica se usa en observación de células vivas o en estudio de materiales con láminas muy finas.
  25. 25. Observación con Fluorescencia  Se iluminan por rayos de una determinada longitud de onda  Determinamos esta técnica de observación como indirecta.  Utilizada para detectar sustancias determinada (Vitamina A)  Utilizada en el análisis biomolecular.
  26. 26. Colorantes catiónicos  Son aquellos que en solución forman iones  El grupo hidrófobo de la molécula, cargado positivamente  Tonalidades vivas y fuertes  Inestables a la luz por lo que no se emplean en artículos que requieran una gran fijeza del color  No se fijan directamente a las fibras por lo que requieren el empleo de un mordiente  Cargados negativamente, basofílicos Cristales de violeta Azul de metileno Safranin a
  27. 27. Colorantes aniónicos  Atraídos por componentes celulares que son básicos.  Argados positivamente; acidófilos.  Afinidad por las estructuras alcalinas .  Son derivados sulfónicos en forma de sales sódicas de compuestos azoicos, de baja masa molecular.  Poca afinidad por la fibra.  Constituidos por una cadena alquílica lineal o ramificada que va de 10 a 14 átomos de carbono.  El Verde Rápido FCF, que preferentemente tiñe componentes tales como la celulosa y el citoplasma. Eosin a Fucsina ácida Rojo Congo
  28. 28. Tipos de microscopios  Microscopios según el sistema de iluminación  Microscopio electrónico  Microscopio de luz ultravioleta  Microscopio de luz polarizada  Microscopio de fluorescencia  Microscopios según el número de lentes  Microscopios según la transmisión de la luz  Microscopios según el número de oculares  Microscopios digitales  Microscopio estereoscópico
  29. 29. Microscopios según el sistema de iluminaciónMicroscopio óptico En el microscopio óptico la muestra es iluminada mediante luz visible. Esto significa que existe un foco de luz apuntando hacia la muestra. Microscopio electrónico En el microscopio electrónico la muestra no es iluminada con luz sino que se utilizan electrones. Los electrones impactan contra la muestra dentro de una cámara de vacío.
  30. 30. Microscopio de luz ultravioleta  Este tipo de luz tiene una longitud de onda más corta que la luz visible utilizada en los microscopios ópticos. La ventaja principal de utilizar esta técnica es que puede alcanzarse una resolución mejor que con luz visible.
  31. 31. Microscopio de luz polarizada  Este microscopio es en realidad un tipo de microscopio óptico al que se la han añadido dos polarizadores. Esto significa que la onda de luz utilizada para observar la muestra tiene una dirección de oscilación concreta. Este tipo de microscopio es muy útil para observar estructuras cristalinas de rocas y minerales.
  32. 32. Microscopio de fluorescencia  Este microscopio permite observar sustancias que emiten luz propia cuando son iluminadas con una longitud de onda determinada. Para ello la muestra es habitualmente iluminada con una lámpara xenón o con una lámpara de vapor de mercurio. Estos microscopios incorporan además filtros de luz para aislar la luz correspondiente a la muestra.
  33. 33. Microscopios según el número de lentes Microscopio simple  Microscopio compuesto Este tipo de microscopio dispone de una única lente y es más habitualmente conocido como lupa. Aún así, con un microscopio simple pueden conseguirse grandes aumentos. Este tipo de microscopio es aquél que dispone de por lo menos dos lentes. Este es el caso más habitual en todos los microscopios modernos.
  34. 34. Microscopios según la transmisión de la luz Microscopio de luz transmitida Microscopio de luz reflejada En este tipo de microscopio la luz atraviesa la muestra. Para esta clase de microscopios es necesario preparar la muestra cortándola en láminas muy finas. En este caso la luz ilumina la muestra y parte de esta es reflejada y dirigida al objetivo. De este modo es necesario iluminar la muestra desde la parte superior de la platina. Este tipo de microscopía es utilizada para examinar materiales opacos como pueden ser estructuras metálicas, materiales cerámicos, etc.
  35. 35. Microscopios según el número de ocularesMicroscopio monocular Este tipo de microscopio dispone de un solo ocular a través del cual se puede observar la muestra. Es el tipo más sencillo y es ideal para aficionados a la microscopía o para alguien que se introduce en este campo Microscopio binocular Disponen, como indica su nombre, de dos oculares. Esto permite observar la muestra simultáneamente con los dos ojos resultando en una mayor comodidad para el usuario. Este es el tipo de microscopio más utilizado en los laboratorios de investigación Microscopio trinocular El microscopio trinocular está equipado con dos oculares para observar la muestra además de un tercer ocular para conectar una cámara.
  36. 36. Microscopios digitales Los microscopios digitales son aquellos que capturan una imagen digital de la muestra. Esto se consigue conectando una cámara digital en lugar del ocular Microscopio estereoscópico El microscopio estereoscópico es un tipo de microscopio que permite observar la muestra de forma tridimensional. Estos microscopios están equipados siempre con dos oculares.

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