Ponencia presentada en el marco de las I Jornadas Científicas del Instituto de Investigación Sanitaria Aragón (8-9 noviembre, 2010. Zaragoza)

1. Patología del ensamblaje de la
cadena respiratoria mitocondrial:
El Complejo III como centro del sistema
Erika Fernández-Vizarra Bailey
Unidad de Investigación Traslacional I+CS.
HUMS
Zaragoza, 8 de noviembre de 2010

2. Sistema de fosforilación oxidativa
(OXPHOS)
11 13
45 4 1 3
7
16
2
Subunidades estructurales

3. Proteínas codificadas en el DNA
nuclear para la biogénesis del sistema
OXPHOS
Factores de replicación del
mtDNA
Factores de transcripción
del mtDNA
Factores de traducción
mitocondrial + proteínas
del ribosoma mt
Proteínas necesarias para
el importe
Koopman et al. (2010) Antioxid Redox
Factores de ensamblaje Signal 12, 1431-1470

4. Factores de ensamblaje asociados con
enfermedad mitocondrial
SURF1
SDHAF1 COX10
CIA30/NDUFAF1 COX15
B17.2L/NDUFAF2 BCS1L SCO1
C3ORF60/NDUFAF3 SCO2
C60ORF66/NDUFAF4 LRPPRC
C8ORF38 TACO1
C20ORF7
ATP12
ACAD9
TMEM70

5. Estudios del ensamblaje del sistema
OXPHOS en mamíferos
Lo que sabemos es fundamentalmente gracias
al estudio de:
Los procesos en la levadura Saccharomyces
cerevisiae
Los casos patológicos

6. Estudios del ensamblaje del sistema
OXPHOS en mamíferos
Se conoce con bastante detalle el
proceso y los factores implicados en el
ensamblaje del Complejo IV
Se está estudiando activamente el
ensamblaje del Complejo I
No se conoce demasiado del ensamblaje
de los Complejos II, III y V en mamíferos

7. Ubiquinol:citocromo c
oxidorreductasa (Complejo III)
BCS1L
MT-CYB
UQCRB UQCRQ

8. Estudio del ensamblaje del CIII
1. Determinar la incorporación de las
subunidades estructurales
1. Subunidad codificada en el mtDNA (Cytb)
2. Subunidades codificadas en el nDNA
2. Determinar los factores necesarios para
el ensamblaje y su papel en el proceso

9. Subunidad codificada en el mtDNA
Traducción in organello y BNGE: Incubación de
las mitocondrias aisladas en presencia de [35S]-
L-Met and [35S]-L-Cys / electroforesis nativa
CI
[35S]-L-Met CV
[35S]-L-Met [35S]-L-Cys CIII2
[35S]-L-Cys
CIV
[35S]-L-Met [35S]-L-Cys
[35S]-L-Cys

10. Blue Native (BN) Gel Electrophoresis
1ª dimensión nativa 2ª dimensión: desnaturalizante
CI
CV
CIII2
CIV

11. Blue Native (BN) Gel Electrophoresis
1ª dimensión nativa 2ª dimensión: desnaturalizante
CI
CV
CIII2
CIV

12. Blue Native (BN) Gel Electrophoresis
1ª dimensión nativa 2ª dimensión: desnaturalizante
CI
CV
CIII2
Separación
de las
subunidades
CIV individuales

13. Síntesis de proteína in organello.
Experimentos de “pulso-caza”
La única subunidad del CIII codificada en
el mtDNA
Mt-Cyb se sintetiza en las mitocondrias
aisladas de hígado de ratón y se incorpora
rápidamente al CIII dimérico (CIII2) maduro

14. 1D native (DDM)
CV CIII2 CIV CV CIII2 CIV
denaturing
2D
ND5
COI
ND2 Cytb
ND1 COII/
COIII
ATP6
ND3
ATP8
Pulse (45’ label) Chase 45’ Chase 90’
ND5
COI
ND2
ND1 COII/ Cytb
COIII
ATP6
ND3
ATP8
Chase 180’ Chase 270’ Chase 360’

15. Ensamblaje del
CIII en S.
cerevisiae
Cbp3p
Cbp4p Bcs1p
??
Zara et al. (2009)
Biochim. Biophys. Acta
1793, 89-96

16. Proteínas codificadas en el DNA
nuclear
Importe in organello y BNGE: Incubación de las
mitocondrias aisladas con los péptidos
sintetizados in vitro / Electroforesis nativa
CI
CV
* * CIII2
*
*
* * CIV

17. Primera dimensión nativa
1
qc 1
U rc1
U rb
rq
Cy c2
U rh
r1
U rfs
U 1
qc
r
qc
c
qc
qc
qc
qc
•Gradiente del gel: 5%→20%
U
U
CI
CV
CIII2

18. 1D 1D
2D Uqcrc1 2D Uqcrc2
SC CIII2
Primera
dimensión nativa
/ Segunda
dimensión
1D 1D
desnaturalizante
2D Uqcrfs1 2D Uqcrb
SC CIII2
SC CIII2
1D 1D
2D Cyc1 2D Uqcr11
SC CIII2

19. Resumen
Subunidades codificadas en el nDNA:
Todas las subunidades se han sintetizado
“in vitro” excepto Uqcr10 (Qcr9p en S.
cerevisiae)
Todas se importan “in vitro” excepto Uqcrh
(Qcr6p en S. cerevisiae)
Una vez importadas, algunas se incorporan
al CIII2 en estas condiciones:
• Uqcrc2 (algo)
• Uqcrfs1
• Uqcrb
• Uqcr11

20. Próximos pasos
Importe in vivo de las subunidades que no se
han podido importar in vitro
Estudiar factores necesarios para su
importe/ensamblaje que no están en las
mitocondrias aisladas
Determinar composición del complejo(s) en los
que se encuentra BCS1L
Estudiar la incorporación de las subunidades
en casos patológicos
Células de ratón con Cytb mutado
Células humanas con mutaciones en BCS1L
• Si pudiera conseguir células de pacientes con mutaciones
en MT-CYB y UQCRB y UQCRQ...

21. Agradecimientos
Unidad de Investigación Traslacional.
I+CS. Hospital Universitario Miguel Servet.
UATI Proteómica. I+CS.
Universidad de Zaragoza y CNIC (Madrid):
Grupo GENOXPHOS.
Istituto Neurologico “C. Besta”. Milán
(Italia): Dr. Massimo Zeviani.