Este estudio investigó la incidencia de carcinomas cutáneos escamosos en pacientes tratados con inhibidores de BRAF. De 21 muestras de piel de pacientes, 22 fueron caracterizadas como queratoacantomas y 13 como carcinomas escamosos. Se encontró fosforilación de ERK en las lesiones pero no en la piel circundante normal, y mutaciones en RAS solo en 4 de 10 muestras. El estudio también mostró que los inhibidores de BRAF estimulan el crecimiento de células con mutación HRAS a
Bases biomolec. del cancer 2parte FacMedUchile Oriente
Ras mutations in cutaneous squamous cell carcinomas 2
1. RAS Mutations in Cutaneous Squamous-
Cell Carcinomas
in Patients Treated with BRAF Inhibitors
Fei Su, Ph.D., Amaya Viros, M.D., Carla Milagre, Ph.D., Kerstin Trunzer, Ph.D., Gideon Bollag, Ph.D., Olivia Spleiss, Ph.D., Jorge S. Reis-Filho,
M.D., Ph.D., Kong, M.S., Richard C. Koya, M.D., Ph.D., Keith T. Flaherty, M.D., Paul B. Chapman, M.D., Min Jung Kim, Ph.D., Robert Hayward,
B.S., Matthew Martin, Ph.D., Hong Yang, M.S., Qiongqing Wang, Ph.D., Holly Hilton, Ph.D., Julie S. Hang, M.S., Johannes Noe, Ph.D., Maryou
Lambros, Ph.D., Felipe Geyer, M.D., Nathalie Dhomen, Ph.D., Ion Niculescu-Duvaz, Ph.D., Alfonso Zambon, Ph.D., Dan Niculescu-Duvaz,
Ph.D., Natasha Preece, B.A., Lídia Robert, M.D., Nicholas J. Otte, B.A., Stephen Mok, B.A., Damien Kee, M.B., B.S., Yan Ma, Ph.D., Chao
Zhang, Ph.D., Gaston Habets, Ph.D., Elizabeth A. Burton, Ph.D., Bernice Wong, B.S., Hoa Nguyen, B.A., Mark Kockx, M.D., Ph.D., Luc Andries,
Ph.D., Brian Lestini, M.D., Keith B. Nolop, M.D., Richard J. Lee, M.D., Andrew K. Joe, M.D., James L. Troy, M.D., Rene Gonzalez, M.D.,
Thomas E. Hutson, M.D., Igor Puzanov, M.D., Bartosz Chmielowski, M.D., Ph.D., Caroline J. Springer, Ph.D., Grant A. McArthur, M.B., B.S.,
Ph.D., Jeffrey A. Sosman, M.D., Roger S. Lo, M.D., Ph.D., Antoni Ribas, M.D., Ph.D., and Richard Marais, Ph.D.
Catalina Bermúdez González
Camila Cruz Cano
Third semester
Molecular biology
Universidad Pontificia Bolivariana
Medellín, 2012
2. Introduction
Cancer
• It begins when cells in a part of the body begin
to grow uncontrollably and become cancerous due
to an alteration in the DNA of type:
Translocation
Located
Amplification
Deletion
Gain or loss of a chromosome
3. • In cancer cells disobey all repair mechanisms
and control, so the cell continues to grow and
form new abnormal cells
• These mechanisms include:
The regulation of signal transduction
Cell differentiation
Apoptosis
The repair of DNA
The cell cycle progression
Angiogenesis
The cell adhesion
4. • There are three types of mutant genes
Tumor suppressor DNA replicati
Oncogenes genes on Genes
• Genes are mutated that • They are responsible • When the repair
promote cell division for stopping cell division system is defective as
• Involved in cell growth and induce apoptosis a result of acquired or
regulation • When these genes are inherited mutation
mutated cells divide
uncontrollably.
5. • Causes:
Result of the interaction of genetic factors with:
Physical Carcinogens
• Ultraviolet radiation
• Ionizing radiation
Chemical Carcinogens
• Snuff
• Aflatoxins
• Arsenic
Biological Carcinogens
• Infections caused by bacteria
• Infections caused by viruses
• Infections caused by parasites
6. • Risk factors
Consumption of snuff
Overweight or obese
Physical inactivity
Consumption of alcoholic beverages
HPV infections and HBV
Air pollution in cities
The smoke generated by burning solid fuels.
7. • Treatment
Chemotherapy Radiation therapy Biological therapy
• With an antineoplast • Use of ionizing • Immunotherapy
ic drug whose radiation on the
function is to tumor, • Hormone therapy
prevent the destroying the
reproduction of malignant cells and
cancer preventing their
Surgery cells causing an alter growth and
ation in reproduction becaus
the nucleic acid e they
synthesis, cell can damage repair
division or protein in an efficient
synthesis manner
• Cytostatic or • Also acts on normal
cytotoxic drugs tissue
• Low specificity
9. • Skin cancer is the most common, are diagnosed
each year about 3.5million cases
Cancer
No melanoma
(Keratinocytes Melanoma
carcinoma)
Squamous
Basal cells
cells
10. • Melanoma: They originate from melanocytes
(pigment-producing cells)
• Keratinocytes carcinoma:
Basal cell carcinoma:
Arise in sun-exposed areas, especially the head and
neck
It tends to be slow growing.
After treatment, basal cell carcinoma can recur in the
same area of skin.
11. Squamous cell carcinoma:
Appears in body areas exposed to sunlight, such as the
face, ears, lips and backs of hands
It is often more aggressive than basal cell cancer
It can spread to the fatty tissues under the skin and
lymph nodes basal
It starts as a red area with surface crusting, scaling,
not cure.
May become nodular, hard and sometimes present
a warty surface.
12. • Risk factors
Exposure to UV light
White skin
Age greater
Male sex
Exposure to chemicals
Exposure to radiation
Reduced immunity
13. RAS
• Monomeric G protein coupled to the cell
membrane by prenylation and has a regulating activity GTP-
hydrolase, which alternates between two structural
conformations:
Activated form: Ras protein is attached to GTP, called RAS-
GTP
Inactivated form: RAS protein is attached to GDP, called RAS-
GDP.
• Ras protein is activated by
different factors guanine nucleotide exchange, which
are also activated by mitogenic signals
• The RAS protein is inactivated by GTPase-
activating proteins that increase the ability to hydrolyze GTP
14. • Activates numerous signal transduction pathways,
but is especially important for mitogen-
activated protein kinase (MAPK), which also
through signal transduction protein kinases activate
other genes and regulatory proteins.
• When the gene is mutated acts constitutively,
binding GTP and giving continuous signal for cell
growth.
15.
16. BRAF
• Protein family of the RAF protein
• Has an activity of kinase serine-threonine
• Involved in the MAPK pathway (primary route of cell
proliferation) and active in the beginning of
the cAMP cascade to phosphorylate MEK protein and
send the signs of growth.
• The oncogenic form lose regulatory sequences of the
amino terminus and isconstitutively active,
preventing proliferation is turned off
17.
18.
19. The mutation of genes encoding these regulatory
proteins of the division, growth and apoptosis will
generate a hyperactivation of these,
generating permanent stimuli and give rise
to abnormal growth of cells that will form a tumor
20. General objective
• Identify which is the incidence of use of BRAF
inhibitors as anticancer in the development of
cutaneous squamous cell carcinomas by-
RAS Mutations
21. Materiales y métodos
• Pacientes
Participantes de un estudio de dosis
en escala con Vemurafenib en fase Se quiere
1, 2 y 3 (según ClinicalTrials.gov ) determinar a
que reciben dosis de 720 a 960 mg que dosis se
dos veces al día de forma oral. dan los efectos.
Porque es la
Con melanoma metastásico con una mutación que
mutación en BRAF V600 se quiere
inhibir
22. • PCR
Se extrajo ADN de muestras de tumor y se amplificó
con PCR para secuenciarlo para:
HRAS Exones 1 y 2
NRAS Exones 1 y 2
KRAS Exones 1 y 2
CDKN2A Exone 2
Esto fue seguido por Sequencing Sanger
Con el uso de un examen investigacional
AmpliChip p53 se analizaron sustituciones o
delecciones de una sola base en 2 exones de TP53.
Se evaluó la fosforilación de ERK mediante un análisis
inmunohistoquímico
23. El objetivo del PCR es obtener
varias copias de un fragmento
de DNA específico.
Se fundamenta en la propiedad
de las DNA polimerasas
Se alteran ciclos de
temperaturas altas y bajas para
separar las hebras recién
formadas de DNA entre cada
replicación y se deja que se
vuelvan a unir las polimerasas
para una nueva replicación
24. • Análisis celulares entre mutantes HRAS e
inhibidores BRAF
Células del
carcinoma con
B9 de HRAS
mutante
Células A431 T Vector vacío
(ATCC) r Vemurafenib
a Sembradas
en agar PLX4720 (análogo)
n Plásmido con
s con:
HRAS Q61L Dimetilsulfóxido
f
Células NH13T3 e Vector vacío
(ATCC) r
i Después de la exposición fue
d analizada la proliferación celular
Plásmido con mediante ensayos MTT o MTS
a
HRAS Q61L
s
25. • Análisis de expresión del gen
Vemurafenib
Células B9 después de sembradas en PLX4720 (análogo)
Fueron incubadas 16 horas Dimetilsulfóxido
Se cosecharon y se aisló el RNA y se midió la
expresión génica usando Affymetrix Mouse 420
2.0
Los genes que respondieron al Vemurafenib y al
PLX4720 se identificaron por que cambiaron
factores con relación a los que fueron sembrados
con Dimetilsulfóxido (control)
Los patrones de genes de las células B9 se
compararon con los genes de vía MAPK de 5
líneas celulares de personas con melanoma y se
confirmaron con PCR
26. • Ratones
Dos estados del carcinoma
6 ratones por grupo
Se usaron
Inhibidor BRAF: PLX4720
Inhibidos MEK: PD184352
Por sonda oral 25 mg/Kg/ día en 200 ul de
Dimetilsulfóxido
27. RESULTADOS
• Como parte del análisis dermatopatológico de
pacientes tratados con vemurafenib: 21
confirmaron muestras de carcinoma
escamocelular o keratoacantoma.
28. FIGURA 1
• A continuación se presenta fotografías y
fotomicrografías de lesiones de piel sin
melanoma en pacientes tratados con
vemurafenib.
29. EXPLICACIÓN FIGURA 1
• 22 lesiones (63%) fueron caracterizadas como
keratoacantomas y 13 (37%) fueron confirmados
como carcinoma escamocelular.
30. • Esta imagen muestra una
lesión con las características
clínicas de keratoacantoma
observada el día 98 después
de que el paciente
comenzara a consumir
vemurafenib en una dosis de
960mg dos veces al día.
• La imagen inferior es una
sección de la lesión obtenida
de la piel del torso del
mismo paciente sin
mutación RAS reportado
como carcinoma
escamocelular del subtipo
keratocantoma.
31. • Esta imagen muestra la
apariencia clínica e
histopatología de un
keratoacantoma de el
menton de un paciente
con HRAS Q61R .
32. FIGURA 2
• Muestras de la mutación y del análisis de
señalización de la MAPK en carcinoma cutaneo
escamocelular o keratoacantomas.
33. EXPLICACIÓN FIGURA 2
• La fosforilacion del ERK fue evaluada en 10
muestras con carcinoma escamocalular cutáneo
o keratoacantomas y se encontró que el epitelio
circundante fue normal.
• En 4 muestras con suficiente epitelio
circundante normal se realizo análisis de
mutación de RAS y ninguna mutación fue
detectada.
34. EXPLICACIÓN FIGURA 2
• La tinción para pERK la cual fue realizada en 3
de las 4 muestras fue mas común en las células
con lesiones que en aquellas de contorneado
epitelial normal.
35. FIGURA 2 A
• Tinción inmunohistoquimica para pERK (café) de muestras
de piel adyacente normal (izquierda) y de células de
carcinoma escamocelular (derecha).Este paciente (al igual
que el siguiente) fue tratado con vemurafenib. Este
paciente tiene la mutación KRAS G12.
• Este tipo de lesiones aparecieron 87 días después de que la
terapia con vemurafenib había comenzado
36. FIGURA 2 B
• Este paciente también tiene la mutación KRAS G12.
• Las lesiones del carcinoma escamo-celular
aparecieron 51 días después de que hubiese
empezado la terapia con vemurafenib.
38. Muestra la estimulación de el crecimiento de
las células B9 en el agar después de la
exposición a vemurafenib o PLX4720
Muestra la expresión diferencial de la regulación de MAPK y el rendimiento de
los genes después de la exposición a vemurafenib o PLX4720 durante toda la
noche en comparación con la expresión génica de 5 líneas celulares de
melanoma usadas como referencia.
Lo rojo indica la alta expresión y lo verde indica la baja expresión en las células
no tratadas.
Muestra el resultado del análisis de western
blot de las células NIH3T3 transfectadas con
un control vector o con un HRASQ61 mutado
y tratada con diferentes concentraciones de
vemurafenib.
40. • La investigación sobre los efectos de los
inhibidores del BRAF en las mutaciones de
HRAS en carcinomas escamo celulares
fueron usados en la línea celular B9 las
cuales albergaban la mutación HRASQ61L.
• Al exponerse las células a vemurafenib y a
su análogo PLX4720 se estimulo su
proliferación en el agar. Para analizar el
mecanismo subyacente se comparó la
expresión génica de las células B9 antes y
después de que fueran expuestas a
vemurafenib o PLX4720.
41.
42.
43. • Para estos 9 genes el cambio
FIGURA 3B en las células B9 fue opuesto
a el cambio en la parte del
gen observada en las células
humanas con melanoma
BRAFV600E.
• Esto sugiere que la
proliferación estimulada por
los resultados de los
inhibidores del BRAF
paradójicamente aumentan
el efecto transcripcional de
la vía MAPK en células con
HRAS mutante.
44. FIGURA 3C
• Muestra el resultado del análisis de western blot
de las células NIH3T3 transfectadas con un
control vector o con un HRASQ61 mutado y
tratada con diferentes concentraciones de
vemurafenib.
46. FIGURA 4 A
• La figura A muestra el numero de tumores palpables que
surgieron en ratones tratados con el carcinógeno 7,12 dimethyl
benz anthrace (DMBA), el promotor de tumores 12º-
tetradecanoylphorbol 13-acetato (TPA), el inhibidor del BRAF
PLX4720 (25 mg por kg por día). Cada cohorte consistió en 6
ratones y la respuesta en la formación de tumores en cada uno
47. FIGURA 4 B
• Esta imagen muestra los resultados de 90 días
después que fueran tratados con 4 diferentes
régimenes.
48. Aceleración del crecimiento de los tumores
de piel no-melanomas en ratones con
inhibición del BRAF
• Con un modelo invivo los efectos de la
inhibición del BRAF en carcinoma de células
escamosas y keratoacantomas, se usaron las dos
capas de piel del modelo de ratón de
carcinogénesis en los cuales la aplicación tópica
de del carcinógeno 7,12 dimethylbenz-
anthracene (DMBA) induce la mutación de la
HRAS Q61L en ratones con keratinocitos.
Subsecuentemente la aplicación de un promotor
de tumores 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-
acetate (TPA) induce luego las lesiones.
49. • En ratones que recibieron DMBA y TPA con
PLX4720, la apariencia de esas lesiones fue
marcadamente acelerada, como se comparo con
lso ratones que se les dio DMBA y TPA solo
50. DISCUSSION
RESEARCHER WHAT ABOUT HE YES OR NOT
SAYS
Davies H Bignell GR RAS was the first
oncogene discovered in
which point mutations
led to cellular
transformation.
Malumbres M. Barbacid RAS mutations alone
M. typically result in cellular
senescence in conjuntion
with other events that
alter control of the cell
cycle and apoptosis, they
induce celular
transformation
51. RESEARCHER WHAT ABOUT HE YES OR NOT
SAYS
Poulikakos PI, Zhang C, “Our data indicates that
Bollag G, Shokat KM, RAS mutations are
Rosen N. present in approximately
60% of cases in patients
treated with
vemurafenib, suggesting
that preexisting
mutations may confer a
predisposition to the
development of
squamus-cell carcinomas
or keratoacanthomas…”
52. RESEARCHER WHAT ABOUT HE YES OR NOT
SAYS
Nazarian R, Shi H, Recent study have
Wang Q et al. shown that vemurafenib
resistance can be
mediated by receptor
tirosine kinases such as
the platelet-derived
growth factor an
insuline growth factor 1
receptors. Mutation o r
amplification of
receptor tyrosine
kinases may account for
the development of
cutaneous squamus-cell
carcinomas and
keratoacanthomas.
53. CONCLUSIONS
• This study can show us that vemurafenib
stimulates proliferation in cells with mutated
HRASQ61L through paradoxical activation of
the MAPK pathway.
• This kind of drug development a clinical toxicity
that is the opposite of what would be expected
from a targeted oncogen inhibitor.
54. • Is important to the advanced study of the
possible side effects of anticancer drugs and when
dealing with genetic modifications that alter the
dynamics of cellular regulation because they can
affect other tissues.
• The PCR is a technique widely used in the area of
science that should be exploited as it
compromises reliable results at the genetic
level that can be used for high
incidence diseasessuch as cancer