Bactereolo

1. Unidad Didáctica: Bacteriología
Programa de estudios: Laboratorio Clínico y
Anatomía Patológica
S.A-12:“Conociendo las Pruebas de
Sensibilidad Antimicrobianas”
Docente: Amalia Delgado Soberón

2. PRUEBAS DE SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA
 El aislamiento e identificación de un agente infeccioso a partir de una muestra
clínica proveniente de un paciente, no es suficiente para impartir una terapia
antiinfecciosa adecuada. Actualmente, numerosos microorganismos han
desarrollado múltiples mecanismos que les permiten resistir a la acción de los más
nuevos y potentes agentes antimicrobianos.
 Como no se puede predecir la susceptibilidad de las bacterias a los
antimicrobianos, en la actualidad se dispone de varios métodos para determinar el
patrón de susceptibilidad de una bacteria a los antibióticos. Entre los métodos más
utilizados podemos mencionar:
 A. Difusión en agar (Técnica de Kirby Bauer)
 B. Dilución en agar
 C. Macrodilución en caldo
 D. Microdilución en caldo
 E. Epsilon test (E test)
 F. Métodos aumatizados
 G. Pruebas especiales.

3. Difusión en agar (Técnica de Kirby Bauer)
 La técnica de difusión en agar, es cualitativa y sus resultados se pueden interpretar
únicamente como sensible, intermedio o resistente, y está diseñada
específicamente para bacterias de crecimiento rápido domo los Staphylococcus sp.
O los integrantes de la familia Enterobacteriaceae.
 La técnica de difusión en agar, presenta varias ventajas como:
 a. es fácil de efectuar y de gran reproducibilidad
 b. bajo precio
 c. no requiere equipo especial
 d. sus resultados son fácilmente interpretados por los clínicos
 e. es muy flexible a la hora de escoger los antibióticos a probar.
 Dentro de sus desventajas está el hecho de que brinda sólo información
cualitativa. Otra desventaja y la más importante, es que esta técnica debe ser
modificada para poderla emplear en organismos fastidiosos o de crecimiento
lento.

4.  Dentro de sus desventajas está el hecho de que brinda sólo información
cualitativa. Otra desventaja y la más importante, es que esta técnica debe ser
modificada para poderla emplear en organismos fastidiosos o de crecimiento
lento.
 Organismos con Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Neisseria
gonorrhoecae, Streptococcus pneumoniae y Moraxella catarrhalis, necesitan de una
técnica de difusión modifica, modificación que se hace principalmente en el
periodo de incubación, en el medio de cultivo a emplear, en la atmósfera de
incubación y en la preparación del inóculo.
 Para Haemophilus influenzae, lo recomendado es poner a crecer al organismo en
un agar chocolate suplementado, preparar el inóculo en un caldo de Müeller-
Hinton o solución salina estéril al 0,9%, e incubarlo a 35ºC por 16 a 18 horas en
una atmósfera de 5 a 7% de CO2.
 Para Neisseria gonorrhoecae se debe utilizar agar base GC suplementado(4) y para
Streptococcus pneumoniae agar sangre al 5% y que tenga Müeller-Hinton como
base. Para ambos, la incubación debe ser un poco más prolongada que para H.
Influenzae (20 a 24 horas), manteniendo el resto de condiciones igual (35ºC y 5 a
7% de CO2).

5. B. Dilución en agar
 En la técnica de la dilución en agar, se preparan tubos con la concentración
definida de antibiótico y se le agrega a cada tubo una cantidad conocida del agar
Müeller-Hinton, este tubo se homogeniza y se chorrea en una placa de Petri vacía
con lo que se logra una placa de agar Müeller-Hinton con el antibiótico diluido a
una concentración determinada.
 Generalmente se inicia a una concentración de 128 ug/ml y se hacen diluciones
dobles hasta obtener el gradiente decreciente en la concentración de antibiótico
(64; 32; 16; 8; 4; 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,06 ug de droga activa).
 Para inocular el medio de cultivo, se emplea un inoculador conocido como el
inoculador de Steer. Este es una placa de metal de 32 pozos y una lámina de metal
con 32 proyecciones que toman, cada una, 20 ul del inóculo estandarizado del
agente y que se coloca sobre la superficie del agar con antibióticos. Adicional a
esto, se inocula una placa de Müeller-Hinton sin antibiótico, que sirve como control
positivo de crecimiento. La placa se incuba a 35ºC por 18 a 24 horas y se revisa el
crecimiento, siempre contra el control positivo.

6.  Si la cepa logra crecer en la superficie del medio de cultivo, se reporta como
resistente a esa concentración del antibiótico. Si, por el contrario, no crece, se
reporta como sensible a esa concentración de antibiótico.
 Con esta técnica, se puede obtener la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), la
que se define como la mínima concentración de antibiótico que inhibe el
crecimiento de una cepa bacteriana determinada.
 Preparar toda una gradiente de medios de cultivo con una concentración
decreciente de antibiótico, hace que esta técnica sea muy engorrosa por lo que en
realidad se utilizan sólo dos diluciones, una arriba del punto de quiebra del
antibiótico y otra debajo de este valor.

7. C. Macrodilución en caldo
 Esta técnica se deriva de la anterior, pero no se utiliza por la cantidad de material
que emplea, y porque presenta el grave problema de la dificultad para detectar
contaminaciones del medio de cultivo, lo que podría producir una falsa resistencia.
 Sin embargo, la técnica que se usa es la misma de la microdilución y la
interpretación es la misma también.

8. D. Microdilución en caldo
 Aquí empleamos unas placas plásticas, estériles, con tapa, de 96 pozos y un fondo
en U. Cada placa permite realizar una CMI de un antibiótico a ocho cepas
diferentes, o una CMI de una cepa contra ocho diferentes antibióticos.
 El medio de cultivo empleado es Müeller-Hinton en caldo o el medio caldo HTM, si
la cepa a estudiar es un Haemophilus sp. La cepa se prepara en las mismas
condiciones de turbidez, pureza y crecimiento de todas las pruebas de
sensibilidad.
 Para preparar las diferentes diluciones del antibiótico se parte de una solución
madre que se debe diluir en las condiciones adecuadas para cada antibiótico. Esta
solución madre es diferente para cada antibiótico y depende del tipo de
antibiótico y la cepa a probar.
 Con esa técnica se pueden determinar dos diferentes valores: la CMI y la CMB. La
CMI ya la hemos definido como la mínima concentración de antibiótico que inhibe
el crecimiento posible de un inóculo bacteriano estandarizado. La CMB es la
mínima concentración de un antibiótico que mata el 99,9% de las bacterias de un
inóculo inicial.

9.  El primer paso para proceder al montaje de una CMI/CMB utilizando la técnica de
la microtitulación es colocar 50 ul del medio de cultivo en cada uno de los pozos
de la placa a emplear. Luego se colocan 50 ul de la solución madre del antibiótico,
teniendo en cuenta que estamos haciendo una dilución 1: 2, por o que si la
solución madre tiene 512 ug/ml, en el primer pozo tendríamos una concentración
real de 256 ug/ml, luego procedemos a realizar diluciones dobles hasta los pozos
10, dejando el 11 como control de crecimiento negativo y al pozo 12 de control
positivo de crecimiento. El control positivo tiene medio de cultivo más el inóculo
bacteriano y el control negativo tiene medio de cultivo y antibiótico, para un
volumen final de 100 ul en ambos pozos.
 Resumiendo, en el primer pozo hemos puesto 50 ul de medio de cultivo, 50 ul de
la solución madre de 512 ul, hemos sacado 50 ul y hemos colocado 50 ul del
inóculo bacteriano. En este primer pozo la concentración del antibiótico, si
iniciamos con la solución madre de 512 ul, sería de 128 ug, por consiguiente, el
pozo 2 tendrá una concentración de 64 ug, el siguiente de 32, el siguiente de 16 y
así hasta el pozo 10 que tendría una concentración final de 0,125 ug/ml.

10.  La placa se incuba a 35ºC por 18 a 24 horas, cubierta, ya sea con la tapa de la placa
o con un plástico adhesivo permeable al oxígeno.
 Una vez lista la placa, se hace una serie de diluciones del inóculo, se realiza el
plateo final en un medio de cultivo apropiado a la cepa y se incuba en las
condiciones apropiadas hasta el otro día. Luego de este periodo de incubación, se
cuentan las ufc, se multiplican por la dilución y se obtiene la concentración (ufc/ml)
del inóculo empleado.
 La interpretación es relativamente sencilla, la CMI se determina viendo en cuál
pozo no hay crecimiento, usando como referencia el control positivo en el cual sí
hay crecimiento. La CMI será la concentración del último pozo en el cual no hay
crecimiento. Para obtener la CMB, de aquellos tubos en los que no se observe
crecimiento, se extraen 10 ul y se inoculan en el medio de cultivo, se incuba y
luego se cuentan las colonias que crecen y esto se refiere al conteo bacteriano del
inóculo inicial. Generalmente la CMB es una o dos diluciones más alta que la CMI.

11. E. Epsilon test (E test)
 Este método emplea una tira con una matriz plástica que tiene una concentración
decreciente de un antibiótico determinado. El medio que se usa es agar sangre con
sangre de caballo al 5% y con una base de Müeller-Hinton o puede utilizarse agar
HTM o agar chocolate suplementado.
 Aquí, se determina solamente la CMI y ésta se encuentra en la interfase de la elipse.
La lectura debe ser muy cuidadosa y puede hacerse con la ayuda de una lupa.

12. Se recomienda que, si la interfase cae entre dos puntos, se escoja la concentración
más alta y también es muy importante la observación de pequeñas colonias presentes
en las zonas de bajo crecimiento, lo que puede indicar resistencia o bajos niveles de
ésta.
En E test ha venido a resolver una serie de problemas y a hacer más rápida y fácil la
determinación de la CMI. Actualmente, se pueden adquirir tiras de E test para pruebas
de sensibilidad de las bacterias tradicionales y de las especiales como organismos
anaerobios, Campylobacter sp., Helicobacter pylory y Micobacterium tuberculosis.
Hay también, E test para sensibilidad de los organismos levaduriformes(7).

13. F. Métodos aumatizados
 En cuanto a los métodos automatizados(3), revisaremos solamente el único sistema con
el cual se ha acumulado una amplia experiencia en el Hospital Nacional de Niños. Se
trata del Sistema Automatizado Vitek de la casa comercial BioMerieux.
 Este utiliza tarjetas de plástico transparente para la prueba de sensibilidad. Se trata de
tarjetas de 30 pozos que llenan con el inóculo bacteriano estandarizado, mediante una
bomba de vacío y luego las tarjetas son selladas herméticamente, se introducen a un
incubador a 35ºC y cada 10 minutos el sistema hace una lectura y se mide la
concentración del inóculo bacteriano. Cada tarjeta tiene un pozo control positivo de
crecimiento y es este pozo donde se construye una curva normal de crecimiento
bacteriano.
 Cada uno de los pozos de antibióticos es referido al control positivo de crecimiento y la
curva obtenida en cada uno a su vez, se controla la curva normal obtenida en el pozo
de control positivo.

14.  Así pues, una cepa resistente, tendría una curva exacta o muy parecida a la
normal, una cepa intermedia presentaría una curva mucho menos amplia y
con un menor recuento bacteriano que el control; una cepa sensible, no
tendría una curva, tendría una línea recta.
 Es importante mencionar que una prueba de sensibilidad realizada en un
sistema automatizado, proporciona un dato que se aproxima a una CMI ya
que estos sistemas trabajan con 2 ó 4 diferentes concentraciones del
antibiótico, por lo que se insiste en el hecho de que este dato es
semicuantitativo. Aun así, este sistema ha venido a solventar una serie de
problemas técnicos y en especial la reducción importante en el tiempo de
incubación de la prueba. En la mayoría de los casos, la sensibilidad se
reporta en tiempos tan bajos como 4 a 5 horas, tiempo que antes tomaba
de 18 a 24 horas.

15.  Este sistema no puede emplearse para las pruebas de sensibilidad de las cepas
fastidiosas; sin embargo, es esperable que en pocos años se pueda desarrollar un
medio de cultivo que soporte el crecimiento de este tipo de cepas.
 El sistema Vitek está hecho para las pruebas de sensibilidad de los organismos de
crecimiento rápido y es aquí donde se ha sentido su impacto.
 La casa comercial, ya tiene a disposición tarjetas para la prueba de sensibilidad de
organismos anaeróbicos, pero no tenemos experiencia en este campo.


16. G. Pruebas especiales.
 Son técnicas que se utilizan con fines especiales y que se emplean en estudios de
resistencia bacteriana en condiciones muy claramente definidas.
 Los métodos a discutir son los siguientes:
 detección de la resistencia contra aminoglucósidos en los Enterococcus,
 detección de la resistencia de Enterococcus contra la vancomicina,
 detección de la resistencia a la oxacilina en Staphylococcus,
 detección de la B-lactamasa y determinación de la actividad bactericida.
 Para el tratamiento de infecciones serias por Enterococcus, comúnmente se utiliza
una combinación sinérgica entre la vancominina y un aminoglucósido que puede
ser gentamicina o streptomicina.

17.  En estos casos, se puede hacer una prueba para detectar la resistencia del
Enterococcus a estos aminoglucósidos. Para ello hay tres métodos: el de difusión,
el de dilución y la microtitulación(9). El más sencillo el de dilución donde se
emplean placas de Petri con Müeller-Hinton suplementado con gentamicina (500
ug) o streptomicina (200 ug). Si hay crecimiento en estas placas, hay resistencia a
esos antibióticos.
 El sistema Vitek trae una tarjeta (TA) que tiene estos antibióticos, por lo que puede
ser utilizada en casos de sinergismo entre la gentamicina y la streptomicina para el
tratamiento de infecciones invasoras por Enterococcus.
 En cuanto a la resistencia de los Enterococcus contra la vancomicina, hemos
empleado un agar sangre con base de Müeller-Hinton y 6 ug/ml de medio de
vancomicina. Este método lo hemos usado para la detección de este tipo de
agentes a partir de las heces de niños costarricenses y manos del personal de
salud, con resultados excelentes .

18.  La NCCLS, recomienda, para la detección de la resistencia de los Staphylococcus a la
oxacilina, el uso de un Müelle-Hinton suplementado con cloruro de sodio al 4% y 6 ug
de oxacilina por ml de medio cultivo.
 En el campo de la resistencia bacteriana mediada por enzimas, podemos mencionar
varios tipos como por ejemplo las B-lactamasas, las B-lactamasas de efecto expandido o
inducibles y algunas otras como son la cloranfenicol acetil tranferasa (CAT) o
aminoglucósido acetil tranferasa (AAT).
 El método más sencillo para la detección de la B-lactamasa es el uso de la cefalosporina
cromogénica o Cefinasa de la casa BBL, en la cual tenemos un disco impregnado con la
cefalosporina y sólo se coloca una asada del organismo a testar y pocos minutos
después se observa el cambio de color. Si la cepa produce una B-lactamasa, hay un
cambio de color del disco y éste pasa de amarillo a rojo.

19.  Para la detección de la resistencia al cloranfenicol mediada por una CAT, producida
por Haemophilus influenzae, se ha desarrollado una técnica muy ingeniosa, donde
se usan discos sin antibiótico impregnados con la cepa a probar, discos de
cloranfenicol y un agar Müeller-Hinton.
 La idea es rayar una cepa de Escherichia coli con sensibilidad comprobada al
cloranfenicol sobre el agar y luego colocar discos de cloranfenicol y sobre ellos
discos sin antibióticos impregnados con la cepa a probar.
 Si la cepa produce CAT, inactivará al coranfenicol y la Escherichia coli no presentará
un halo de inhibición; por el contrario, si la cepa no produce esta enzima, no habrá
inhibición y por ende, la Escherichia coli presentará un halo de inhibición,
poniendo en evidencia la producción de la CAT.

20.  Control de Calidad
 Una revisión sobre el tema de las pruebas de sensibilidad antimicrobiana no puede estar concluido
sin mencionar lo concerniente al control de la calidad. Este es un tema de gran importancia. Dicho
control se realiza utilizando cepas control de la American Type Cultive Colection (ATCC) o de alguna
otra institución internacional que se dedique a la producción y mantenimiento de cepas
bacterianas.
 Las cepas de la ATCC, presentan patrones de sensibilidad conocidos, por lo que al montar una
prueba de sensibilidad, ésta debe encontrarse dentro de los límites máximos o mínimos impuestos
por las regulaciones internacionales.
 El control de calidad debe ser efectuado al menos una vez por semana, cada vez que se cambia el
lote del medio del cultivo o se prepara medio fresco y cada vez que se cambia un antibiótico o se
inicie el uso de uno nuevo.
 Quedan sin tratar algunas otras técnicas, como son los métodos genéticos para la detección de
resistencia y las diferentes técnicas empleadas en el estudio de resistencia a los antivirales, los
antimicóticos, antiparasitarios y la resistencia en organismos anaeróbicos(2, 5, 10, 11,14, 15), así
como la detección de agentes antimicrobianos en fluidos biológicos(12).
 En todos estos campos se ha avanzado mucho en los últimos años, por lo que estos temas serán
objeto de una publicación posterior.

21.  El control de calidad debe ser efectuado al menos una vez por semana, cada vez
que se cambia el lote del medio del cultivo o se prepara medio fresco y cada vez
que se cambia un antibiótico o se inicie el uso de uno nuevo.
 Quedan sin tratar algunas otras técnicas, como son los métodos genéticos para la
detección de resistencia y las diferentes técnicas empleadas en el estudio de
resistencia a los antivirales, los antimicóticos, antiparasitarios y la resistencia en
organismos anaeróbicos, así como la detección de agentes antimicrobianos en
fluidos biológicos.
 En todos estos campos se ha avanzado mucho en los últimos años, por lo que
estos temas serán objeto de una publicación posterior.