bacteriofaos

1. FAGOS

2. Bacteriofago
• Son agentes infecciosos que se replican
intracelularmente de manera obligada en
bacterias, extracelularmente los fagos son
metabólicamente inertes y consisten en
principalmente en proteínas mas ácidos
nucleicos(DNA o RNA uno solo no ambos).

3. DESCUBRIMIENTO DE BACTERIOFAGOS
Frederick Twort (1915) Felix d¨Herelle(1917)
Codescubridores
Ernest Hanbury Hankin (1896)

4. COMPOSICION
• Cápside proteica (capsomeros)
• Un tipo de ácido nucleico, ADN o
ARN

5. ESTRUCTURAMORFOLOGICA

7. BACTERIOFAGOS
VIRULENTOS
Muerte de la
célula huésped
TEMPERADOS
Célula huésped
permanece viva

8. CICLO LÍTICO

10. Ensamble de las partículas del fago

11. CICLO NO LITICO

13. Ciclo lisogenico

14. Lisis de la pared y membrana celular

15. Unidades Formadoras de Placa (UFP)
• Unidad Infectiva
capaz de penetrar y
multiplicarse en una
célula huésped hasta
matarla, formando
una zona lítica en un
césped bacteriano
por ml.

17. Formación de Placas

18. Multiplicidad de infección (MOI)
• Se define MOI a el número promedio de
fago absorbida por bacteria en una mezcla
bacteria-fago.
• Se calcula mediante :
UFC UFP MOI Relación
2.24X105 2.24X106 0.10
1 fago por 10
bacterias
2.24X107 2.24X106 10.00
10 fagos por
bacteria
3.45X107 3.45X107 1.00
1 fago por
bacteria.

19. Curva de crecimiento en un solo
paso

20. • Periodo latente: Lapso entre la infección y la
liberación de la progenie.
• Tamaño de estallido: Cantidad de fagos
liberados/célula.
• Multiplicidad de infección MOI: el número de
fagos/células en una mezcla bacterias-fagos.
• Eficiencia de plaqueo: numero de placas relativas que
un fago puede producir, se compara generalmente con
otra estimación de mayor concentración de fagos
conocida
• Amplitud de huésped: las cepas o especies que son
susceptibles a un fago determinado

21. Lisis artificial

22. BACTERIOFAGO T4
• Contiene un gran genoma de ADN de doble cadena lineal.
• Receptor: lipopolisacárido , una importante proteína de membrana
externa.
• Contiene HMC
• La glicosilación de HMC protege de las endonucleasas del hospedero.
• El DNA es repetitivo en los extremos de las cadenas o redundancia
terminal( concatémeros o repeticiones en tándem) que le permite la
replicación en circulo rodante.
• La endolisina lisa pared celular y Holin membrana celular.

23. BACTERIOFAGO M13
• Filamentoso
• Se compone de ADN de cadena sencilla
circular de longitud de 6407 nucleótidos
• Sitio de fijacion: P3
• Receptor: pili F (tip), tol AQR en membrana
interna.
BACTERIOFAGO M13

24. BACTERIOFAGO LAMBDA
BACTERIOFAGO LAMBDA
 Contiene un ADN de doble cadena lineal con extremos cohesivos.
 Receptor: transportador de maltosa LamB

25. Aplicaciones
• Fagoterapia (D’ Herelle 1917)
• Transducción generalizada y especifica (J.
Lederberg-Zinder, Lederberg-Lederberg-
Morse 1951, 1956 respectivamente)

26. ARTICULO
Propiedades estructurales y
biológicas de Mycoplasmavirus
MVL3: Una interacción inusual Virus-
Procarionte.

27. ANTECEDENTES
• Gourlay aisló distintos grupos de
Mycoplasma virus.
• Maniloff et al. Aislaron 3 grupos.
• Grupo 1 MVL51: virión desnudo en forma
de bala con DNAcs circular de 1.5x
10^6Da
• Grupo 2 MVL2: virión de DNAdc circular
7.8x10^6Da
• Ambos grupos describen un ciclo no lítico
citocida

28. OBJETIVOS GENERALES:
• Determinar las características estructurales y
biológicas de MVL3.
• Determinar el ciclo infectivo del fago MVL3 en
las células huésped de Acholeplasma laidlawii.

29. Métodos y materiales:
MEDIOS DE CULTIVO Y SOLUCIÓN REGULADORA:
• Caldo triptosa
• Agar de triptosa
• Tris-EDTA-NaCl (pH 8.0)
Células y virus:
• 1305•K2 Acholeplasma laidlawii
• MVL3

30. ESTUDIOS ESTRUCTURALES
OBJETIVO
Describir la estructura de MVL3 asi como la forma y
peso molecular de su DNA

31. ESTUDIOS ESTRUCTURALES:
• Figura 7. MVL3 teñidos
negativamente con
ácido fosfotungstico al
2%. Las fotografías
fueron tomadas a
50000X aumentos. Los
viriones tienen una
cabeza poliédrica de
aproximadamente 60
nm y una cola corta
de 20 nm conectadas
a la cabeza por un
collar.

32. • Figura 8. Histograma del
DNA de MVL3. El
histograma muestra el
largo de 93 moléculas. A
partir de estas medidas se
determino un peso
molecular de (26 ± 0.6) x

33. Conclusiones
• Las cabezas de virus son poliédricas
• Los viriones tienen una cola corta adherida a
un cuello que frecuentemente tiene fibras.
• Las moléculas de DNA del MVL3 son lineales
con un peso molecular estimado de (26 + 0.6)
x 106

34. OBJETIVO
Describir la estructura de MVL3 así como la
forma y peso molecular de su DNA
Adsorción de virus:

35. Adsorción de virus:
Cultivo
bacteriano
1:5
MOI 1

36. Objetivo:
• Describir el crecimiento de MV13
después de la infección
Crecimiento en un solo paso

37. Crecimiento en un solo paso:
Dilución
Caldo triptosa
precalentado
Diferentes
tiempos.
Cultivo
bacteriano
MOI 0.1
37 ºC / 30 min
10-2 10-4

38. • Fig. 1 Crecimiento en un solo paso
de MVL3. En el tiempo cero células
y virus fueron mezclados con una
MOI de aproximadamente de 0.1 e
incubados a 37°C. El cultivo fue
diluido después de 30 minutos. Las
muestras fueron tomadas a
diferentes tiempos y analizadas
para PFU. La grafica
semilogarítmica muestra el inicio
de la producción del virus después
de un periodo de latencia de
aproximadamente 90 min. La
liberación del virus continua como
función lineal del tiempo.

39. CONCLUSIONES:
• El tiempo de latencia de MVL3 es de
90min
• La liberación del virus continua por mas
de 5 horas

40. Objetivo :
Determinar el periodo de liberación de
partículas virales
Producción de virus por largo
tiempo

41. Producción de virus por largo
tiempo:
MOI
10
Muestras:
c/30
minutos
(1-4 horas)
c/2 horas
12 horas después
Monitorear
durante el
día.

42. • Figura 2. Crecimiento de MVL3 por tiempo prolongado. Las células fueron
infectadas a una MOI de 10. El titulo final de virus es alrededor de 120
veces mayor que el número de unidades infectadas.

43. CONCLUSIONES:
• La liberación del virus continua por
alrededor de 10 a 15 horas.
• La producción promedio de virus fue de
alrededor de 120.

44. Objetivo :
Determinar la existencia de partículas
virales intracelulares infecciosas durante el
período de latencia.
Lisis artificial

45. Lisis artificial
MOI 0.1
37 ºC / 30 min
Se diluyó 100 veces.
Se tomaron muestras
por duplicado a
diferentes tiempos.
+ Triton X-
100 0.1%
10-410-5

46. Figura. 3. Lisis artificial. Las células
fueron infectadas a una MOI de 0.1
y 30 min después el cultivo fue
diluido 100 veces. Las muestras
duplicadas fueron tomadas a
diferentes tiempos. Una fue
sembrada directamente para
determinar células infectadas y
virus libres (o). La otra fue lisada
con la adición de tritón X-100. Fue
eliminado por dilución y la muestra
fue sembrada para determinar los
virus intracelulares y virus libres.
(●)

47. CONCLUSIONES:
• Se encuentran partículas maduras del
virus a partir de los 70 minutos de
infección.
• La maduración de los virus y la liberación
es continua en células infectadas

48. Objetivo :
• Determinar el tamaño del estallido
Experimento de estallido

49. Experimento de estallido:
MOI 1
37 ºC / 30 min
108 en un volumen
de 200mL
100 tubos
Determinaron UFP 8 horas.
100 tubos
Determinaron UFP 24
horas.

50. Tabla 1. Datos experimentales del estallido simple.

51. Figura 4. Distribución de los datos obtenidos en el experimento de
estallido simple. Cada barra vertical representa un tubo, las barras
engrosadas representan dos tubos, las flechas indican el promedio de
título viral para cada tiempo.

52. CONCLUSIONES:
• Los virus MVL3 se liberan desde las
células infectadas sobre un tiempo
extendido por un mecanismo de
liberación no lítico

53. Objetivo :
• Determinar el tamaño del estallido
Cinética de estallido

54. 20 mL
5 mL
1 mL es
filtrado
Este filtrado fue
tomado a diferentes
tiempos.
4,8, 24 hrs.
Figura 5. Ensamblaje de
jeringa- filtro utilizado
para determinar la
cinética de estallido
simple.
Cinética de estallido

55. Tabla 2. Datos de la
cinética de estallido
simple.

56. CONCLUSIONES:
• Las células individuales afectadas
producen virus sobre un período
extendido
• La liberación total de virus por célula
infectada varía sobre un rango de orden
de 100 de célula a célula
• El tiempo en el cual las células
individuales afectadas comienzan a liberar
virus varía de célula a célula

57. Objetivo :
• Determinar si la viabilidad de la
célula hospedera tiene algún efecto
sobre la producción del virus.
VIABILIDAD DE CÉLULAS INFECTADAS POR
MVL3

58. VIABILIDAD DE CÉLULAS INFECTADAS POR
MVL3:
MOI 10
37 ºC/9 horas
K2
Se tomaron
muestras a
diferentes
tiempos.
30 min, 1 hora, 9
horas.
UFC

59. • Figura 6. Viabilidad de células
infectadas por MVL3. Una parte
no fue infectada y la otra fue
infectada a una MOI de 10. Ambas
fueron medidas a varios tiempos
de incubación a 37ºC
● Células infectadas
o Células no infectadas

60. CONCLUSIONES:
• Mientras las células se encuentren
infectadas ya no son viables sin embargo
los virus de la progenie son liberándose
desde estas células durante muchas
horas.

61. CONCLUSIONES:
• El DNA de MVL3 es lineal con un peso promedio de
(26 ± 0.6) x106.
• La adsorción de MVL3 es de alta especificidad.
• MVL3 posee un ciclo no lítico.
• El total de virus liberados varia alrededor de100
veces de célula a célula.

62. BIBLIOGRAFIA
• Tortora F. 2007. Introduccion a la microbiologia. 9ª ed. Medica
Panamericana. Buenos aires ,p.p 395-400
• Brown .2008. Genomas. 3ª ed. Medica Panamericana. p.p 254-257.
• Jenkins.1986. Genetica. 2ª ed. Reverte. España , pp.476-482
• https://learning.uonbi.ac.ke/courses/SZL311/scormPackages/path
_2/335_bacteriophage_m13_a_leaky_virus.html
• http://genemol.org/biomolespa/fagos-lambda/fago-lambda.html

63. DESARROLLO EXPERIMENTAL
Aislamiento de
bacteriófagos de fuentes
naturales

64. OBJETIVOS:
•Conocer algunos aspectos de la metodología empleada
en el trabajo con bacteriófagos.
•Establecer algunas de las propiedades de las partículas
fáticas que permiten su identificación.
•Aislar bacteriófagos a partir de muestras de aguas
negras.
•Determinar la cantidad y ciclo de vida de los fagos
aislados en base a su morfología de placa.

65. AISLAMIENTO DE BACTERIÓFAGOS A PARTIR DE MUESTRAS
DE AGUAS NEGRAS
a. Día 1 Preparación de cepas indicadoras
5.0 ml
Caldo L
37ºC
18 hrs.
Sin agitación
Muestra
de Aguas
Negras
Agitar
Filtrar 10ml.
Aprox.
Esterilizar
por filtrado
5ml.
Conservar en
refrigeración
b. Día 2 Tratamiento de las muestras
 E. coli W3110
 E. coli AB1157
 E. coli JC4046 o TG1
 E. coli B 837
 B .subtilis SB19
 S. typhimurium LT2
 K. pneumoniae
 S. aureus

66. 0.1 ml
3.0 ml agar
fundido (45º)
Agar L
Dejar
solidificar
3 gotas separadas
del filtrado
37ºC
18 hrs.
DÍA 3
Registrar los
resultados hasta
el tercer día
d. Determinación de la concentración de bacteriófagos en las muestras de
agua
 De acuerdo a la prueba de gota, preparar diluciones de los filtrados de aguas
positivas
0.1 ml
bacteria
indicadora
0.1 ml
dilución del
filtrado
Agar L
37ºC
18-24 hrs.
(Cada dilución por
duplicado)
3.0 ml
agar
fundido
(45º)
c. Día 2 prueba de gota del filtrado
 E. coli W3110
 E. coli AB1157
 E. coli JC4046 o TG1
 E. coli B 837
 B .subtilis SB19
 S. typhimurium LT2
 K. pneumoniae
 S. aureus

67.  Describir la morfología de las placas líticas obtenidas
 Contar el número de placas líticas obtenidas
 Calcular el título del fago o fagos presentes en la muestra
DIFERENCIACIÓN DE FAGOS TEMPERADOS, LÍTICOS Y NO LÍTICOS POR
MORFOLOGÍA DE PLACA
Realizar las diluciones indicadas en la tabla con solucion esteril
Bacteriófago Dilución Cepa indicadora Medio Agar blando
λ 10-4, 10-5 W3110 Lambda Agar blando lambda
T 4 10-4, 10-5 W3110 Luria Agar blando
M13 10-4, 10-5 TGI o JC4046 2YT Agar blando
DÍA 4
DÍA 2
0.1 ml
bacteria
indicadora
0.1 ml
dilución
3.0 ml
agar
blando
(45º)
37ºC/ 18hrs.
(Cada dilución por
duplicado)
Medio rico
solido
 Describir la morfología
de las placas
 Calcular el UFP/ml de
cada lisado fágico.

68. C. Determinación de la amplitud de huésped de los bacteriófagos T4, λ y M13
Seleccionar tres
placas líticas
aisladas y con la
misma morfología
Cortar una punta de
micropipeta al diámetro
de las colonias
seleccionadas
0.5ml caldo
rico E. coli W3110
 E. coli AB1157
 E. coli JC4046 o TG1
 E. coli B 837
 B .subtilis SB19
 S. typhimurium LT2
 K. pneumoniae
 S. aureus
0.1 ml cultivo
de 18 hrs.
Agar fundido
solidificar
Colocar
una
gota
37ºC
18-24 hrs.
Registrar los
resultados
DÍA 3