Monografía de la Segunda unidad de Bioquimica

1. MÉTODOS DE
PURIFICACIÓN
ENZIMÁTICA
AUTORES:
● CUSHQUICULLMA DOMÉNICA
● FIERRO JOSSELYN
● GARCÍA MAYERLI
NRC: 7542
DOCENTE: RODRIGO ÁVALOS

2. 1. Introducción
2. Objetivos
3. Marco teórico
3.1. Enzimas
3.2. Purificación enzimática
3.3. Métodos de purificación
3.3.1. Concentración por precipitación
3.3.2. Métodos Cromatográficos
3.3.3. Métodos eletroforéticos
3.4. Importancia de la purificación enzimáticas
4. Conclusiones
5. Bibliografía
Tabla de contenidos

3. Introducción
La purificación de proteínas es una de las técnicas bioquímicas más comunes, es una primera etapa
esencial para el estudio de las propiedades físicas y biológicas de las mismas.
Para conseguir la purificación de una determinada proteína, ésta debe ser liberada en primer lugar de
la matriz biológica en la que se encuentra y luego separada selectivamente de otras proteínas mediante
un procedimiento de fraccionamiento apropiado. (Departamento de Bioquímica y Biotecnología, s. f.).
Los métodos que serán presentados a continuación están basados en las diferencias que existen entre
las propiedades físicas de los componentes de una mezcla como la solubilidad que es el
fraccionamiento por adición de sales, el fraccionamiento con solventes orgánicos ó precipitación
isoeléctrica, la carga cromatografía de intercambio iónico y técnicas electroforéticas, el tamaño
molecular por cromatografía de exclusión y diálisis, las interacciones bioespecíficas por cromatografía
de afinidad, etc. (López Sánchez et al., 2005).

4. ● Identificar los métodos de
purificación enzimática revisando las
3 etapas básicas de la purificación,
mediante revisión bibliográfica para
poder determinar su estructura, los
procesos de síntesis y el seguimiento
de las reacciones químicas.
Objetivo
General
Objetivos
específicos
1. Reconocer las etapas de cada método para
realizar un correcto uso de los mismos,
además, el tipo de tratamiento requerido y
así, obtener la purificación enzimática.
2. Explicar el proceso que lleva cada uno de los
métodos e identificar las ventajas y
desventajas de aplicarlos.
3. Asociar la purificación enzimática en la
industria y estudiar cómo la aplicación del
mismo beneficia a varios sectores como el
textil, papelero y especialmente el de
alimentos.

5. Marco
Teórico
Enzimas
Regulación de todas las
reacciones químicas que
forman parte del
metabolismo de todos los
seres vivos.
Son conocidas como
catalizadores biológicos
Holoproteínas Holoenzimas

6. Funciones específicas
Marco Teórico
CATALIZADORES - PRODUCIR ENERGÍA - MOTORES MOLECULARES -
ANABOLISMO Y CATABOLISMO
Gráfica 1. Clasificación de las enzimas. Cárdenas, J. (2021). Las enzimas: características, estructura y clasificación. Obtenido
de: https://leerciencia.net/las-enzimas-caracteristicas-estructura-yclasificacion/

7. Consiste en un preparado
que permite extraer las
enzimas indeseables.
Cada tipo de enzima y
tejido requieren un tipo
de tratamiento distinto.
Purificación enzimática
Marco Teórico
Necesario realizar
alguno de los siguientes
métodos:
● Análisis por
ultracentrífuga
● electroforético
tomar en cuenta que
durante este transcurso
se llegan a perder gran
parte de las mismas.

8. Métodos de purificación
- Concentración por precipitación
Solventes orgánicos
La fase sólida contiene componentes como agua, sales y otras moléculas solventes,
los cambios de solubilidad pueden deberse a cambios en la fase sólida. No
obstante, se ha obtenido éxito en la explicación de los fenómenos de solubilidad
suponiendo que la actividad de la proteína en la fase sólida es constante, a menos
que la fase sólida contenga más de un componente proteico.
Marco Teórico

9. Precipitación por sales
Las sales pueden estabilizar las proteínas contra la desnaturalización, la proteólisis
o la contaminación bacteriana, características que hacen de este método una
alternativa fácil y confiable para la separación de proteínas
Marco Teórico
La causa de la precipitación por salado difiere a la causada por el ajuste del pH, lo que
lleva a que estas técnicas sean usadas una tras otra con el fin de maximizar la
purificación de las proteínas deseadas
Se ha mostrado que la mejor sal para la precipitación de proteínas es el sulfato de
amonio [(NH4)2SO4]. Su solubilidad es muy alta (aproximadamente 4 M en agua
pura) y varía muy poco en el rango de temperaturas de 0 a 30˚C. (Harrison et al.,
2003).

10. Sulfato de amonio
Consiste en añadir la sal sulfato de amonio a la proteína que se desea purificar. Un ejemplo de este
método es la extracción de penicilinasa de Escherichia coli. La precipitación con sulfato amónico (20%
peso/volumen) mejora la actividad específica cuatro veces, y el aumento de la concentración del sulfato
amónico hasta un 56% (p/v), precipitando así la penicilina, que da lugar a una purificación global cinco
veces superior. Una de las desventajas es que no debe ser utilizada por encima de un pH de 8 debido a la
acción buffer del amoníaco (Dixon y Webb, 2009)
Marco Teórico

11. Ultrafiltración
La ultrafiltración es el proceso capaz de fraccionar, separar y concentrar sustancias sin que éstas
sufran cambios de fase, en el cual se utiliza una membrana semipermeable con poros de tamaño
definido, que determina el tamaño de las partículas que pasarán a través de ella (Gordon & Bickerstaff,
2007)
Marco Teórico
Gráfica 2. ¿Cómo funciona una membrana de ultrafijación?. Zarza, L. (s.f). ¿Qué es la
ultrafiltración?. Obtenido de: https://www.iagua.es/respuestas/que-es-ultrafiltracion

12. Diálisis
La diálisis es una forma de filtración molecular, que conforma un proceso de
separación de moléculas de acuerdo con su tamaño, mediante el empleo de membranas
semipermeables que contienen poros de dimensiones inferiores a las macromoleculares.
Marco Teórico
Gráfica 3. Diálisis y ultrafiltración. Amores et al., (2013). Diálisis. Obtenido de:
http://ufq.unq.edu.ar/Docencia-Virtual/BQblog/Dialisis%20y%20ultrafiltracion.pdf

13. Cromatografía de filtración en gel
En este método se utilizan columnas cilíndricas llenas de mezclas de geles con
diferente porosidad. La separación se da por el tamaño de las partículas presentes, las
proteínas de mayor tamaño son las primeras en ser excluidas, al final se obtendrá
proteínas seleccionadas por su bajo peso molecular (Jarrín y Moncayo, 2015).
Marco Teórico
Gráfica 4. Cromatografía. Wikipedia. (2013). Cromatografía de filtración en gel. Obtenido de:
https://es.m.wikipedia.org/wiki/Archivo:Cromatograf%C3%ADa_de_filtraci%C3%B3n_en_gel.jpg

14. Cromatografía de intercambio iónico
Marco Teórico
Gráfica 5. Historia de la cromatografía. Jasso.(s.f). Cromatografía de intercambio iónico.
Obtenido de: https://www.timetoast.com/timelines/historia-de-la-cromatografia

15. Cromatografía
por afinidad
Marco Teórico
● Es específica
● Tiene un mayor rango de
adaptaciones en la
purificación o aislamiento de
sustancias de carácter
biológico
La cromatografía de afinidad
consigue retener un
compuesto y desligarlo para
obtenerlo con gran pureza.
Fuente: El curioso. (2016). ¿Qué es la cromatografía?: Una tecnología tan potente
como sencilla que puedes hacer en casa (para los no químicos). Obtenido de:
https://www.elgencurioso.com/2020/05/16/que-es-la-cromatografia-una-tecnologi
a-tan-potente-como-sencilla-que-puedes-hacer-en-casa-para-los-no-quimicos/

16. Métodos
electroforéticos
Marco Teórico
Los métodos electroforéticos
son de alta sensibilidad,
eficaces, poseen versatilidad y
poder de resolución.
Sirven para separar:
● Proteínas
● Ácidos nucleicos
● Otras biomoléculas
También permiten determinar:
● El punto isoeléctrico
● El peso molecular de una
proteína
● Distinguir moléculas por su
forma y su carga neta.

17. Electroforesis
Marco Teórico
Es una técnica de
separación utilizada en
investigaciones de
ácidos nucleicos y
proteínas.
Consiste en la aplicación de
corriente eléctrica para separar
biomoléculas.
Las moléculas
migran a través de
una matriz porosa
(gel), que permite la
separación en
función de su
tamaño y carga
eléctrica.
Fuente: IDCORE. (2021). ¿Qué es la Electroforesis?. Obtenido de:
https://twitter.com/idcorebiotech/status/1439223583813865475/photo/1.

18. Electroforesis de enfoque isoeléctrico o
electroenfoque
Marco Teórico
Esto se consigue introduciendo
en su estructura moléculas
ionizadas con diferentes valores
de pK
El Isoelectroenfoque es un tipo
de electroforesis que se utiliza
para separar partículas
cargadas
Fuente: Marron, F. (2015). ELECTROFORESIS + Cátodo. Obtenido de:
https://slideplayer.es/slide/2907211/

19. Marco Teórico
SDS – PAGE
Separa las macromoléculas por
su peso molecular mediante el
efecto de la filtración en gel.
Se pueden analizar en las
proteínas contenida en:
● Fluidos biológicos: sangre, plasma,
suero (plasma libre de fibrinógeno),
orina, fluidos articulares, saliva y
lágrimas.
● Alimentos, especialmente lácteos y
cereales.
● En investigación y estudios clínicos,
humanos y animales.
Fuente: CreativeProteomics. (s.f.).Servicio 1D SDS-PAGE e IEF. Obtenido de:
https://www.creative-proteomics.com/services/1d-sds-page-ief.htm

20. Importancia de la purificación enzimática
Marco Teórico
Ha adquirido mayor importancia en los
últimos años debido a la creciente
necesidad de disponer de grandes
cantidades de proteínas con diversos
grados de pureza, dependiendo del uso
final que se le vaya a dar
La purificación de enzimas es muy importante
ya que en algunos casos se requiere que una
proteína en particular se encuentre en su
estado puro, es decir, que es importante la
separación de una mezcla compuesta por
centenares de proteínas normalmente
producidas por la célula.

21. ● Los métodos de purificación consisten en una serie de pasos independientes que
aprovechan las diferentes propiedades físicas y químicas de las proteínas de interés para
separarlas gradualmente de otras proteínas y/u otras sustancias. Las propiedades de las
proteínas utilizadas en los diferentes procedimientos de separación son: solubilidad, carga
iónica, tamaño molecular, propiedades absorbentes y capacidad de unión con otras
biomoléculas.
● Los métodos de purificación convencionales tales como la cromatografía de proteínas en
la industria de purificación se utilizan sistemas como la abrasión para romper células de
centrífuga para conseguir la purificación de sobrenadantes y sedimentos, ultrafiltración
para concentrar, y finalmente la enzima purificada se vende como distintos formatos como
liofilizadas, disueltas en presencia de sulfato de amonio que actúa como estabilizador y
mezclas con distintos aditivos.
● En la industria la purificación enzimática, especialmente en el campo de la biotecnología,
se realiza con el fin de separar a la enzima para que esta tenga un mejor rendimiento, que
se encuentre pura y no contaminada de otras sustancias como otras proteínas, restos
celulares o ácidos nucleicos. En la industria de alimentos las enzimas sirven para resaltar
subproductos, mejorar el aroma, facilitar la fabricación y estabilizar la calidad de los
alimentos, es por ello que es necesario tener a la enzima en su estado puro.
Conclusiones

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Referencias bibliográficas

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25. GRACIAS