Este documento describe experimentos para demostrar la curación y segregación de plásmidos en Escherichia coli. Los objetivos son demostrar la pérdida espontánea y inducida de plásmidos, comparar el comportamiento de un plásmido grande unicopia frente a uno pequeño multicopia, y comparar el efecto curante del ácido ascórbico y el anaranjado de acridina. Se utilizan dos cepas de E. coli portadoras de plásmidos y medios permisibles e impersibles para medir la curación.

1. CURACIÓN Y SEGREGACIÓN DE
PLASMIDOS EN Escherichia coli

2. Plásmido
Elemento génico extracromosomal con DNA bicatenario, circular
covalentemente cerrado que se replica de forma autónoma al
cromosoma.

3. Características
1. Capacidad de integrarse al cromosoma.
2. Su replicación puede ser con la del cromosoma.
3. Portan información génica que muchas veces confiere ventajas
adaptativas y sin embargo son dispensables.

4. CLASIFICACIÓN
• Plásmidos
Tamaño
Número de copias
 Fenotipo que le proporciona a la
célula huésped
Incompatibilidad

5. Tamaño
Plásmidos pequeños (2-20kb)
Plásmidos grandes (hasta 100kb)
Mega plásmidos (hasta 1600kb)

6. TRANSFERENCIA
• Conjugativos
• No conjugativos
Movilizable (tra +, mob +)
Autotransferible (tra +, mob -)
No movilizable (tra-, mob-)

7. Número de copias
Unicopia (Control estricto) Multicopia (Control relajado)

8. Función fenotípica
 Plásmido F (Fertilidad)
 Plásmidos R (Resistencia a antibióticos)
 Plásmidos Bac (Síntesis de bacteriocinas)
 Plásmidos Tol (Degradación)

9. PARTICIÓN

10. Incompatibilidad
Debido al sistema
de partición
Debido al sistema
de control de la
replicación

11. Después de la división, ambos plásmidos se
replican para llegar a su número de copias.
Curación de las células de uno de los
dos plásmidos cuando son miembros
del mismo grupo Inc.

12. Segregación del Plásmido
• Pérdida espontánea del DNA plasmídico.
• Resultado de la interferencia durante el
proceso de replicación del plásmido sin
producir una interferencia paralela de la
replicación cromosómica.

13. CURACIÓN
Pérdida del plásmido

14. Agentes curantes
• Derivados de fenotiazinas
• Derivados de clorpromazinas
• Colorantes : Anaranjado de acridina , Bromuro de
etidio (Inhiben la replicación)
• Acido ascórbico y SDS ( inhiben la partición)
https://www.researchgate.net/publication/6943925_The_Mechanism_of_Plasmid_Curing_in_
Bacteria

15. Anaranjado de acridina
.
Ácido ascórbico.
Actúa sobre la partición de los plásmidos.
Produce lipoperoxidación y deformación
de la membrana.
Falla la replicación
http://sisbib.unmsm.edu.pe/bvrevistas/folia/vol10_n4/antioxidantes.htm

16. INHIBICIÓN DE LA REPLICACIÓN POR LA
MOLÉCULA DE ACRIDINA

17. CMI10,000 µg/ mL de antibiótico 4 mL C/U
500µL 500µL 500µL 500µL 500µL
1:9 1:9 1:9 1:9 1:9
1:9 1:81 1:729 1:6561 1:59049
10000
729
= 13.71µg/ mL

18. Demostración de la presencia de los factores R de
Bordetella bronchiseptica aislada en cerdos.
Nobuyuki Terakado, Hayami Azechi, Kiyoji Ninomiya y Takeshi Shinmizu
Laboratorio nacional de esayos veterinarios, Kokobunji, Tokio, Japón y el
instituto nacional de salud animal, Kodaria, Tokio, Japón.
Recibido para su publicación 9 de febrero de 1973

19. OBJETIVO CENTRAL
• Evidenciar la existencia de los factores R en cepas de
Bordetella bronchiseptica aislada a partir de cerdos.
• Demostrar que la triple resistencia se puede encontrar en
un solo factor transferible y que se pueda eliminar por
curación.

20. Bordetella bronchiseptica
• Habitante frecuente de
vías respiratorias
• Causa bronquitis
infecciosa
• Bacilo corto (G -)
• Aislado*
• No forma cápsula ni
esporas
• 37 +/- 2°C
• Medios enriquecidos
INTRODUCCIÓN

21.  Prueba de sensibilidad a los fármacos.
 Transferencia de resistencia de los
fármacos.
 Tratamiento con acriflavina.
Bordetella bronchiseptica
Escherichia coli
ML1410

22. MATERIALES Y MÉTODOS.
7 cepas de B. bronchiseptica como donantes de resistencia a los
medicamentos
• B. bronchiseptica ATCC 4617como control
• B bronchiseptica 114 mutante nal+, receptora
Escherichia coli K-12
 Ml1410 F-, met- (requiere metionina), nal+ (resistente al acido
nalidíxico)
 Ml1410-RFP F-, Met- nal+, RFP+ (resistente a rifampicina)
 W3630 f-, mal- (No fermentadores de maltosa)
CEPAS

23. • Caldo Penassay
• Agar infusión de corazón
• Medio de Muller-Hinton
• Agar DHL (Medio sólido)
• Agar nutritivo (10 g de peptona, 5g NaCl, 15 g de lactosa, 40 mL
de azul de bromotimol 0.2% y 13 g de agar.
• Agar AL – medio sólido(Azul de bromotimol, 13 g de agar, 20 g
de lactosa en 1000 ml de medio A )
MEDIOS

24. FÁRMACOS
• Sulfadimetóxina (SA)
• Estreptomicina (SM)
• Aminobencil penicilina
(APC)
• Rifampicina (RFP)
• Tetraciclina (TC)
• Cloranfenicol (CP)
• Kanamicina (KM)
• Gentamicina (GM)

25. METODOLOGÍA

26. PRUEBA DE SENSIBILIDAD
A LOS FÁRMACOS.
• Objetivo: Determinar la sensibilidad de los fármacos
mediante la concentración mínima inhibitoria de cada
una de las cepas aisladas.

27. • La placa contiene diluciones
seriadas de cada fármaco
10-1 10-2
37°C
18 horas

28. RESULTADOS
TABLA 1. SENSIBILIDAD A LOS FÁRMACOS DE LAS CEPAS
UTILIZADAS.
Sulfadimetóxina (SA), Estreptomicina (SM), Aminobencil penicilina (APC), Rifampicina (RFP),
Tetraciclina (TC), Cloranfenicol (CP), Kanamicina (KM), Gentamicina (GM)
Ml1410 F-, met-, nal+
Ml1410-RFP F-, Met- nal+, RFP+
W3630 F-, mal-

29. La trasferencia de resistencia a los
medicamentos.
Objetivo: Analizar la transferencia
conjugacional de la triple resistencia entre
géneros y especies.

30. 5 mL de cultivo
Bordetella bronchiseptica (7 cepas)
Cepas receptoras*
37°C s/ agitación
1 hora
24 y 48
Horas

31. 10 colonias
Escherichia coli
W3630
(Resistente)
Escherichia coli
ML1410
(Resistente)
Agar AL met-
12.5 µg SM
Agar DHL
RFP y SM

32. RESULTADOS
TABLA 2. Transferencia de resistencia a los medicamentos de Bordetella
bronchiseptica a Escherichia coli ML1410 por cultivo mixto.
TABLA 3. Transferencia de resistencia a los medicamentos de Bordetella
bronchiseptica a B. bronchiseptica 114 por cultivo mixto.

33. Para asegurar la transferencia
de la resistencia…
Preparación de cultivos filtrados .
La dosis con una
lámpara UV fue la que
le dio 0.1% de
sobrevivencia

34. TRATAMIENTO CON ACRIFLAVINA
Clorhidrato de acriflavina

35. RESULTADOS
TABLA 4. Eliminación de la resistencia a los medicamentos mediante el tratamiento
con acriflavina.
• La luz ultravioleta ayuda a escindir el plásmido del
cromosoma
• ML1416 misma cepa

36. CURACIÓN Y SEGREGACIÓN DE
PLASMIDOS EN Escherichia coli

37. OBJETIVOS:
• Demostrar la perdida espontanea de DNA plasmidico en la cepa de E.coli
• Demostrar la perdida inducida de plásmidos en las cepas de E.coli
• Comparar el comportamiento de un plásmido grande unicopia con el de un
plásmido pequeño multicopia en relación a su curación.
• Comparar el efecto curante de dos agentes químicos de diferente naturaleza.

38. MEDIOS Y CEPAS
• Agar Luria (permisible)
• Caldo Luria
• Agar Luria con ampicilina (L-Ap) (no permisible)
• Medio mínimo (MM) (no permisible)
• Medio mínimo con histidina (MMH) (permisible)
 Escherichia coli JC4046( F+ His+ / His -) (plásmido
unicopia) megaplásmido
 Escherichia coli DH5αpBS (Amp R / Amp S) (plásmido
multicopia) pequeño

39. DESARROLLO
EXPERIMENTAL

40. 1º día
Escherichia coli
DH5α
8 mL caldo L
Escherichia coli
JC4046
8 mL caldo L
37 ºC
18-24 h
Tratamiento con ácido
ascórbico

41. 2º día
1.5 mL
Completar caldo L
a 3 mL
P 0.3 mL ácido
ascórbico
0.2M
T 0.3 mL agua
estéril
37 ºC
90 min con agitación
10’-5
10’-6
x2 agar L
37 ºC
18 a 24 h
0.1 mL

42. 3º día
Calcula %
sobrevivencia
500 problema
300 testigo
37 ºC
18 a 24 h
4º día
MM Y
MMH –
JC4046
L Y L-Ap
DH5α
37ºC
MM Y MMH 48
h
L Y L-Ap 18-24
h
5º día
% curación y
segregación

43. 1º día
Escherichia coli
DH5α
8 mL caldo L
Escherichia coli
JC4046
8 mL caldo L
37 ºC
18-24 h
Tratamiento con anaranjado
de acridina

44. 2º día
0.1 mL
3 mL caldo L
pH 7.8
T 150 µL
etanol al 10%
P 150 µL
anaranjado de
acridina
1mg/mL 37 ºC
18 – 24 h
Agar L
37 ºC
18 h
3º día
T 10’-4 10’-5
P 10’-4 10’-5
0.1 mL

45. 4º día
500 problema
300 testigo
37 ºC
18 a 24 h
5º día
MM Y
MMH –
JC4046
L Y L-Ap
DH5α
37ºC
MM Y MMH 48
h
L Y L-Ap 18-24
h
6º día
% curación y
segregación

46. Bibliografía
Freibelder David “Microbial Genetics” Editorial Jones and Bartlett publishers,INC Portola Valley.PP 147-
280 Universitu of California, San diego
https://books.google.com.mx/books?id=CS1pyvGEwKoC&pg=PA24&dq=clasificaci%C3%B3n+de+un+plasm
ido&hl=es&sa=X&redir_esc=y#v=onepage&q=clasificaci%C3%B3n%20de%20un%20plasmido&f=false
https://books.google.com.mx/books?id=CPYe5mzw-
igC&pg=PA294&dq=definicion+de+un+plasmido&hl=es&sa=X&redir_esc=y#v=onepage&q=definicion%20d
e%20un%20plasmido&f=false
https://books.google.com.mx/books?id=Nlego0fDRUQC&pg=PA43&dq=clasificaci%C3%B3n+de+un+plasmi
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