La ingeniería genética permite manipular los organismos a nivel genético. Incluye técnicas como el aislamiento de genes, corte y unión de ADN, construcción de ADN recombinante, y clonación de genes en vectores. Esto permite transferir genes entre organismos y modificar sus características hereditarias de forma dirigida. Se usa para propósitos como la producción de medicamentos, enzimas y cultivos resistentes a plagas.

1. INGENIERÍA GENETICA

2. INGENIERÍA GENÉTICA
La Ingeniería Genética es una parte de la
Biotecnología que se basa en la manipulación
genética de organismos con un propósito
predeterminado, aprovechable por el hombre:
se trata de aislar el gen que produce la sustancia e
introducirlo en otro ser vivo que sea más sencillo
de manipular. Lo que se consigue es modificar las
características hereditarias de un organismo de
una forma dirigida por el hombre, alterando su
material genético.

3. ADN RECOMBINANTE
Las cuatro etapas básicas para construir un
ADN recombinante son:
• Aislamiento del ADN
• Corte del ADN
• Unión del ADN
• Amplificación del ADN recombinante

5. TAMAÑO DE LA GENOTECA
Este es uno de los aspectos más importantes y que consiste en
determinar aproximadamente cuántos clones es necesario
disponer para tener una probabilidad p de contener una
secuencia determinada de ADN. Se debe asumir una
representación de secuencias al azar, que cada inserto es de
igual tamaño y que el tamaño genómico del organismo sea
conocido. Así, si "a" es el tamaño del inserto y "b" es el
tamaño del genoma (en las mismas unidades), luego una
genoteca de N clones tendrá una probabilidad p de contener
determinada secuencia:

6. TAMAÑO DE LA GENOTECA
Así por ejemplo para E. coli con un genoma de 4.2 x 103 Kb y si
a = 20 Kb, si se fija p = 0.99 (99% de probabilidad de contener
determinada secuencia), el valor de N será de 9.6 x 102 clones.

7. GENOTECA (LIBRARY)
Es una colección de clones cada uno de los cuales contiene
un vector al que se le ha insertado un fragmento de ADN
derivado del ADN o el ARN totales de la célula o tejido.
Con el tamaño suficiente, la colección de clones debería
contener, teóricamente, todas las secuencias existentes en el
ADN del organismo.
Es posible buscar en la genoteca un clon con un fragmento
de ADN de interés mediante métodos sensibles de detección
capaces de detectar dicho fragmento entre millones de
clones diferentes.1

8. GENOTECA (LIBRARY)
Entre los usos que se le pueden dar a una genoteca están:
•El aislamiento de secuencias y genes: punto de partida
para el estudio molecular.
•La conservación del genoma: la excepcionalidad de una
muestra biológica aconseja conservar su material genético
(restos arqueológicos, especies en extinción, individuos con
patologías únicas).
•Estudio de la secuencia genómica: conocer la secuencia
completa de un genoma implica su clonación previa.

10. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Son enzimas que tienen la propiedad de reconocer
secuencias particulares de ADN y romper los
puentes fosfodiéster de los ácidos nucleicos. La
primera enzima de restricción fue extraída de la
bacteria Haemophilus influenzae y tiene la
propiedad de romper el ADN del fago lambda y el
de E. coli, pero no su propio ADN. Se le denominó
Hind II.
En las décadas siguientes se ha descrito una gran
variedad de enzimas de restricción con diversas
secuencias de corte para el ADN.

12. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Las endonucleasas de restricción, también conocidas
como enzimas de restricción o restrictasas, al cortar
las secuencias específicas del ADN generan
extremos complementarios de cadena sencilla
(cohesivos, protuberantes):
•Extremos protuberantes 5’-P
•Extremos protuberantes 3’-OH
•Que dejan extremos “romos”

13. El Nombre de las enzimas de restricción
es la abreviatura de tres letras que se
refieren al organismo de donde se
identificaron seguido de un número
romano
EcoRI Escherichia coli
HindIII Haemophilus influenzae
HoeIII Haemophilus aegyptius

19. La hibridación de ácidos nucleicos (ADN ó ARN) es un proceso por el cual se
combinan dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y con secuencia de
bases complementarias, en una única molécula de doble cadena.

22. VECTORES DE CLONADO
Son moléculas de ADN donde se pueden introducir in vitro
otros fragmentos de ADN (gen a clonar).
Estos vectores generalmente están basados en plásmidos
bacterianos y en bacteriófagos (ej. Lambda ó M13).
Partes de un vector de clonación
•origen de la replicación que sea reconocido por la ADN
polimerasa hospedante
•gen reportero (marcador seleccionable, ej. resistencia a
antibiótico)
•replicarse en copias múltiples dentro de la célula hospedante
Los vectores de clonamiento de uso general son relativamente
pequeños, puesto que son más estables (las moléculas más
grandes se degradan durante los procesos de manipulación),
pero su capacidad de clonación es menor.

23. VECTORES DE CLONADO
PLASMIDOS: moléculas de DNA que se encuentran en bacterias y se
replican en forma independiente del cromosoma
Características de los plásmidos:
•Son pequeños (miles de pares de bases)
•generalmente portan solo uno o algunos genes
•son circulares
•tienen un único origen de replicación
•no móviles
Características como vector de clonado:
• sitios únicos de corte para enzimas de
restricción
• gran número de copias (por eliminación de la
región de control)
•marcadores que permitan su reconocimiento

25. Nomenclatura utilizada para los plásmidos usados como vectores:
pBR322
p significa plásmido
BR identifica investigadores ó laboratorio; en este caso significa
Bolívar y Rodríguez
322 identifica al plásmido en particular
pEMBL8
p significa plásmido
EMBL identifica al laboratorio European Molecular Biology
Laboratory
8 identifica al plásmido en particular

26. pBR322

30. Electroporación es un
proceso para aumentar la
permeabilidad de la
membrana mediante la
aplicación de un campo
eléctrico

31. VECTORES DE EXPRESIÓN
La clonación directa, en un vector normal sin
modificación molecular (plásmido bacteriano), no suele
asegurar que el gen de interés se vaya a expresar
correctamente ni en concentración adecuada, en particular
cuando se procede a clonar genes de especies alejadas
filogenéticamente, deben considerarse algunas
características para el diseño de VECTORES DE
EXPRESIÓN adecuados.

32. CARACTERISTICAS DE UN VECTOR DE EXPRESIÓN
1- La naturaleza de las secuencias de inicio y final de la
transcripción (promotores-operadores, terminadores).
2- Las señales para el comienzo de la traducción, especialmente
sitios de unión del ribosoma y codón de inicio de la traducción.
3- La eficiencia de la traducción, lo que puede incluso llevar a
emplear codones sinónimos adaptados a la abundancia de los
correspondientes ARNt del huésped.
4- La estabilidad de la proteína recombinante en la célula huésped.
5- La localización celular de la proteína a expresar (secreción al
citoplasma o al exterior, retención en el espacio periplásmico).
6- El número de copias del gen clonado

35. Segmento de ADN
cortado con las
enzimas PstI y EcoRI
AQ9544
AQ9543
AQ664
AQ634
C’’
C’
Mapa de restricción. A
B1 B1
B
Las enzimas de restricción
C
pueden utilizarse para localizar
B2 B2
marcadores en un cromosoma.
D

36. HIBRIDACION SOUTHERN (SOUTHERN BLOT)

37. COMPARACION ENTRE
TRANSFERENCIAS
SOUTHERN, NORTHERN
Y WESTERN

38. Verificación por Southern blot 1. Aislar y cortar DNA con ER
2. Separar los fragmentos en una
+ ER
electroforesis
3-4.Transferir los fragmentos a
una membrana
5.Hibridar los fragmentos con una
sonda marcada
6.Detectar los fragmentos por el
Marcaje de la sonda
silvestre mutante
genotipos

39. AMPLIFICACION DE UNA SECUENCIA DE ADN ESPECIFICA
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA
(PCR)

40. AMPLIFICACION DE UNA SECUENCIA DE ADN ESPECIFICA
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA
(PCR)

42. HOSPEDEROS PARA UN ADN
RECOMBINANTE
El microorganismo huésped más usado en
ingeniería genética es la bacteria Escherichia
coli. Sin embargo, para muchos experimentos se
debe recurrir a otros huéspedes, como la bacteria
Bacillus subtilis, las levaduras Saccharomyces
cerevisiae y Pichia pastoris entre las más usadas.
Así mismo se requiere del uso de células vegetales
y células animales de insectos o de mamífero.

43. MEJORAMIENTO DE CEPAS MICROBIANAS
Recuperación en
cultivo líquido Fermentación
plaqueo
Reinicio Revisar la actividad
del proceso de las cepas exitosas
Mutagénesis
Cultivo sumergido
Ensayo de actividad
Post-test
Analizar nuevamente
las cepas exitosas
Preservación (screening secundario)
Scale up

47. MODIFICACION DE CELULAS VEGETALES

48. Métodos de Transformación:
Insertando genes en células vegetales
DNA in Plasmid
AGROBACTERIUM METHOD Bacterial transfer of DNA
Agrobacterium Plant Cell
Chromosome
DNA with
desired trait
Acceleration of particles Plant Cell
to plant cells
DNA PARTICLE GUN METHOD
DNA coating on microscopic
metal particles

49. De la célula modificada a la planta viva
callus culture
cell
plantlets

50. De la célula modificada a la planta viva

51. Genes Control Plant Traits
Genes code for production of proteins
Proteins influence specific plant characteristics
Disease control
Insect control
Weed control
Processing improvements
Protein
Quality improvements
Climatic tolerance

53. OMG – Organismo genéticamente modificado
Extended shelf-life tomato
(FlavrSavr Tomato)
Herbicide resistant soybean
(Roundup Ready Soybean)

54. Genes Control Plant Traits
Bt gene Bt toxin expression pest control
Bacillus thuringensis Transformed Plant Lepidopteran Control

55. Agriculture Products On the Market
Insect resistant cotton
Bt toxin kills the cotton boll worm
toxin gene from a bacteria
Source: USDA
Insect resistant corn
Bt toxin kills the European corn borer
toxin gene from a bacteria
Rootworm GM approved (2/26/03)
Normal Transgenic