CRISPR Congreso SEDEN Cáceres Nov 2019
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Utilidad de la Tecnología CRISPR en Endocrinología.
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CRISPR Congreso SEDEN Cáceres Nov 2019
- 1. Terapia CRISPR para Endocrinólogos 13º Congreso de la Sociedad Extremeña de Diabetes, Endocrinología y Nutrición Dr. Jesús Moreno Fdez. HGU Ciudad Real. SESCAM Facultad de Medicina de Ciudad Real. UCLM Cáceres, 22 Nov 2019 #SEDEN2019 @TechnoDiabetes
- 2. 13º Congreso de la Sociedad Extremeña de Diabetes, Endocrinología y Nutrición Dr. Jesús Moreno Fdez. HGU Ciudad Real. SESCAM Facultad de Medicina de Ciudad Real. UCLM Cáceres, 22 Nov 2019
- 3. 13º Congreso de la Sociedad Extremeña de Diabetes, Endocrinología y Nutrición Dr. Jesús Moreno Fdez. HGU Ciudad Real. SESCAM Facultad de Medicina de Ciudad Real. UCLM Cáceres, 22 Nov 2019
- 4. 13º Congreso de la Sociedad Extremeña de Diabetes, Endocrinología y Nutrición Dr. Jesús Moreno Fdez. HGU Ciudad Real. SESCAM Facultad de Medicina de Ciudad Real. UCLM NUCLEÓTIDO Cáceres, 22 Nov 2019
- 5. 13º Congreso de la Sociedad Extremeña de Diabetes, Endocrinología y Nutrición Dr. Jesús Moreno Fdez. HGU Ciudad Real. SESCAM Facultad de Medicina de Ciudad Real. UCLM Desoxirribosa Ribosa Cáceres, 22 Nov 2019
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- 7. 13º Congreso de la Sociedad Extremeña de Diabetes, Endocrinología y Nutrición Dr. Jesús Moreno Fdez. HGU Ciudad Real. SESCAM Facultad de Medicina de Ciudad Real. UCLM Cáceres, 22 Nov 2019
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- 9. CRISPS
- 10. ¿Terapia CRISPR?
- 15. Francisco J. Martínez Mojica Dpto. Microbiología
- 17. CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas Mojica FJ et al. Mol Microbiol. 1993; 9:613-21 Haloferax mediterranei
- 18. CRISPR CRISPR CRISPRCRISPRCRISPRCRISPR CRISPRCRISPRCRISPRCRISPR CRISPR CRISPR ADN virus fago ADN bacterias/arqueas
- 19. ¿Qué hace el DNA de un virus (fago) en medio del DNA de una bacteria? ?? ? ? ? ? ? ?
- 22. CRISPR-CAS 1. Sistema inmune Heredable 2. Composición genómica: Repeticiones (CRISPR) + proto/espaciador (DNA fago) + + DNA codificador de CAS 3. Herramienta capaz de cortar ADN específicamente (RNA guía*)
- 24. “UN REGALO INESPERADO DE LAS BACTERIAS QUE HA REVOLUCIONADO LA BIOTECNOLOGÍA” L. MONTOLIU
- 25. EDICIÓN GÉNICA CON SISTEMA CRISPR/CAS9 CRISPR RNA Tracr RNA
- 26. Science 17 Aug 2012: Vol. 337, Issue 6096, pp. 816-821 DOI: 10.1126/science.1225829 Jennifer A. Doudna Enmanuelle Champertier
- 27. 1:100
- 28. GENOMA HUMANO 6.000 x 106 letras 21.000 genes codificantes de proteínas 4.000 enfermedades por mutaciones en ADN
- 29. Corregir mutaciones Activar o desactivar genes Incrementar o reducir la expresión de genes Visualizar genes (CRISPRainbow) Creación organismos “CRISPRzados” (Knockout y avatar) Descubrimiento de nuevas dianas farmacológicas Crear resistencia a infecciones Facilitar xenotrasplantes Promover la herencia no mendeliana (impulso génico) APLICACIONES TECNOLOGÍA CRISPR
- 30. -AAA-ACT-TAC-ACC-CAG-GTC-AAG- Lys-Thr-Tyr-Thr-Gln-Val-Lys -AAA-ACT-TAA-ACC-CAG-GTC-AAG- Lys-Thr-STOP INACTIVACIÓN DE GENES MEDIANTE CRISPR-CAS
- 31. ACTIVACIÓN DE GENES MEDIANTE CRISPR-CAS
- 32. CRISPRAINBOW (arcoíris CRISPR) Ma et al. Nature Biotech 2016; 34: 528-30
- 33. CRISPRAINBOW (arcoíris CRISPR) Ma et al. Nature Biotech 2016; 34: 528-30
- 35. Wang et al. Cell. 2013. 9;153:910-8
- 36. Wu et al. Cell Stem Cell 2013; 13; 259-62
- 37. Malaney P et al. Cancer Lett. 2014. 1;344:1-12
- 39. Román-Rodríguez FJ et al. Cell Stem Cell. 2019 Sep 17
- 41. Metais et al. Blood Adv 2019 Nov 12: 3379-92
- 42. Papasavva P et al. Mol Diagn Ther. 2019; 23:201-222
- 43. Papasavva P et al. Mol Diagn Ther. 2019; 23:201-222
- 44. Papasavva P et al. Mol Diagn Ther. 2019; 23:201-222
- 46. Allers et al. Curr Opin Virol 2015; 14: 24-9
- 47. Cyranoski D et al. Nature 2018; 563:607-8
- 48. 40 millones de personas infectadas a nivel mundial 2 millones son niños El VIH ya ha matado a otros 40 millones de personas 1 millón de personas/año https://www.who.int/features/factfiles/hiv/es/
- 49. 1) Seguridad: o Mutaciones off-target o Mosaicismos genéticos o Inmunidad frente a Cas y/o virus vectores o Eventos recombinantes impredecibles o Permanencia prolongada de virus vectores en genoma o Mutaciones permanentes en stem cells LIMITACIONES TECNOLOGÍA CRISPR
- 50. 2) Eficiencia: o Preferencia por recombinación homóloga (st interfase) o Preferencia por fases del ciclo celular o Gran tamaño de CRISPR-Cas comparado con virus vectores o Requerimientos secuencias PAM LIMITACIONES TECNOLOGÍA CRISPR
- 51. ¿Cuáles podrían ser las aplicaciones de CRISPR-Cas en Endocrinología?
- 52. Clínica Enfermedad Genes mutantes Talla baja Déficit GH congénito BTK, ELF4, GH1, GHRH, POU1F1, RNPC3, SOX3 Gigantismo+PP isosexual Mc Cune-Albright 20q13.2 (mutación activadora GNAS1) SIADH SIADH Cromosoma X (mutación activadora gen V2-receptor ADH) Diabetes insípida Central Nefrogénica 4p16 (gen WFS) Cromosoma X (mutación inactivadora gen V2-receptor ADH) Obesidad hipotalámica Prader-Willi Microdelección 15q11-q13 Pubertad retrasada Sd Kallman KAL1, FGFR1, PROKR2, PROK2, CHD7, FGF8 Pseudohermafrodistismo Sd Morris Xq12 Hipercalcemia Hipercalcemia hipocalciúrica familiar 3q21.1 (CASR) Hipocalcemia Pseudohipoparatiroidismo 20q13 (mutación inactivadora GNAS1)
- 57. MEN1 - 11q13 (mutación inactivadora menina) MEN2 (A, B y CMTF) – 10q11 (mutación activadora ret)
- 58. Guo D. Stem Cell Res. 2017; 18:67-69
- 59. Hadoux J. Stem Cell Res. 2018;26:8-16
- 61. CRISPR “LA MAYOR INNOVACIÓN DE LA BIOTECNOLOGÍA DEL SIGLO XXI”
- 64. “Pese a sus limitaciones actuales, deberíamos considerar la edición génica (CRISPR-Cas) como una de las herramientas más prometedoras para el tratamiento a medio plazo de las enfermedades endocrinológicas de origen genético” https://starwarsintrocreator.kassellabs.io/?ref=redirect#!/BLuE9qKkEV2AMp59iEkS/edit
- 65. TRATAMIENTO ENFERMEDADES RARAS - < 1/2.000 personas - 6.500 enfermedades raras - 6.5% de la población de España
- 66. Otras formas de edición génica:
- 69. 1:100
Notas del editor
- Si destrenzáramos el ADN observaríamos una columna de azúcar-fosfato que mantiene enfrentadas a diferentes bases nitrogenadas. Cada escalón de esta doble escalera está formado por….
- Cada escalón (NUCLEÓTIDO) está formado por una molécula de azúcar (pentosa), una base nitrogenada y un grupo fosfato. La unión solo de la pentosa con la base nitrogenada forma un Nucleósido. Hay dos tipos de escalones, los hechos de ribosa (ARN) y los de desoxirribosa (ADN, con un átomo menos de oxígeno).
- Diferencias ADN vs ARN: - ADN es doble cadena, ARN es cadena simple. En ARN las Timinas son sustituidas por Uracilo (ambas son bases nitrogenadas). En ADN el azúcar utilizado (desoxirribosa) contiene 1 átomo menos de O2 (solo 4) Desoxiribonucleico. La pentosa del ARN es la Ribosa (5 átomos de O2).
- En el ADN cada 3 nucleótidos (triplete o codón) determinarán un aminoácido. El ADN no sale del núcleo, se TRANSCRIBE en copias de ARN formado por codones. Cada codón en los ribosomas será TRADUCIDO en un aminoácido. La unión de Aas dará lugar a la formación de todas las proteínas.
- Lectura recomendada. Dicho podemos continuar con el tema de hoy…
- Dicho podemos continuar con el tema de hoy…
- Repetidas Palindrómicas – se leen igual de izq a derecha que de derecha a izq Cortas Agrupadas Regularmente interspeciadas -
- Homo sapiens también posee este mecanismo 8% de nuestro genoma corresponde a ADN remanente de retrovirus que nos ha infectado durante la evolución.
- La especificidad la da el RNA guía, en las enzimas de restricción clásicas la da la el reconocimiento de la proteína sobre la molécula de ADN (proceso menos específico y más caro). Protoespaciador: secuencia DNA idéntica de la que deriva el espaciador PAM (Protospacer adjacent motif): secuencias 2-6 paras de bases de DNA que presentan los fagos y no el DNA bacteriano. Es necesario para la unión de CAS al DNA si no existe, CAS no se une y no actúa permite diferenciar a CRISPR-Cas entre el propio DNA bacteriano y el viral. Es un sistema de seguridad ancestral.
- CRISPR RNA – RNA que hace de diana TRAC RNA – RNA que une el CRISPR RNA a Cas9 Los dos anteriores juntos se llaman Guide RNA, es un molécula de RNA quimérico que puede unirse a Cas9 y buscar una diana específica en el DNA Protospacer adjacent motif (PAM) is a 2-6 base pair DNA sequence immediately following the DNA sequence targeted by the Cas9 nuclease in the CRISPR bacterial adaptive immune system. PAM is a component of the invading virus or plasmid, but is not a component of the bacterial CRISPR locus. Cas9 will not successfully bind to or cleave the target DNA sequence if it is not followed by the PAM sequence. PAM is an essential targeting component (not found in bacterial genome) which distinguishes bacterial self from non-self DNA, thereby preventing the CRISPR locus from being targeted and destroyed by nuclease.
- Las opciones de edición génica previas incluían el diseño de grandes proteínas que reconociesen el DNA a cortar. CRISPR requiere moléculas de menor tamaño (hay que meterlo en el núcleo celular), diseño más rápido y barato. Posteriormente la rotura de la doble cadena de ADN puede ser reparada de dos formas donde intervienen las ADN polimerasas. La recombinación no homóloga o unión de extremos no homólogos (cuya sigla en inglés es NHEJ) es una ruta que repara roturas en la doble hebra de ADN. Es denominada no homóloga porque los extremos rotos son directamente ligados sin la necesidad de un molde homólogo, en contraste con la recombinación homóloga, que requiere una secuencia homóloga para guiar la reparación. Uno de los grandes inconvenientes en edición génica es cómo se repara luego ese ADN cortado. La recombinación NO homóloga supera a la homóloga. SI OFRECEMOS UN MOLDE DE DNA HOMOLOGO AL QUE QUEREMOS CORREGIR (Y SIN LA MUTACIÓN) SE CORRIGE UNA MUTACION LA APLICABILIDAD DE ESTA TECNOLOGIA A NUESTRO GENOMA ES ENORME
- Es decir, la imagen clásica de nuestro genoma se da en la Metafase mitótica (fase M, cuando los cromosomas están más contraídos y sus bordes están más definidos). Y aquí no se da la HDR. Nuestro genoma va a ser el objetivo de la edición génica. Solo el 2% del genoma codifica proteínas. El 8% del genoma son secuencias CRISPR+Cas LAS APLICACIONES DE LA TECNOLOGÍA CRISPR EN BIOMEDICINA SON INMENSAS CON 21.000 GENES CODIFICANTES Y 4.000 ENFERMEDADES CONOCIDAS POR MUTACIONES ESPECÍFICAS
- La corrección de mutaciones ya la hemos visto. Otros ejemplos.
- Lo más sencillo es inactivar un gen. Tenemos un gen formado de codones (tripletes), cada uno codificando un futuro Aa. Diseñamos un RNA guía específico que corta el ADN. Esperamos la recombinación No homóloga que en algún momento pondrá una base que no codifique un Aa. Vualá! Se para la síntesis proteíca y no se sintetiza la proteína.
- dCas9: Cas9 mutante con capacidad exclusiva de fijación a DNA (guiada por RNA guía). Tiene inactivados los dominios de corte para la doble cadena DNA. P300: Proteína activadora de trascripción. RNA polimerasa: enzima que sintetiza RNA a partir de DNA
- Otra opción es la visualización directa de genes o secuencias específicas de ADN, unimos el RNA guía a una molécula fluorescente. A lack of techniques to image multiple genomic loci in living cells has limited our ability to investigate chromosome dynamics. Here we describe CRISPRainbow, a system for labeling DNA in living cells based on nuclease-dead (d) Cas9 combined with engineered single guide RNA (sgRNA) scaffolds that bind sets of fluorescent proteins. We demonstrate simultaneous imaging of up to six chromosomal loci in individual live cells and document large differences in the dynamic properties of different chromosomal loci.
- Vualá de nuevo! Podemos ya sabemos donde estaban los genes o secuencias que nos interesaban. Una gran aplicación para la embriología y su patología.
- A) Las aplicaciones continúan acortando el tiempo y el dinero necesario para generar animales mutantes o knout. B) Y los más interesante, la aplicación para la cura de enfermedades. Lo primero fue la curación de una enfermedad congénita (ceguera congénita en ratones por mutación gen CRYGC)
- No solo eso, sino que ahora Podemos fácilmente generar animals con varias mutaciones simultáneas. Mice carrying mutations in multiple genes are traditionally generated by sequential recombination in embryonic stem cells and/or time-consuming intercrossing of mice with a single mutation. The CRISPR/Cas system has been adapted as an efficient gene-targeting technology with the potential for multiplexed genome editing. We demonstrate that CRISPR/Cas-mediated gene editing allows the simultaneous disruption of five genes (Tet1, 2, 3, Sry, Uty--8 alleles) in mouse embryonic stem (ES) cells with high efficiency. Coinjection of Cas9 mRNA and single-guide RNAs (sgRNAs) targeting Tet1 and Tet2 into zygotes generated mice with biallelic mutations in both genes with an efficiency of 80%. Finally, we show that coinjection of Cas9 mRNA/sgRNAs with mutant oligos generated precise point mutations simultaneously in two target genes. Thus, the CRISPR/Cas system allows the one-step generation of animals carrying mutations in multiple genes, an approach that will greatly accelerate the in vivo study of functionally redundant genes and of epistatic gene interactions.
- Introducimos maquinaria CRISPR-Cas9 guiado al gen CRYGC junto a los oligonucleótidos sanos, esperamos la recombinación homóloga (blastocitos reproduciéndose continuamente). Voalá!! The CRISPR-Cas9 system has been employed to generate mutant alleles in a range of different organisms. However, so far there have not been reports of use of this system for efficient correction of a genetic disease. Here we show that mice with a dominant mutation in Crygc gene that causes cataracts could be rescued by coinjection into zygotes of Cas9 mRNA and a single-guide RNA (sgRNA) targeting the mutant allele. Correction occurred via homology-directed repair (HDR) based on an exogenously supplied oligonucleotide or the endogenous WT allele, with only rare evidence of off-target modifications. The resulting mice were fertile and able to transmit the corrected allele to their progeny. Thus, our study provides proof of principle for use of the CRISPR-Cas9 system to correct genetic disease.
- Podemos generar ratones avatar con tumors con las mismas mutaciones específicas que los tumors que tengamos, para experimentar terapias sobre ellos.MEDICINA PERSONALIZADA. Over the last few decades, study of cancer in mouse models has gained popularity. Sophisticated genetic manipulation technologies and commercialization of these murine systems have made it possible to generate mice to study human disease. Given the large socio-economic burden of cancer, both on academic research and the health care industry, there is a need for in vivo animal cancer models that can provide a rationale that is translatable to the clinic. Such a bench-to-bedside transition will facilitate a long term robust strategy that is economically feasible and clinically effective to manage cancer. The major hurdles in considering mouse models as a translational platform are the lack of tumor heterogeneity and genetic diversity, which are a hallmark of human cancers. The present review, while critical of these pitfalls, discusses two newly emerging concepts of personalized mouse models called "Mouse Avatars" and Co-clinical Trials. Development of "Mouse Avatars" entails implantation of patient tumor samples in mice for subsequent use in drug efficacy studies. These avatars allow for each patient to have their own tumor growing in an in vivo system, thereby allowing the identification of a personalized therapeutic regimen, eliminating the cost and toxicity associated with non-targeted chemotherapeutic measures. In Co-clinical Trials, genetically engineered mouse models (GEMMs) are used to guide therapy in an ongoing human patient trial. Murine and patient trials are conducted concurrently, and information obtained from the murine system is applied towards future clinical management of the patient's tumor. The concurrent trials allow for a real-time integration of the murine and human tumor data. In combination with several molecular profiling techniques, the "Mouse Avatar" and Co-clinical Trial concepts have the potential to revolutionize the drug development and health care process. The present review outlines the current status, challenges and the future potential of these two new in vivo approaches in the field of personalized oncology.
- Esto es lo que hicieron en el CNIO este Verano pero con una caso de anemia de Fanconi. Biopsia MO, CRISPR-Cas9 sobre secuencia errónea del gen HBB en células madre, en este caso esperaron a NHEJ y que las propias celulas que se curasen iban a vivir más y proliferar major (ventaja proliferative). Non-homologous end-joining (NHEJ) is the preferred mechanism used by hematopoietic stem cells (HSCs) to repair double-stranded DNA breaks and is particularly increased in cells deficient in the Fanconi anemia (FA) pathway. Here, we show feasible correction of compromised functional phenotypes in hematopoietic cells from multiple FA complementation groups, including FA-A, FA-C, FA-D1, and FA-D2. NHEJ-mediated repair of targeted CRISPR-Cas9-induced DNA breaks generated compensatory insertions and deletions that restore the coding frame of the mutated gene. NHEJ-mediated editing efficacy was initially verified in FA lymphoblastic cell lines and then in primary FA patient-derived CD34+ cells, which showed marked proliferative advantage and phenotypic correction both in vitro and after transplantation. Importantly, and in contrast to homologous directed repair, NHEJ efficiently targeted primitive human HSCs, indicating that NHEJ editing approaches may constitute a sound alternative for editing self-renewing human HSCs and consequently for treatment of FA and other monogenic diseases affecting the hematopoietic system.
- Imaginaros las aplicaciones en las enfermedades monogénicas bien conocidas en Medicina. Vamos a empezar por órganos que se reproduzcan mucho y que podamos extraer fácilmente. Anemia falciforme: sustitución en el gen HBB (11p) Timidina por Adenina en ADN de ambas copias (autosómica recesiva) origina una lectura diferente del codón traduciéndose en un aminoácido Valina en lugar de Glutámico. Esto produce una Hb mutante que deforma el eritrocito, acorta su vida media y produce trombosis allá por donde pasan.
- Induction of fetal hemoglobin (HbF) via clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9-mediated disruption of DNA regulatory elements that repress γ-globin gene (HBG1 and HBG2) expression is a promising therapeutic strategy for sickle cell disease (SCD) and β-thalassemia, although the optimal technical approaches and limiting toxicities are not yet fully defined. We disrupted an HBG1/HBG2 gene promoter motif that is bound by the transcriptional repressor BCL11A. Electroporation of Cas9 single guide RNA ribonucleoprotein complex into normal and SCD donor CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells resulted in high frequencies of on-target mutations and the induction of HbF to potentially therapeutic levels in erythroid progeny generated in vitro and in vivo after transplantation of hematopoietic stem and progenitor cells into nonobese diabetic/severe combined immunodeficiency/Il2rγ-/-/KitW41/W41 immunodeficient mice. On-target editing did not impair CD34+ cell regeneration or differentiation into erythroid, T, B, or myeloid cell lineages at 16 to 17 weeks after xenotransplantation. No off-target mutations were detected by targeted sequencing of candidate sites identified by circularization for in vitro reporting of cleavage effects by sequencing (CIRCLE-seq), an in vitro genome-scale method for detecting Cas9 activity. Engineered Cas9 containing 3 nuclear localization sequences edited human hematopoietic stem and progenitor cells more efficiently and consistently than conventional Cas9 with 2 nuclear localization sequences. Our studies provide novel and essential preclinical evidence supporting the safety, feasibility, and efficacy of a mechanism-based approach to induce HbF for treating hemoglobinopathies.
- El espectro de enfermedades donde ya se ha hecho esto hasta ahora en en modelos animales mutantes es amplio, fundamentalmente en enf monogénicas hematologicas (por ventajas del tejido), enf congénitas del metabolismo, cegueras congénitas,.
- Y sigue: dislipemias congénitas, enf neurodegenerativas, etc. Con modelos ratón, rata y pez zebra.
- Rare diseases pose a global challenge, in that their collective impact on health systems is considerable, whereas their individually rare occurrence impedes research and development of efficient therapies. In consequence, patients and their families are often unable to find an expert for their affliction, let alone a cure. The tide is turning as pharmaceutical companies embrace gene therapy development and as serviceable tools for the repair of primary mutations separate the ability to create cures from underlying disease expertise. Whereas gene therapy by gene addition took decades to reach the clinic by incremental disease-specific refinements of vectors and methods, gene therapy by genome editing in its basic form merely requires certainty about the causative mutation. Suddenly we move from concept to trial in 3 years instead of 30: therapy development in the fast lane, with all the positive and negative implications of the phrase. Since their first application to eukaryotic cells in 2013, the proliferation and refinement in particular of tools based on clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein (Cas) prokaryotic RNA-guided nucleases has prompted a landslide of therapy-development studies for rare diseases. An estimated thousands of orphan diseases are up for adoption, and legislative, entrepreneurial, and research initiatives may finally conspire to find many of them a good home. Here we summarize the most significant recent achievements and remaining hurdles in the application of CRISPR/Cas technology to rare diseases and take a glimpse at the exciting road ahead. Key Points Accelerated molecular characterization of rare disease cases and the advent of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein (Cas) technology promise to enable rapid therapy development for many rare genetic diseases. The adoption of editing technology reduces the time from conception to evaluation of advanced therapy approaches compared to gene addition, encouraging an unprecedented number of research groups and studies to focus on rare diseases.As CRISPR/Cas-based tools are customized to tackle rare diseases in clever ways, the results reveal and help address remaining unknowns and obstacles in the clinical translation of the new technology, including those concerning efficiency, specificity, delivery, immunity, preservation of stemness, and avoiding malignant transformation.
- Por último, os comento la posibilidad de usar CRISP para lo que existe en la naturaleza. Permitir la resistencia a virus. En este caso al VIH. con mucho potencial, la creación de individuos resistentes a diferentes infecciones
- El síndrome MEN1 está provocado por la presencia de mutaciones que inactivan el gen supresor de tumores MEN1. El gen MEN1 se sitúa en el cromosoma 11q13 y codifica para la menina, una proteína nuclear de 610 aminoácidos. Esta proteína no tiene homología de secuencia con otras proteínas humanas conocidas. Este gen está probablemente implicado en la regulación de diversas funciones celulares tales como la replicación y la reparación del ADN. El MEN2 es un trastorno genético, con herencia autosómica dominante y penetrancia de casi el 100%, causado por mutaciones missense (cambio de un aminoácido por otro) en la línea germinal del protooncogén RET (REarregement during Transfection). El gen RET se sitúa en el cromosoma 10 (10q11.2) y está constituido por 21 exones. Codifica un receptor tirosín-kinasa que se expresa en las células derivadas de la cresta neural e interviene en procesos de crecimiento y diferenciación celular. Sus mutaciones afectan fundamentalmente a 4 tipos de tejidos, todos derivados de la cresta neural: células C tiroideas, paratiroides, células cromafines de la médula adrenal y plexo autonómico entérico5. En el CMT el desarrollo del tumor se produce por la activación constitutiva del receptor, que en el MEN2A conduce a una proliferación celular acelerada6. La sensibilidad a la activación de RET es distinta en cada tejido, por lo que el feocromocitoma y el hiperparatiroidismo solo ocurren en determinadas mutaciones, especialmente las del codón 634.
- Los avances de CRISPR-Cas en Endocrino ya han comenzado. Lo primero ha sido generar líneas celulares mediante CRISPR-Cas con las mutaciones del MEN. Fig. 1. Establishment of MEN1 patient specific point mutation in wild type induced pluripotent stem cells with CRISPR/Cas9 and ssODN. A. Schematic of sgRNA targeting. Top: sgRNA targeting site was highlighted in green. PAM was underlined. Bottom: ssODN sequence carried mutation site T is highlighted in red. B. The sequencing analysis result. Top: Wide type sequence carrying SNP, GAC and GAT encode aspartic acid. Bottom: Mutation sequence has heterozygous mutation G > T (indicated with a black arrow).
- Lo segundo una vez creada la línea celular, volver a corregirla mediante CRISPR-Cas9. Integrative analysis of EGR1 transcriptional program in RETC634Y iPSC A: Piechart of the EGR1 ChipSeq peaks in H1 hESC line. B: Venn diagramm of integrative crossing between target promoters of EGR1 in H1 hESC line and upregulated genes list in the RETC634Y iPSC (Odds ratio of enrichment by Fisher exact Test)
- Y los pasos van a ir por aquí y rápido. Paper del mes pasado, han conseguido Conejos crisperizados con la mutación del gen del glucokinase (MODY2) Glucokinase (GCK) is a key enzyme in glucose sensing and glycemic regulation. In humans, mutations in the GCK gene cause maturity-onset diabetes of the young 2 (MODY-2), a disease that is characterized by an early-onset and persistent hyperglycemia. It is known that Gck knockout (KO) is lethal in mice with Gck KO mice dying within 2 weeks after birth. Therefore, Gck KO mice are not suitable for preclinical study and have limited suitability to study the pathophysiological role of glucokinase in vivo. Here, we report the generation of a novel rabbit with a non-frameshift mutation of GCK gene (GCK-NFS) by cytoplasm microinjection of Cas9 mRNA and gRNA. These GCK-NFS rabbits showed typical features of MODY-2 including hyperglycemia and glucose intolerance with similar survival rate and weight compared to wild-type (WT) rabbits. The diabetic phenotype including pancreatic and renal dysfunction was also found in the F1-generation rabbits, indicating that the genetic modification is germline transmissible. Treatment of GCK-NFS rabbit with glimepiride successfully reduced the fasting blood glucose drastically and improved its islet function. In conclusion, this novel GCK mutant rabbit generated with the CRISPR/Cas9 system mimics most, if not all, histopathological and functional defects seen in MODY-2 patients such as hyperglycemia and will be a valuable rabbit model for preclinical studies and drug screening for diabetes as well as for studying the pathophysiological role of glucokinase.
- Se abre un futuro prometedor para por fin CURAR enfermedades hasta ahora impensables.
- The CRISPR/Cas9 system.1 Clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR) refers to sequences in the bacterial genome. They afford protection against invading viruses, when combined with a series of CRISPR-associated (Cas) proteins. Cas9, one of the associated proteins, is an endonuclease that cuts both strands of DNA. Cas9 is directed to its target by a section of RNA. This can be synthesised as a single strand called a synthetic single guide RNA (sgRNA); the section of RNA which binds to the genomic DNA is 18–20 nucleotides. In order to cut, a specific sequence of DNA of between 2 and 5 nucleotides (the exact sequence depends upon the bacteria which produces the Cas9) must lie at the 3’ end of the guide RNA: this is called the protospacer adjacent motif (PAM). Repair after the DNA cut may occur via two pathways: non-homologous end joining, typically leading to a random insertion/deletion of DNA, or homology directed repair where a homologous piece of DNA is used as a repair template. It is the latter which allows precise genome editing: the homologous section of DNA with the required sequence change may be delivered with the Cas9 nuclease and sgRNA, theoretically allowing changes as precise as a single base-pair.
- Además, cada tipo de reparación predomina en un periodo del ciclo celular. Recombinación homóloga Etapa final S y G2 Recombinación NO homóloga Resto interfase Así que la mayoría del tiempo celular solo es posible, de forma natural, la No homóloga. A esto se suma que algunas células humanas apenas o no se reproducen en su forma adulta.