Este documento resume las principales herramientas diagnósticas para la detección de norovirus en alimentos. Las técnicas moleculares como RT-PCR y RT-qPCR son sensibles pero requieren una extracción eficiente del virus. Los métodos inmunológicos como ELISA tienen menor sensibilidad. Un método prometedor es PAN-Trap que usa proteína A para capturar norovirus usando anticuerpos o HBGAs. La detección colorimétrica permite detección directa en la muestra sin extracción. La detección in situ como bio

1. TRABAJO DE FIN DE GRADO
GRADO EN BIOTECNOLOGÍA
HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS DE NOROVIRUS EN ALIMENTOS
Marina Mallol Ballester
Valencia, junio 2019
Tutora: Noelia Carmona Vicente
Departamento de Microbiología y Ecología

2. INTRODUCCIÓN

3. INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
► Enfermedades de transmisión alimentaria
“Las enfermedades transmitidas por alimentos
causan que 1 de cada 10 personas enfermen cada
año y 420.000 muertes”
GASTROENTERITIS
enfermedad más común transmitida
por alimentos
• Proceso inflamatorio del tracto gastrointestinal
• Síntomas: diarrea, vómitos, dolor abdominal y calambres
• Etiología: bacteriana, parasitaria (protozoos), no infecciosa o vírica
NOROVIRUS
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos

4. ► Norovirus Son la causa más común de gastroenteritis en el mundo
Norwalk, 1972
Ohio, EEUU
• Primera descripción
• Virus entéricos pertenecientes a la familia Caliciviridae
• No envueltos e icosaédricos
• Aspecto redondo y de pequeño tamaño (~ 25 nm de diámetro)
• 5 genogrupos con 29 clusters  infecciones en humanos GII > GI > GIV
• Morfología del virus
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES

5. ► Norovirus
• Genoma
• Cadena sencilla de ARN de polaridad positiva de unas 7kb
• ORF1  poliproteína procesada en 6 proteínas no estructurales
• ORF2  proteína estructural principal de la cápside, VP1
• ORF3  proteína estructural minoritaria de la cápside, VP2
• Extremo 5’  proteína unida al genoma, viral protein genoma linked, Vpg
• Extremo 3 ’  poliadenilado
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
(Todd, 2019)
Proteína Función
p48 (N-term)
Formación del complejo de
replicación
NTPasa Helicasa/NTPasa
p22
Formación del complejo de
replicación
VPg
Proteína unida al genoma
implicada en la traducción y
replicación
3CLPro Proteasa
RdRp ARN polimerasa ARN-dependiente
VP1 Proteína de la cápside principal
VP2 Proteína de la cápside minoritaria
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
ARN genómico y subgenómico de NoV

6. ► Norovirus
• Estructura proteica
• Cápside formada por 180 copias de VP1 organizadas en 90 dímeros
• Protección e interacción con el huésped
• VP1 posee dos dominios: S y P
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
(Mawatari, 2014)
• Dominio S (shell) parte interna de la cápside
• Dominio P (protunding)
• P1: formación dímero - unión entre S y P2
• P2: región más expuesta de la superficie - interacciones
celulares - alta variabilidad
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES

7. ► Norovirus
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
(Adaptado de Bosch et al., 2016)
Agente
infeccioso
Transmisión
ALIMENTOS Y AGUA CONTAMINADOS
VÍA FECAL-ORAL
CONTACTO DIRECTO
Huésped
susceptible
FÓMITES
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES

8. ► Norovirus
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
(Adaptado de Bosch et al., 2016)
Agente
infeccioso
Transmisión
ALIMENTOS Y AGUA CONTAMINADOS
VÍA FECAL-ORAL
CONTACTO DIRECTO
Huésped
susceptible
FÓMITES • Receptores HBGA
• Polimorfismo en la expresión en
humanos
• Fenotipo no secretor
RESISTENTES
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES

9. ► Norovirus
• Factores que contribuyen a una elevada incidencia
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
(Adaptado de Bellido et al., 2007)
Características Observación Consecuencias
Baja dosis infectiva < 100 partículas virales
Permite transmisión (mediante gotitas,
aerosoles) persona a persona, propagación
secundaria o transmisión por manipuladores
Expulsión viral
prolongada en
asintomáticos
< 2 semanas
Aumenta el riesgo de propagación secundaria o
problemas respecto al control de
manipuladores de alimentos
Estabilidad ambiental < 10 ppm cloro, congelación y calentamiento a
60ºC
Difícil de eliminar del agua contaminada; el
virus se mantiene en hielo y en ostras al vapor
Pérdida de inmunidad
duradera
Posibilidad de reinfecciones
La infección en la infancia no protege de la
enfermedad en adultos; dificulta el desarrollo
de una vacuna con protección para toda la vida
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES

10. OBJETIVOS Y METODOLOGÍA

11. ► Objetivo del presente trabajo
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
Revisión bibliográfica del estado de la técnica de las herramientas para la detección de NoV en alimentos:
• Conocer la incidencia y repercusión de las enfermedades causadas por NoV.
• Comprender la naturaleza del NoV humano.
• Profundizar en los métodos diagnósticos de NoV en alimentos.
• Destacar los puntos fuertes y débiles de cada una de las técnicas.
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
► Metodología
• Bases de datos del NCBI (PubMed)
• Palabras clave “norovirus”, “norovirus detection”, “norovirus foodborne”
• Revisión de un total de 105 artículos

12. HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS

13. ► Técnicas moleculares
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA RT - PCR RT - qPCR
secuenciación del genoma
No permite diferenciar virus
morfológicamente parecidos
X

14. ► Técnicas moleculares
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA RT - PCR RT - qPCR
secuenciación del genoma
Gran cantidad de primers dirigidos a la
secuencia de Norwalk
Regiones conservadas del genoma:
• ARN polimerasa viral
• Cápside
X
Subestimación de la presencia del virus

15. ► Técnicas moleculares
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA RT - PCR RT - qPCR
secuenciación del genoma mejora de la técnica
• Curva estándar control  detección inhibición
• Automatización de reacción  reproducibilidad
• Cantidad de ARN a tiempo real  amplificación y
detección en un solo paso
¿Cómo?
• Agente intercalante SYBR Green
• Sonda Taqman

16. ► Limitaciones técnicas moleculares
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
• Sensibles a inhibidores presentes en alimentos
• Requiere una extracción eficiente del virus de la matriz alimentaria  paso crítico
• Equipos de coste elevado
• Experimentadores con conocimientos específicos
• No aportan información sobre el potencial infeccioso  presencia de virus ≠ activos

17. Determinación de la viabilidad de las partículas
víricas:
• Integridad del genoma
• Estabilidad de la cápside

18. ► Métodos inmunológicos
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
ha permitido la producción
La obtención de
VLP
virus-like particles
Anticuerpos frente a NoV
MÉTODOS INMUNOENZIMÁTICOS
desarrollo
• Falta de sensibilidad para detección de las bajas concentraciones en alimentos
• La alta y cambiante variabilidad de los NoV requiere una elevada producción de anticuerpos para detectar la
mayor cantidad de cepas posible
• ELISA
• Inmunocromatografía
• Inmuno PCR (ELISA + PCR)
SENSIBILIDAD
ESPECIFICIDAD

19. ► Métodos inmunológicos
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
Han sido desarrollados métodos basados en la interacción antígeno-anticuerpo con
resultados prometedores
Mejorar la extracción de norovirus de las matrices alimentarias
HBGA de mucinas gástricas
porcinas (PGM)
Separación
inmunomagética
PAN-Trap
Los HBGA de mucinas
conjugadas a cuentas
magnéticas capturan los
NoV
Anticuerpos de NoV +
cuentas magnéticas
(Dynabeads)
Todos seguidos de
RT-PCR
 (Confirmación de detección
específica de NoV)

20. ► Métodos inmunológicos: PAN-Trap
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
Células de Staphylococcus
aureus (alta densidad en
proteína A)
(Saito et al., 2012)

21. ► Métodos inmunológicos: PAN-Trap
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
(Saito et al., 2012)

22.  Anticuerpos anti-NoV pueden sustituirse por inmunoglobulinas humanas para la captura
 Corto proceso de incubación
 Materiales sencillos
 Emulsión no necesariamente clara
 Reactivos relativamente baratos
 Consigue la extracción de 50 mL de emulsión en una solución de 50 μL
✕ La amplificación puede verse afectada por la presencia de carbohidratos (adición de enzimas hidrolíticos)
✕ Presencia de ARN de Staphylococcus aureus problema para la RT-PCR (oligo-dT con nt específicos de NoV)

23. ► Detección colorimétrica
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
¿Qué es la HRPzima?
(Loic S., 2016)

24. ► Detección colorimétrica
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
Sonda de ADN
Región
protectora
HRPzima
Región
espaciadora
Secuencia NoV
(Batule et al., 2018)

25. ► Detección colorimétrica
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
 Mayor sensibilidad que los métodos basados solamente en amplificación
 Límite de detección de 1 copia de genoma de NoV/mL
 Detección a “ojo desnudo”
 Amplificación directamente sobre la muestra (no se necesita la extracción  paso delicado)
 Se podría desarrollar in situ en caso de un termociclador portátil

26. ► Detección colorimétrica
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
 Mayor sensibilidad que otros métodos basados solamente en amplificación
 Límite de detección de 1 copia de genoma de NoV/mL
 Detección a “ojo desnudo”
 Amplificación directamente sobre la muestra (no se necesita la extracción  paso delicado)
 Se podría desarrollar in situ en caso de un termociclador portátil

27. ► Detección in situ
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
Biosensor
electroquímico
Sistemas
microfluídicos
Detección con
aptámeros
Electrodo de oro conjugado
a concavalina A Detección basada en aptámeros
utilizando un sistema microfluídico
en soporte de papel
Aptámero
inmovilizado en
electrodo serigrafiado
de carbón

28. ► Detección in situ
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
BIOSENSORES

29. ► Detección in situ
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
• Biosensor electroquímico basado en concavalina A
(Hong et al., 2015)

30.  La concavalina como agente de captura ofrece:
 Alta sensibilidad
 No se requiere grandes procesamientos de la muestra  funcionamiento demostrado en muestras
ópticamente turbias
 Detección rápida (1h) e in situ

31. ► Detección in situ
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
SISTEMAS MICROFLUÍDICOS
 Portátil, bajo coste y rápido
 Poca cantidad de muestra requerida
 La muestra recorre corta distancia  rapidez
 Soporte de papel  biodegradable
 difusión muestra (no necesario aporte de energía)
✕ Atención con la evaporación de la muestra
(Neethirajan et al., 2017)

32. ► Detección in situ
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
APTÁMEROS
FUNCIONAMIENTO DE UN APTÁMERO OBTENCIÓN DE APTÁMEROS

33. ► Detección in situ
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
APTÁMEROS
 Más sencillos de obtener que los anticuerpos
 Alta especificidad y afinidad por el analito
 Alta estabilidad (los anticuerpos son proteínas)
 Posibilidad de añadir grupos funcionales o etiquetas sin alterar su afinidad
 Fabricación automatizada

34. ► Detección in situ
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
• Aptámero inmovilizado en electrodo serigrafiado de carbón modificado con oro
(Giamberardino et al., 2013)
ELECTRODO SERIGRAFIADO DE CARBONO
MODIFICADO CON NANOPARTÍCULAS DE ORO

35. ► Detección in situ
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
• Aptámero inmovilizado en dispositivo microfluídico en soporte de papel
(Neethirajan et al., 2017)
NANOESTRUCTURAS DE CARBONO
• MWCNT multi-walled carbon nanotube • GO óxido de grafeno

36. DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO EN
SOPORTE DE PAPEL

37. ► Detección in situ
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
 Disminución del tiempo de manejo entre la obtención de la muestra y su análisis
 Eliminación de los costes de transporte y con ello el coste total asociado al diagnóstico
 Reducción del personal implicado y equipos
 Detección más rápida no reduce el riesgo a 0 (RIESGO 0 NO EXISTE)
permite una retirada más rápida del producto del mercado ( impacto del brote)

38. ► Detección basada en aproximaciones ómicas
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
(Haukaas et al., 2017)
X
• Alternativa a los métodos moleculares
• No se requiere el conocimiento previo del patógeno a detectar
GENÓMICA
La secuenciación de ARN ha sido utilizada para la detección de NoV en
fresas congeladas
• Bajo número de secuencias específica de NoV detectadas en comparación a las
lecturas generadas
• Secuencias de la planta detectadas (solución: tratar con ADNasas)

39. ► Detección basada en aproximaciones ómicas
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
(Haukaas et al., 2017)
X
• Procesos con alta sensibilidad y especificidad
PROTEÓMICA Y METABOLÓMICA
La proteómica y la metabolómica han sido utilizadas para la detección
de algunos patógenos alimentarios como Listeria spp. y E.coli
• Requiere conocer previamente la huella peptídica/metabolómica del
patógeno a detectar

40. ► Detección basada en aproximaciones ómicas
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
 Método prometedores con gran potencial para la detección de NoV
 Identificar biomarcadores que se pueden usar para desarrollar kits de diagnóstico rápidos
✕ Se encuentran en las primeras etapas de desarrollo, se necesita un mayor estudio
✕ La extracción necesaria de ácidos nucleicos, proteínas y metabolitos puede dificultar su aplicación in situ
✕ Requiere personal con conocimientos específicos para el análisis de datos

41. CONCLUSIONES
“Take-home message”

42. ► Conclusiones
Herramientas diagnósticas de norovirus en alimentos
INTRODUCCIÓN OBJETIVOS Y METODOLOGÍA HERRAMIENTAS DIAGNÓSTICAS CONCLUSIONES
Los NoV presentan dificultades para su detección en
alimentos
Alta variabilidad
Difícil extracción en matrices alimentarias
Gran cantidad de muestra para carga viral detectable
Provocan que sea más complicado encontrar una técnica de
detección eficaz
Fortalecimiento de las
medidas de control a lo
largo de toda la cadena
alimentaria
Mayor higiene
por parte de los
manipuladores
Control de las aguas de
irrigación y de criaderos
de mariscos
Desarrollo de una técnica
rápida, sensible in situ que
permita la retirada del alimento
a la mayor brevedad posible

43. ¡GRACIAS!