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Patología del ensamblaje de la
 cadena respiratoria mitocondrial:
El Complejo III como centro del sistema

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Sistema de fosforilación oxidativa
           (OXPHOS)



                   11       13
     45       4         1        3
          7



                                     16
                                          2




  Subunidades estructurales
Proteínas codificadas en el DNA
nuclear para la biogénesis del sistema
               OXPHOS
Factores de replicación del
mtDNA
Factores de transcripción
del mtDNA
Factores de traducción
mitocondrial + proteínas
del ribosoma mt
Proteínas necesarias para
el importe
                              Koopman et al. (2010) Antioxid Redox
Factores de ensamblaje              Signal 12, 1431-1470
Factores de ensamblaje asociados con
      enfermedad mitocondrial

                            SURF1
                SDHAF1      COX10
 CIA30/NDUFAF1              COX15
 B17.2L/NDUFAF2       BCS1L SCO1
 C3ORF60/NDUFAF3            SCO2
 C60ORF66/NDUFAF4           LRPPRC
 C8ORF38                    TACO1
 C20ORF7
                               ATP12
 ACAD9
                               TMEM70
Estudios del ensamblaje del sistema
      OXPHOS en mamíferos
 Lo que sabemos es fundamentalmente gracias
 al estudio de:
   Los procesos en la levadura Saccharomyces
   cerevisiae
   Los casos patológicos
Estudios del ensamblaje del sistema
      OXPHOS en mamíferos
 Se conoce con bastante detalle el
 proceso y los factores implicados en el
 ensamblaje del Complejo IV
 Se está estudiando activamente el
 ensamblaje del Complejo I

 No se conoce demasiado del ensamblaje
 de los Complejos II, III y V en mamíferos
Ubiquinol:citocromo c
oxidorreductasa (Complejo III)
                         BCS1L




                         MT-CYB

                      UQCRB   UQCRQ
Estudio del ensamblaje del CIII

1. Determinar la incorporación de las
   subunidades estructurales
  1. Subunidad codificada en el mtDNA (Cytb)
  2. Subunidades codificadas en el nDNA

2. Determinar los factores necesarios para
   el ensamblaje y su papel en el proceso
Subunidad codificada en el mtDNA
Traducción in organello y BNGE: Incubación de
las mitocondrias aisladas en presencia de [35S]-
L-Met and [35S]-L-Cys / electroforesis nativa
                                              CI
                              [35S]-L-Met     CV
       [35S]-L-Met     [35S]-L-Cys            CIII2
[35S]-L-Cys


                                              CIV

         [35S]-L-Met         [35S]-L-Cys

 [35S]-L-Cys
Blue Native (BN) Gel Electrophoresis

1ª dimensión nativa   2ª dimensión: desnaturalizante



            CI
            CV
           CIII2




           CIV
Blue Native (BN) Gel Electrophoresis

1ª dimensión nativa   2ª dimensión: desnaturalizante


        CI
        CV
        CIII2




        CIV
Blue Native (BN) Gel Electrophoresis

1ª dimensión nativa   2ª dimensión: desnaturalizante


        CI
        CV
        CIII2

                                                  Separación
                                                  de las
                                                  subunidades
        CIV                                       individuales
Síntesis de proteína in organello.
  Experimentos de “pulso-caza”

La única subunidad del CIII codificada en
el mtDNA

  Mt-Cyb se sintetiza en las mitocondrias
  aisladas de hígado de ratón y se incorpora
  rápidamente al CIII dimérico (CIII2) maduro
1D native (DDM)
                                 CV CIII2 CIV          CV CIII2 CIV

denaturing
   2D
                                                                       ND5
                                                                       COI
                                                 ND2                   Cytb
                                                 ND1                  COII/
                                                                      COIII

                                                                      ATP6
                                                ND3

                                                                      ATP8

             Pulse (45’ label)   Chase 45’             Chase 90’


                                                                       ND5
                                                                       COI
                                                 ND2
                                                 ND1                  COII/ Cytb
                                                                      COIII

                                                                      ATP6
                                                ND3

                                                                      ATP8

               Chase 180’        Chase 270’            Chase 360’
Ensamblaje del
                           CIII en S.
                           cerevisiae
     Cbp3p
     Cbp4p       Bcs1p
       ??

  Zara et al. (2009)
Biochim. Biophys. Acta
     1793, 89-96
Proteínas codificadas en el DNA
                 nuclear
Importe in organello y BNGE: Incubación de las
mitocondrias aisladas con los péptidos
sintetizados in vitro / Electroforesis nativa
                                             CI
                                             CV
         *             *                     CIII2
 *
                                *
             *             *                 CIV
Primera dimensión nativa




                                             1
                                        qc 1
                                     U rc1




                                      U rb
                                           rq
                                      Cy c2




                                     U rh
                                          r1
                                      U rfs
                                     U 1



                                        qc
                                         r




                                       qc
                                         c




                                       qc
                                       qc
                                      qc


                                      qc
•Gradiente del gel: 5%→20%




                                      U
                                     U
                              CI
                              CV
                             CIII2
1D                1D
2D Uqcrc1           2D Uqcrc2
                          SC     CIII2
                                             Primera
                                         dimensión nativa
                                            / Segunda
                                            dimensión
     1D                1D
                                         desnaturalizante
2D Uqcrfs1          2D Uqcrb
      SC    CIII2
                         SC     CIII2




     1D                1D
2D   Cyc1           2D Uqcr11


                         SC     CIII2
Resumen
Subunidades codificadas en el nDNA:
  Todas las subunidades se han sintetizado
  “in vitro” excepto Uqcr10 (Qcr9p en S.
  cerevisiae)
  Todas se importan “in vitro” excepto Uqcrh
  (Qcr6p en S. cerevisiae)
  Una vez importadas, algunas se incorporan
  al CIII2 en estas condiciones:
   •   Uqcrc2 (algo)
   •   Uqcrfs1
   •   Uqcrb
   •   Uqcr11
Próximos pasos
Importe in vivo de las subunidades que no se
han podido importar in vitro
  Estudiar factores necesarios para su
  importe/ensamblaje que no están en las
  mitocondrias aisladas
Determinar composición del complejo(s) en los
que se encuentra BCS1L
Estudiar la incorporación de las subunidades
en casos patológicos
  Células de ratón con Cytb mutado
  Células humanas con mutaciones en BCS1L
   • Si pudiera conseguir células de pacientes con mutaciones
     en MT-CYB y UQCRB y UQCRQ...
Agradecimientos

Unidad de Investigación Traslacional.
I+CS. Hospital Universitario Miguel Servet.
UATI Proteómica. I+CS.
Universidad de Zaragoza y CNIC (Madrid):
Grupo GENOXPHOS.
Istituto Neurologico “C. Besta”. Milán
(Italia): Dr. Massimo Zeviani.

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Patología del ensamblaje de la cadena respiratoria mitocondrial: El Complejo III como centro del sistema. Erika Fernández-Vizarra Bailey

  • 1. Patología del ensamblaje de la cadena respiratoria mitocondrial: El Complejo III como centro del sistema Erika Fernández-Vizarra Bailey Unidad de Investigación Traslacional I+CS. HUMS Zaragoza, 8 de noviembre de 2010
  • 2. Sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS) 11 13 45 4 1 3 7 16 2 Subunidades estructurales
  • 3. Proteínas codificadas en el DNA nuclear para la biogénesis del sistema OXPHOS Factores de replicación del mtDNA Factores de transcripción del mtDNA Factores de traducción mitocondrial + proteínas del ribosoma mt Proteínas necesarias para el importe Koopman et al. (2010) Antioxid Redox Factores de ensamblaje Signal 12, 1431-1470
  • 4. Factores de ensamblaje asociados con enfermedad mitocondrial SURF1 SDHAF1 COX10 CIA30/NDUFAF1 COX15 B17.2L/NDUFAF2 BCS1L SCO1 C3ORF60/NDUFAF3 SCO2 C60ORF66/NDUFAF4 LRPPRC C8ORF38 TACO1 C20ORF7 ATP12 ACAD9 TMEM70
  • 5. Estudios del ensamblaje del sistema OXPHOS en mamíferos Lo que sabemos es fundamentalmente gracias al estudio de: Los procesos en la levadura Saccharomyces cerevisiae Los casos patológicos
  • 6. Estudios del ensamblaje del sistema OXPHOS en mamíferos Se conoce con bastante detalle el proceso y los factores implicados en el ensamblaje del Complejo IV Se está estudiando activamente el ensamblaje del Complejo I No se conoce demasiado del ensamblaje de los Complejos II, III y V en mamíferos
  • 7. Ubiquinol:citocromo c oxidorreductasa (Complejo III) BCS1L MT-CYB UQCRB UQCRQ
  • 8. Estudio del ensamblaje del CIII 1. Determinar la incorporación de las subunidades estructurales 1. Subunidad codificada en el mtDNA (Cytb) 2. Subunidades codificadas en el nDNA 2. Determinar los factores necesarios para el ensamblaje y su papel en el proceso
  • 9. Subunidad codificada en el mtDNA Traducción in organello y BNGE: Incubación de las mitocondrias aisladas en presencia de [35S]- L-Met and [35S]-L-Cys / electroforesis nativa CI [35S]-L-Met CV [35S]-L-Met [35S]-L-Cys CIII2 [35S]-L-Cys CIV [35S]-L-Met [35S]-L-Cys [35S]-L-Cys
  • 10. Blue Native (BN) Gel Electrophoresis 1ª dimensión nativa 2ª dimensión: desnaturalizante CI CV CIII2 CIV
  • 11. Blue Native (BN) Gel Electrophoresis 1ª dimensión nativa 2ª dimensión: desnaturalizante CI CV CIII2 CIV
  • 12. Blue Native (BN) Gel Electrophoresis 1ª dimensión nativa 2ª dimensión: desnaturalizante CI CV CIII2 Separación de las subunidades CIV individuales
  • 13. Síntesis de proteína in organello. Experimentos de “pulso-caza” La única subunidad del CIII codificada en el mtDNA Mt-Cyb se sintetiza en las mitocondrias aisladas de hígado de ratón y se incorpora rápidamente al CIII dimérico (CIII2) maduro
  • 14. 1D native (DDM) CV CIII2 CIV CV CIII2 CIV denaturing 2D ND5 COI ND2 Cytb ND1 COII/ COIII ATP6 ND3 ATP8 Pulse (45’ label) Chase 45’ Chase 90’ ND5 COI ND2 ND1 COII/ Cytb COIII ATP6 ND3 ATP8 Chase 180’ Chase 270’ Chase 360’
  • 15. Ensamblaje del CIII en S. cerevisiae Cbp3p Cbp4p Bcs1p ?? Zara et al. (2009) Biochim. Biophys. Acta 1793, 89-96
  • 16. Proteínas codificadas en el DNA nuclear Importe in organello y BNGE: Incubación de las mitocondrias aisladas con los péptidos sintetizados in vitro / Electroforesis nativa CI CV * * CIII2 * * * * CIV
  • 17. Primera dimensión nativa 1 qc 1 U rc1 U rb rq Cy c2 U rh r1 U rfs U 1 qc r qc c qc qc qc qc •Gradiente del gel: 5%→20% U U CI CV CIII2
  • 18. 1D 1D 2D Uqcrc1 2D Uqcrc2 SC CIII2 Primera dimensión nativa / Segunda dimensión 1D 1D desnaturalizante 2D Uqcrfs1 2D Uqcrb SC CIII2 SC CIII2 1D 1D 2D Cyc1 2D Uqcr11 SC CIII2
  • 19. Resumen Subunidades codificadas en el nDNA: Todas las subunidades se han sintetizado “in vitro” excepto Uqcr10 (Qcr9p en S. cerevisiae) Todas se importan “in vitro” excepto Uqcrh (Qcr6p en S. cerevisiae) Una vez importadas, algunas se incorporan al CIII2 en estas condiciones: • Uqcrc2 (algo) • Uqcrfs1 • Uqcrb • Uqcr11
  • 20. Próximos pasos Importe in vivo de las subunidades que no se han podido importar in vitro Estudiar factores necesarios para su importe/ensamblaje que no están en las mitocondrias aisladas Determinar composición del complejo(s) en los que se encuentra BCS1L Estudiar la incorporación de las subunidades en casos patológicos Células de ratón con Cytb mutado Células humanas con mutaciones en BCS1L • Si pudiera conseguir células de pacientes con mutaciones en MT-CYB y UQCRB y UQCRQ...
  • 21. Agradecimientos Unidad de Investigación Traslacional. I+CS. Hospital Universitario Miguel Servet. UATI Proteómica. I+CS. Universidad de Zaragoza y CNIC (Madrid): Grupo GENOXPHOS. Istituto Neurologico “C. Besta”. Milán (Italia): Dr. Massimo Zeviani.